Příprava vektoru
izolace plasmidu - alkalická lyže, kolonková izolace dna
E. coli
chromosomální DNA
plasmidová
DNA proteiny +
->
lyže buňky snížení pH
proteiny +
^ vysrážená
chromosomální DNA
pH 12< (denaturace)
(renaturace)
? membrána
supernatant bakteriálního lyzátu
vazba DNA
promývani
o
5
centrifugace
plasmidová DNA
chromosomální DNA + buněčné zbytky
eluce DNA       čistá plasmidová DNA
reštrikční štepení
gelova elektroforeza
reštrikční místo
0£J
štěpení DNA restrikčním enzymem
neštěpený štěpený vzorek vzorek
OC
CCC
© ÚMBFB FaFVFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Příprava inzertu
IZOLACE ROSTLINNÉ DNA
PCR - amplifikace DNA
lyže
homogenizace
kolonková izolace DNA
4r
primer F
DNA lokus
I
primer R
/
Taq polymeráza
dsDNA \
denaturace 92-96 °C
annealing 45-72 °C
Ľ3
extenze 72 °C yi
i
eHH
DNA lokus
PCR produkt (dsDNA)
primer R
© ÚMBFB FaFVFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
TA klonování a transformace bakterií
LIGACE - TA klonování
TRANSFORMACE TEPELNÝM ŠOKEM
fragment DNA
E. coli
CaCI2 + teplotní šok 4 °C/5 min. -* 42 °C/30 s -* 4 °C/2 min.
transport plasmidu do hostitelské buňky
neúspěšná transformace    transformace plasmidu s inzertem       transformace plasmidu bez inzertu
selekce buněk: růst v přítomnosti antibiotika
detekce inzertu na základě modro-bílého testu
© ÚMBFB FaFVFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Modro-bílý test
(A) Vektor bez vloženého inzertu -►
klonovací místo ^(MCS = multiple cloning site)
promotor^^        operátor        |     lacZ        další geny
RNA-polymeráza represor
mRNA
ß-galaktosidaza
IPTG
X-Gal
kultivace na LB médiu s ampicilinem, X-gal, IPTG
(B) Vektor s vloženým inzertem ->
klonovací místo narušení exprese ß-galaktosidazy
promotor
12
RNA-polymeráza
^      I operátor represor
lacZ
další geny
Čt
vložený inzert
mRNA
IPTG
buňky s plasmidem bez inzertu
buňky s plasmidem s inzertem
inzert, který nenarušuje čtecí rámec
© ÚMBFB FaFVFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Imunodetekce proteinů
© ÚMBFB FaFVFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94
Příprava rekombinantního
proteinu
příprava vektoru
E. coli
reštrikční onukleáza
selekční znak
r
ligace
cDNA
transformace
E. coli
regenerace, selekce transformantů
OO
O
príprava inzertu
lyže
homogenizace
	u %
	u 1 1 /
kolonková izolace RNA
izolovaná RNA
cDNA
reverzně transkripční PCR
izolace proteinů
detekce proteinů
© ÚMBFB FaFVFU Brno, projekt IVA 2015FaF/3160/94