Předmět: Biofarmaceutika Kurz: Bioléčiva – biofarmaceutika
4. rok studia
Enzymy jako léčiva
doc. PharmDr. Oldřich Farsa, Ph.D.
Hydrolasy
Petidasy
Fibrinolytika
Aktivátory plasminogenogenu
●katalyzují štěpení endogenního plasminogenu za vzniku plasminu, nespecifické
proteinasy, která degraduje fibrinovou hmotu trombu
aktivace t-PA
Alteplasa
●fibrinolytikum – tkáňový aktivátor plasminogenu (syn. tPA)
●serinová proteasa tvořená buňkami endotelu jako jedno- nebo dvořetězcová molekula
●váže se na fibrinová vlákna prostřednictvím vazebných míst na Lys a navázaná aktivuje
plasminogen k rozpouštění fibrinu několiksetkrát rychleji, než volná v krevním řečišti
●572 AK
●glykoprotein
●Mr
: 59 050 bez sacharidů vázaných na
Asn 117, 184 a 448, s cukry asi 65 000
●štěpena plasminem mezi AK 275 a 276
na řetězce A a B, jež zůstávají spojeny
-S-S- můstkem mezi Cys 264 a Cys 395
●jedno- i dvoužetězcová forma mají
srovnatelnou fibrinolytickou aktivitu in
vitro
●Alteplasum ad iniectabile ČL 2009 musí
obsahovat min. 60 % dvojřetězcové
formy
●pI = 7 – 8
●příprava/výroba: původně izolována z
buněčné kultury lidského melanomu,
vyráběna biotechnologicky na
rekombinantních buňkách; enzym
produkovaný na savčích bb. má
optimální glykosylaci; na buňkách ovarií
čínského křečka vzniká převážně
jednořetězcová
Terapeutické využití
Actilyse®
lyofilizát pro přípravu infuz. roztoku
●T1/2
= 5 min
●trombolytická léčba akutního infarktu myokardu
●trombolytická léčba akutní masivní plicní embolie doprovázené hemodynamickou nestabilitou
●fibrinolytická léčba akutních ischemických cévních mozkových příhod
Reteplasa
●rekombinantní, produkovaná na E. coli
●kratší úsek t-PA z 355 AK (1 – 3 a 176 – 527)
●Mr
∼ 39 000
●odstraněny 3 významné domény: N-terminální „prstová“, jež je spoluzodpovědná za
vysokou afinitu k fibrinu, doména homologická s epidermální růstovým faktorem a doména
„kringle 1“
●
toto + snížení glykosylace ⇒ očekávány odlišné (vhodnější) farmakodyn. a farmakokin.
charakteristiky
●T1/2
= 14 min
●vyšší fibrinolytická účinnost
●účinnost ve zprůchodňování koron. cév a snižování úmrtnosti na infarkt myokardu ale
srovnatelná s alteplasou
Rapilysin®
prášek pro přípravu roztoku nebo předplněná stříkačka
Terapeutické indikace
●trombolytická terapiie suspektního akutního infarktu myokardu s
přetrvávající elevací ST nebo nedávným blokem levého raménka během 12ti hodin od
nástupu symptomů akutního infarktu myokardu
Tenekteplasa
●glykoprotein vyráběný rekombinantní technikou na kulturách buněk ovarií čínského křečka
●(T = Thr, N = Asn, K = Lys; analog alteplasy, kde Thr103 byl zaměněn za Asn, čímž vzniklo
nové místo glykosylace, Asn117 byl zaměněn za Gln, čímž zaniklo mannosové místo,
sekvence Lys296-His-Arg-Arg299 byla zaměněna za 4 Ala, čímž vzrostla aktivita a
rezistence vůči inhibitoru plasminového aktivátoru 1 (PAI-1)
●T1/2
= 20 – 24 min
Metalyse®
prášek pro přípr. inj. roztoku 6, 8, 10 .103
m.j.
