1
Předmět: Biofarmaceutika Kurz: Bioléčiva – biofarmaceutika
4. rok studia
Trocha genové terapie: Antisense
oligonukleotidy
doc. PharmDr. Oldřich Farsa, Ph.D.
2
Antisense RNA
(„antisense“ = „proti smyslu“ ve významu „technickém“, tj.
doplňkový, komplementární)
• Expresní (=exprese schopný) vektor (nosič)
produkuje transkript, jenž je
komplementární ke známému – cílovému
transkriptu
• Expresní vektor je zaveden do hostitelské
buňky transfekcí a blokuje translaci cílové
mRNA
3
Antisense RNA
4
Terapeutická Antisense RNA
• Insulin-like growth factor 1= inzulinu
podobný růstový faktor 1
• vyskytuje se v maligním gliomu (častý typ
nádoru mozku) stejně jako v karcinomu prostaty
• Byla provedena transfekce buněk nádoru
prostaty potkanů antisense cDNA
(jednořetězcovou komplementární DNA)
• Transfektované bb. byly vstříknuty myším
• u takto „ošetřených“ myší se nádory neobjevily,
nebo byly podstatně menší ve srovnání s
kontrolní skupinou, které byly injikovány
neupravené potkaní nádorové buňky
5
Proč vlastně antisense oligonukleotidy?
• Velká antisense RNA podléhá poměrně
rychlé degradaci
• Humánní buňky mají specifické nukleasy pro
likvidaci dvojřetězcové RNA („double stranded“
= dsRNA)
• DNA oligonukleotidy jsou podstatně stálejší
a snáze se dostávají do cílových buněk
• Připravují se orientované na (tj.
komlementární vůči) 5' nebo 3' koncům
molekul mRNA nebo rozhraním intronexon,
přirozeným dvojřetězcovým oblastem
6
Antisense oligonukleotidy - „mechanismus účinku“
7
Antisense oligonukleotidy - „mechanismus účinku“
8
Jak se pomocí antisense oligonukleotidů mohou tvořit trojité řetězce?
9
Jak se pomocí antisense oligonukleotidů mohou tvořit trojité řetězce?
10
Strukturní optimalizace antisense oligonukleotidů
• „Přirozené“ oligonukleotidy (A)
jsou citlivé k buněčným
nukleasám
• Strukturní obměny zvyšují
rezistenci vůči těmto enzymům
• Izosterní záměna jednoho z
atomů kyslíku ve fosfodiesterové
vazbě za síru vede k podstatně
stabilnějším látkám (B fosforthioátové
analogy)
• Morfolinové analogy (D) –
izosterní záměna „ribosy za
morfolin“. Neionogenní, neměly
by se nespecificky vázat na
kladně nabité proteiny.
• 2'-substituce (např. methylace –
E) podstatně zvyšuje stabilitu
vůči nukleasám; tyto analogy
neaktivují RNasu H, ale inhibují
transkripci sterickou blokádou
O
O
O
báze
PO OH
O báze
3'
5'
O
O
O
báze
PO SH
O báze
3'
5'
A B
O
O
NH
báze
PO OH
O báze
3'
5'
C D
O
báze
O CH3
E
N
N
NH2
O
CH2
F
O
báze
NPN O
OCH3
CH3
O báze
N
11
Thiofosfátové (fosforthioátové) antisense
oligonukleotidy
• Rozpustné ve vodě (zejména jako polysodné soli)
• Komplex s cílovou mRNA aktivuje RNasu H
RNasa H: EC 3.1.26.4 je nespecifická endonukleasa – ribonukleasa, která
normálně hydrolyticky štěpí vazbu 3'-O-P vazbu RNA v DNA/RNA komplexu
(duplexu) za vzniku produktů zakončených 3'-OH a 5'-O(PO2
)OH
• První generace oligonukleotidových léčiv prošla klinickým
zkoušením, částečně (byla nebo zůstala) v praxi
• např. fomivirsen proti cytomegalovirové infekci oční sítnice
pacientů s AIDS
• Snížená schopnost vazby na mRNA, zvýšená nespecifická vazba
na proteiny ve srovnání s nativními oligonukleotidy (polyanionty –
váží se na tytéž proteiny jako jiné polyanionty, např. hepariny)
12
• β-thalasémie: Mutace v
řetězcích -globinu hemoglobinu
vedou ke snížené schopnosti
vázat O2
(amémie)
• Vazba oligonukleotidů 5'GCUAUUACCUUAACCCAG
a
3'-CAUUAUUGCCCUGAAAG
cílených na poškozené 5'-místo
sestřihu a „kryptické“ 3'-místo
sestřihu brání nesprávnému
splicingu
Příklad použití nemodifikovaných antisense oligonukleotidů:
oprava vadného splicingu - „sestřihu“ řetězců mRNA po
transkripci
13
-thalasémie: „kryptická“ porucha splicingu a její odstranění antisense oligonukleotidem
14
Příklady použití modifikovaných antisense oligonukleotidů:
Inhibitory intercelulární adhesní molekuly (ICAM)
Ulcerativní kolitida = chronické relapsující zánětlivé onemocnění mukosní vrstvy střeva (patří mezi
IBD)
•idiopatická = ethiologie neznámá
•převládá přesvědčení, že patogeneze je multifaktoriální a zahrnuje genetické, environmentální a
imunologické faktory
•chronický zánět se projevuje zejména díky dysregulaci adaptivního imunitního systému, která vede
ke změně tolerance ke střevním bakteriím a k anomální odpovědi na normální luminální mikroflóru
 imunologická nerovnováha   produkce zánětlivých cytokinů a adhesních molekul
(např. ICAM),  aktivace polymorfonukleárních monocytů (PMN); jejich migrace do střeva a
interakce s epitelem ovlivňuje funkci epitelu od bariérové až po hospodaření s elektrolyty
15
Mechanismus vzniku ulcerativní kolitidy, biomolekuly v něm zapojené a místa účinku (terapeutické cíle) vybraných bioléčiv
ICAM-1 intercelulární adhesní molecula 1 EGF epidermální růstový faktor
MadCAM mukózní adresná adhezní molekula PMN – polymorfonukleární monocyt
IFN interferon
IL interleukin
16
O
O
O
O
O
O
O
O
OH
O
O
O
OH
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
N
N
O
NH2
O
O
N
N
H
N
N
O
O
NH2
N
N
H
O
O
O
O
CH3
P
O
S
-
N
N
N
N
NH2
O
P
O
S
-
P
O
S
P
O
S
-
P
O
S
-
P
O
S
-
P
O
S
-
N
N
O
NH2
O
O
N
N
O
NH2
O
O
P
O
S
-
N
N
H
N
N
O
O
NH2
P
O
S
-
P
O
S
-
P
O
S
-
N
N
O
NH2
O
O
N
N
N
N
NH2
O
P
O
S
-
N
N
H
O
O
O
O
CH3
P
O
S
-
P
O
S
-
P
O
S
-
P
O
S
-
P
O
S
-
N
N
N
N
NH2
O
N
N O
NH2
O
O
N
N
O
NH2
O
O
N
N
H
N
N
O
O
NH2
N
N
H
N
N
O
O
NH2
N
N O
NH2
O
O
N
N
H
N
N
O
O
NH2
N
N
H
O
O
O
O
CH3
N
N
N
N
NH2
O
N
N O
NH2
O
O
P
O
S
-
P
O
S
-
O
Alicaforsen
syn. ISIS 2302
•oligodeoxyribonukleotid modikovaný kys.