Terapeutické indikace
●trombolytická léčba suspektního infarktu myokardu s přetrvávající elevací ST
nebo nově vzniklým blokem levého raménka v průběhu 6 hodin od začátku příznaků
akutního infarktu
myokardu (AMI)
●podání jako jednorázový intravenózní bolus přibližně během 10 sekund
Desmoteplasa
●syn. bat. PA, vPA, DSPAα1
●sliny netopýra Desmodus rotundus obsahují 4 aktivátory plasminogenu (desmodus
salivary plasminogen activators = DPSAs)
●nejvýznamnější DSPAα1
= desmoteplasa; nejdelší, největší (85%) homologie s lidským t-
PA
●477 AK
●prstová doména, doména EGF a jedna kringle, nemá druhou ani místo štěpení nezbytné
pro přeměnu na dvouřeztězcový PA ⇒ jediný PA, který existuje výhradně jako
jednořetězcová molekula s plnou katalytickou aktivitou
●T1/2
= 2,8 h
●připravována rekombinantně
●3. fáze klinického zkoušení
Streptokinasa
Streptokinasi solutio concentrata ČL 2009
●
z filtrátu kultury β-hemolytických streptokoků skup. C
●jednořetězcový polypeptid, 414 AK, Mr
∼ 47 000
●po spojení s lidským plasminogenem (komplex 1 : 1) tvoří aktivátor plasminogenu
●T1/2
= 23 min
●nyní používána hlavně rekombinantní, produkovaná na E. coli
●maximum aktivity při pH 7,5; pI = 4,7
●rozpouští též fibrinózní část exsudátu
●v Evropě nejpoužívanější
Terapeutické indikace
Streptase®
Celkové podání
●akutní transmurální infarkt myokardu (ne starší 12 hodin) s přetrvávajícím STzvýšením
segmentu nebo současný blok levého raménka
●hluboká žilní trombóza, (ne starší než 14 dní)
●akutní, masivní plicní embolie,
●akutní nebo subakutní trombóza periferních tepen
●chronické okluzivní tepenné choroby (ne starší než 6 týdnů),
Lokální podání
●akutní infarkt myokardu k re-kanalizaci koronárních cév (ne starší než 12 hodin)
●akutní, subakutní a chronická trombóza; embolie periferních žil a periferních tepen
Anistreplasa
●syn. APSAC (Acylated plasminogen – streptokinase activator complex)
●komplex streptokinasy a aktivního místa humánního lyzinového plazminogenu, v němž byla
aktivní proteolytická místa inaktivována acylací – zavedením zbytků kys. anisové
●Mr
∼ 131 000
●k účinnosti nepotřebuje cirkulující plazminogen
●po injekci jsou acylové skupiny pomalu hydrolýzou odstraňovány, čímž se uvolňuje
aktivátor, jenž převádí plasminogen na plasmin ⇒ fibrinolysa
●T1/2
= 40 - 90 min
●je-li léčba zahájena během 3 hodin, LČ ochrání tkáň myokardu a funkci levé komory a zvýší
účinnost koronární tepny
Urokinasa
EC 3.4.21.73
Urokinasum ČL 2009
●enzym získaný z lidské moči, který aktivuje plasminogen
●směs nízkomolekulárních (Mr 33 000) a vysokomolekulárních (Mr 54 000) forem,
přičemž vysokomolekulární forma převažuje v urokinase izolované z ledvin,
zatímco nízkomolekulární u enzymu z tkáňových kultur buněk ledvin
●též rekombinantní, plně glykosylovaná, odvozená z myších nádorových buněk
●účinnost min. 70 000 m.j./mg bílkoviny
●T1/2
= 16 min
Rheotromb®
lyofilizát pro přípravu infuzního roztoku, 500 000 m.j.: registrace ukončena
Terapeutické indikace
a) U dospělých:
Systémová fibrinolýza
- arteriální trombóza
- masivní embolizace pulmonálních artérií
- hluboká venózní trombóza
Lokální fibrinolýza
- arteriální trombóza
- uzávěr arteriovenózní píštěle
b) U novorozenců a dětí do 14 let:
- Arteriální uzávěr: primární nebo sekundární okluze arterie, centrální trombóza jako např.:
trombóza aorty, femorální arterie, kompletní obstrukce plicní arterie, periferní trombóza.
- Venózní trombóza : např. trombóza ledvinné žíly, trombóza horní duté žíly, trombus
předsíní, nitrocévní tromby vyvolané katetrem, jako manžetové fibrinové tromby, tromby na
stěnách anebo tromby ucpávající žíly.
- Ucpané katetry
Ankrod
EC 3.4.21.74, dříve EC 3.4.21.28
syn. venombin A
●proteasa získaná z jedu malajského hada Agkistrodon rhodostoma
●glykoprotein
●selektivně štěpí vazby Arg
●258 AK, Mr
= 29 145
●schopen aktivovat přeměnu fibrinogenu na fibrin (prosrážlivý efekt), ale i degradaci fibrinu
(fibrinolytický), výsledný efekt závisí na druhu (příjemce)
●v klinických studiích 3. fáze se účinnost na zlepšení přežívání po AIM statisticky nelišila od
placeba
Peptidasy zažívacího traktu
Pepsin
EC 3.4.23.1
●základní kyselá proteasa žaludku
●endopeptidasa se širokou substrátovou specifitou
●první objevený enzym – 18. stol., pojmenoval T. Schwann 1825; druhý enzym získaný v
krystalické formě (po urease – Northtrop 1930)
●
pro odlišení od minoritních žaludečních proteas: pepsin A (× pepsin B; pepsin C =
gastricsin)
●1 řetězec, 326 AK, Mr
∼ 34 600, akt. místo tvořeno Asp32 a Asp215 (prasečí)
●katalyzuje hydrolýzu v rozsahu pH 1 – 6, optimum aktivity při pH asi 3,5
●pKa
v aktivním místě 1,57 a 5,02
Kvarterní struktura prasečího
pepsinu s vyznačením N- a Ckoncového
lobu; „náhodné cívky“
jsou vyznačeny tenkou čarou; mezi
loby vyznačen štěpený substrát
A: uspořádání aktivního místa pepsinu; atomy O
vyznačeny většími kuličkami, H-můstky čárkovaně,
největší kuličkou molekula vody, jež se podílí na
nukleofilním ataku (resp. její O)
B: předpokládaný katal. mechanismus pepsinu a
dalších aspartátových proteas: substrát (horní
molekula) je k aktivnímu místu natočena úsekem
Phe-Phe.
(a) -COOH Asp32 je částečně protonován, -COOH
Asp215 je částečně disociován
(b) Molekula H2
O navázána na (původně) C=O P1
–
meziproduktu hydrolýzy s sp3
uhlíkem
(c) Asp215 dodává H+
na N substrátu
(d) rozštěpení peptidové vazby
●pepsin je schopen štěpit i vazbu Phe-Pro
●klasické stanovení (obsahu/aktivity pepsinu v dané bílkovině – Anson 1938): hydrolýza
hovězího hemoglobinu při pH 2, přidání trichloroctové kys., filtrace, měření absorbance při
280 nm (v ČL 2009 modifikováno)
●škrkavka Ascaris suum tvoří peptidický inhibitor pepsinu (149 AK)
●Pepsini pulvis ČL 2009: ze žaludeční sliznice prasat, skotu nebo ovcí
Pankreatická peptidasa
●
směs peptidas užívaná v LP k podpoře trávení – substituci endogenních peptidas : Gastrix ®
,
Kreon ®
, Panzytrat ®
...
●součást Pancreatinum = pancreatine [USAN] – směsi trávicích enzymů získávané z
vepřových slinivek (+ lipasa, amylasa)
Trypsin
EC 3.4.21.4
●poprvé popsal Kühne 1876 jako proteolytickou aktivitu výměšku slinivky; odlišil aktivitu od
pepsinu vyšším optimálním pH
●název trypsin později spojován se štěpením vazby LysCO-NH- , .
ArgCO-NH-.