thiofosforečnou (jako fosforothioát)
•20 bází
•váže se (hybridizuje) na sekvenci translaci
nepodléhající 3'-oblasti
lidské ICAM-1 mRNA  aktivace nukleasy
RNasy-H  rozštěpení heterodimeru  útlum
syntézy ICAM
•III. fáze klinického zkoušení na ulcerativní kolitidu a Crohna
ukončena, výsledky nezveřejněny
17
Příklady použití modifikovaných antisense oligonukleotidů: antivirotika
afovirsen, syn. ISIS 8741 – volná „kyselina“; ISIS 2105 – nonadekasodná sůl
•Sekvence: ttgcttccat cttcctcgtc
•Modifikace: zbytky kys. fosforečné nahrazeny zbytky kys. thiofosforečné
•Použití: léčba infekce lidským papilomavirem (HPV; projevy infekce: bradavice ženských
genitálií – nádor děložního hrdla)
•M.Ú.: vazba na virovou mRNA
Efekt ISIS 2105 a ISIS 3925 na
replikaci DNA HPV. 24 po infekci
pomocí elektroporace byly buňky
linie SCC-4 „léčeny“ vzrůstajícími
dávkami buď ISIS 2105 nebo
ISIS 3925. Buňky byly „sklizeny“
24 hod po elektroporaci a
analyzovány na obsah HPV DNA.
Data jsou vynesena jako %
„neléčeného“ kontrolního pokusu;
průměr 3 stanovení.
18
Příklady použití modifikovaných antisense oligonukleotidů: antivirotika
fomivirsen
•21 deoxyribonukleotidů, fosforthioát
•dokosasodná sůl
•sekvence 5'-G-C-G-T-T-T-G-C-T-C-T-T-C-T-T-C-T-T-G-C-G-3'
•inhibitor replikace cytomegaloviru: komplementární k RNA oblasti IE2 („immediate
early region 2“) HCMV, inhibuje tvorbu IE2 proteinu a tím replikaci viru
•léčba CMV retinitidy u pacientů s AIDS
•Vitravene intravitreální injekce (reg. v USA cca 1998 - 2001)
19
Příklady použití modifikovaných antisense oligonukleotidů: antivirotika
miravirsen, SPC3649
•RNA, (P-thio)((2'-O,4'-C-methylen)m5C-dC-(2'-O,4'-C-methylen)A-dT-dT-(2'-O,4'-C-
methylen)G-(2'-O,4'-C-methylen)m5U-dC-dA-(2'-O,4'-C-methylen)m5C-dA-(2'-O,4'-Cmethylen)m5C-dT-(2'-O,4'-C-methylen)m5C-(2'-O,4'-C-methylen)m5C),
sodná sůl (1:14)
•16 bazí, fosforthioátové skupiny, 8 methylenových můstků mezi atomy 2'-O a 4'-C ribosy
N
N
O
NH2
O O
O OH
N
N
O
NH2
O
O P
OH
S
OO
N
N
N
N
NH2
O
O P
OH
S
O
N
NH
O
O
CH3
O P
OH
S
O
O
N
NH
O
O
CH3
O
O
O P
OH
S
O
NNH2
N
N
NH
O
O
OP
S
O
O
N
NH
O
O
CH3
O
OP
OH
S
O
N
OOP
OH
S
O
N
O
NH2
O
O
OP
OH
S N
N
N
N
NH2
N
N
N
N
NH2
O
O
O P
O
S
O
N
N
O
NH2
O
O P
OH
S
O
N
NH
O
O
CH3
O
O P
OH
S
O
N
N
O
NH2
O
O
O P
OH
S
O
O P
OH
SN
N
O
NH2
O
OHO
O
N
N
O
NH2
O
OP
OH
OH
OH
S
20
•mikroRNA jsou krátké (21-23 nukleotidů) nekódující regulační RNA, jež ovlivňují expresi genů
na posttranskripční úrovni
• mikroRNA-122 (miR-122) je významná regulační RNA v játrech, která „jemně ladí“ expresi více
než 100 buněčných genů a usnadňuje replikaci viru hepatitidy C (HCV) prostřednictvím
interakce se dvěma sousedícími místy „po proudu“ kmenové smyčky I (SLI) v oblasti 5´-koncové
translaci nepodléhající oblasti (5′ UTR) virové RNA
•„zamčenou nukleovovou kyselinou“ vyvolaná inhibice regulační funkce miR-122 poltačila infekci
HCV genotypy 1a a 1b in vivo
•klinické zkoušky 2. fáze proti HCV infekci samostaně nebo v kombinaci s telaprevirem nebo
ribavirinem probíhají
21
Příklady použití modifikovaných antisense oligonukleotidů: antivirotika
Morfolinové oligonukleotiy
radavirsen, AVI-7100
•fosfordiamidátový morfolinový antisense oligomer s kladným nábojem na vybraných
podjedontkách; 20 bazí; krátký PEG řetězec na substituentu na 5´-konci
22
•vyvinut pro léčbu sezónní i pandemické chřipky typu A
•specificky zasahuje sekvence virové mRNA
•zatím klin. studie 1. fáze: stanovení bezpečnosti, tolerability a farmakokinetiky při
zvyšujících se jednotlivých dávkách AVI-7100 u zdravých dobrovolníků (od r. 2012).
23
Příklady použití modifikovaných antisense oligonukleotidů: antineoplastika
Inhibitory proteinkinasy C
•proteikinasy C: serino-threoninové kinasy zapojené do procesu transdukce signálu buněk
(fosforylace signálních molekul); změněná exprese souvisí s kancerogenezí
aprinokarsen, syn. ISIS 3521, LY900003, CGP 64128A
Affinitak
•deoxyribonukleotid, 20 bází, fosforthioát
•A-C-T-T-T-G-A-G-T-G-G-T-C-G-C-T-C-T-T-G
•2. fáze klinického zkoušení proti nádoru plic nevycházejícím z malých buněk a melanomu
(neoperabilním nebo metastazujícím), samostatně nebo s karboplatinou, gemcitabinem
nebo paklitaxelem; též na dříve již léčený nádor prsu ukončena
•3. fáze proti nádoru plic: přidání aprinokarsenu ke gemcitabinu nebo karboplatině
neprodloužilo přežívání pacientů ani nezvýšilo jinak hodnocenou účinnost léčby
24
Příklady použití modifikovaných antisense oligonukleotidů: antineoplastika
Antagonista onkogenu Bcl-2
•Bcl-2: antiapoptický protein; jeho převaha nad strukturně příbuzným proapoptickým Bax
představuje u nádorů špatnou odpověď na obvyklé protinádorové terapie a špatnou prognózu
oblimersen, G3139, augmerosen, Genasense
•deoxyribonukleotid, 18 nukleotidů, fosforthioát, heptadekasodná sůl
•T-C-T-C-C-C-A-G-C-G-T-G-C-G-C-C-A-T
•komplementární k prvním šesti kodónům humánní Bcl-2 mRNA
•podání i.v. infúzí
•v 1. - 3. fázi klinického zkoušení proti různým typům nádorů; účinný; rel. nízká toxicita
25
Příklady použití modifikovaných antisense oligonukleotidů: antineoplastika
Inhibitor produkce transformačního růstového faktoru 2
(Transforming Growth Factor 2 ;
TGF
2
)
•TGF : multifunkční polypeptidový cytokin s významnou rolí mj. v proliferaci, morfogenezi,
migraci; klíčový regulátor imunitního systému
•v savčích buňkách 3 izoformy: TGF 1
, TGF 2
, TGF 3
; během embryogeneze exprimovány
všechny 3, v normálních dospělých buňkách výrazně převládá TGF 1
•tumorové buňky významným producentem TGF ; ten se váže na TGF -receptory  signal.
kaskáda prostřednictvím cytoplazmatických signálních mediátorů tzv. Smads vedoucí do jádra
 Smads komplex reguluje expresi cílového genu
•TGF 2
: významný protumorový efekt; reguluje klíčové mechanismy vývoje nádorů:
imunosupresi, metastazování, angiogenezi, proliferaci
26
trabedersen, AP-12009 (Antisense Pharma GmBH)
•oligodeoxyribonukleotid, fosforthioát, 18 nukleotidů
•sekvence C-G-G-C-A-T-G-T-C-T-A-T-T-T-T-G-T-A
•vyvinut k léčbě maligního gliomu, pankreatického karcinomu, maligního melanomu a jiných
tumorů s nadměrnou expresí TGF-2
•2. fáze klinického zkoušení na rekurentní gliom, podání intratumorální vysokoprůtokovou
perfúzí; 3. fáze na anaplastický astrocytom, intratumorální infúze
m
27
Příklady použití modifikovaných antisense oligonukleotidů: léčiva Duchenneho dystrofie
•Duchenneho muskulární dystrofie: postihuje 1 z 3500 novorozených chlapců, vede k
progresivnímu oslabení svalů, kardiomyopatii a respiračnímu selhání
•příčina: mutacemi narušený otevřený čtecí rámec a plná translace DMD genu, kódujícího
peptid dystrofin
•oligonukleotidy cílené na patologické splicingové elementy („splice switching
oligonucleotides“) v DMD pre-mRNA mohou vést k přeskočení exonu, k obnově
otevřeného čtecího rámce a produkci funkčního, byť zkráceného řetězce dystrofinu a
zmírnění projevů nemoci
eteplirsen, AVI-4658 (AVI BioPharma, Portland, OR, USA)
•morfolinový oligonukleotid cílený na 51. exon
•sekvenceCTCCAACATCAAGGAAGATGGCATTTCTAG
•klinická studie s lokálně i.m. aplikovaným AVI-4658 na 7 pacientech prokázala účinnost
histologicky, histochemicky i klinicky
28
N
N
N
NH
O
NH2
O NH
O
N
N
N
N
NH2
O N
P
N O
CH3CH3
O
N
NH
O
O
CH3
N
P
N O
CH3CH3
O
O
N
N
O
NH2
N
P
N O
CH3CH3
O
O
N
NH
O
O
CH3
N
P
N O
CH3CH3
O
O
O O
N
NH
O
O
CH3
N
P
NO
CH3 CH3
O
O
N
NH
O
O
CH3
N
P
NO
CH3 CH3
O
N
N
N
N
NH2
ON
P
NO
CH3 CH3
O
N
N
O
NH2
N
P
NO
CH3 CH3
O
O
N
N
N
NH
O
NH2
ON
P
NO
CH3 CH3
O
N
N
N
NH
O
NH2
ON
P
NO
CH3 CH3
O
O
N
N
N
N
NH2
O N
P
N O
CH3CH3
O
N
N
N
NH
O
NH2
O N
P
N O
CH3CH3
O
N
N
N
N
NH2
O N
P
N O
CH3CH3
O
N
N
N
N
NH2
O N
P
N O
CH3CH3
O
N
N
N
NH
O
NH2
O N
P
N O
CH3CH3
O
N
N
N
NH
O
NH2
O N
P
N O
CH3CH3
O
N
N
N
N
NH2
O N
P
N O
CH3CH3
O
O
N
N
N
N
NH2
ON
P
NO
CH3 CH3
O
N
N
O
NH2
N
P
NO
CH3 CH3
O
O
N
NH
O
O
CH3
N
P
NO
CH3 CH3
O
O
N
N
N
N
NH2
ON
P
NO
CH3 CH3
O
N
N
O
NH2
N
P
NO
CH3 CH3
O
O
N
N
N
N
NH2
ON
P
NO
CH3 CH3
O
O
N
N
O
NH2
N
P
N O
CH3CH3
O
O
N
N
O
NH2
N
P
N O
CH3CH3
O
O
N
NH
O
O
CH3
N
P
N O
CH3CH3
O
O
N
N
O
NH2
N
P
N O
CH3CH3
ON
N
O
O
OH
O
O
P
N
O
O
CH3CH3
ON
P
NO
CH3 CH3
O
O
N
NH
O
O
CH3
N
P
NO
CH3 CH3
O
N
N
N
N
NH2
29
30
Transport nukleotidů na místo účinku
• Lipozóm v kombinaci s
proteiny, specificky se
vážícími na daný typ
buňky, má zajistit cílené a
účinné dopravení nízkých
koncentrací
terapeutických nukleotidů
na místo účinku.