●krystalický získán 1931
●vylučován jako trypsinogen, aktivace
●
vazby na Lys a Arg štěpeny 105
krát ochotněji než na jiné přirozené AK, na Arg 2 – 5krát
ochotněji než na Lys
●některé AK ve specif. pozicích mohou inhibovat aktivitu: Arg, Leu, Ile, Lys, Phe na P2 inhibuje
aktivitu 2 – 16krát, Pro na P3 snižuje aktivitu 3 – 9krát
●stabilní jako lyofilizovaný prášek nebo v roztoku při pH 3, kdy je inaktivní
●primární struktura se značně liší dle druhu, terciární velmi podobná
●
jednořetězcový peptid, v němž jsou katalyticky účinné zbytky AK spojené úseky β-šroubovice
(„β-barrel“)
Chymotrypsin
EC 3.4.21.1
●minoritní složka pankreatické peptidasy
●z < 50 % homologický s trypsinem
●jiná substrátová specifita: hydrofobní AK zbytky: PheCO-NH-, TrpCO-NH-, TyrCO-NH●„katalytická
triáda“: His57, Asp102 a Ser195
●vylučován jako chymotrypsinogen, aktivace
●A a B, 80% homologie
●příprava: kyselá extrakce, precipitace (NH4
)2
SO4
, krystalizace (1955); precipitace
acetonem, chromatografie na iontoměničích – lze oddělit i A a B (1970); afinitní
chromatografie (1996); přenos genu do kvasinky, klonování, produkce
rekombinantního potkaního chymotrypsinogenu (1996)
Terciární struktura chymotrypsinu. A: N-terminální β-šroubovice (modrá) leží nad C-terminální β-šroubovicí
(červená), mezi nimi aktivní místo. Zymogen-aktivační peptid (žlutý) a C-koncový α− helix (zelený) stabilizují
celkovou strukturu a aktivní místa. Vnější místa, aktivní místa a místo pro vazbu Na+
jsou rozprostřena po
celém povrchu a nejsou spolu v přímém kontaktu. B: Schematické znázornění terciární struktury. C:
Topologie struktrury chymotrypsinu. D: Na modelu enzymu akt. místem směrem k pozorovateli patrno 8
smyček, potenciálních míst interakce s makromol. substráty a inhibitory. E: Symetrie terc. struktury. Konec
každého β-helixu vytváří 3 smyčky na straně aktiv. místa a dalšími dvěma obtáčí zadní část molekuly.
:
Glykosylasy
Glykosidasy, tj. enzymy hydrolyzující O- nebo S-glykosidy
α-Amylasa
syn. α-1,4-glukan-4-glukanohydrolasa, EC 3.2.1.1
●
katalyzuje hydrolýzu α-(1,4)-glykosidických vazeb složek škrobu, glykogenu a různých
oligosacharidů
●u savců vylučována ve výměšcích slinných žláz a pankreatu
●terciární struktura a schopnost interakce se sacharidy a inhibotory typu proteinů jsou u lidské a
prasečí amylasy velmi podobné
●
endo-amylasa: hydrolyzuje vnitřní α-(1,4)-glykosidické vazby amylosy a amylopektinu, což vede
k postupné degradaci substrátu až k neredukujícímu konci
terciární struktura obsahuje 3 domény: katalytickou „srdcovou“ doménu složenou z (β/α)8
šroubovice, jež obsahuje rozšířenou smyčku vloženou mezi třetí β-řetězec a třetí α-helix
(zvanou doména B, zbytky 100 – 169) a C-koncovou osmišroubovicovou doménu s βšroubovicovým
uspořádáním (doména C, rezidua 405 – 496)
●části z domén A a B jsou zapojeny do architektury tří funkčně nejvýznamnějších míst: aktivního
místa, místa vážícího Ca2+
a místa vážícího Cl-
O
O
OH
OH
O
OH
O
OH OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
n
OH
OH
O
O
OH
O
O
OHOHOH
O
OH
OH
OH
OO
OH
O
O
OH
O
OH
O
OH
OH
O
OH
300 < n < 1000amylosa fragment amylopektinu
štěpená vazba
štěpená vazba
α−(1,4)-glykosidická vazba štěpená α−amylasou
Terciární struktura α-amylasy s „pseudotetrasacharidovým“ inhibitorem akarbosou
H
NH
H
H
CH3
O
H
O
H
H
OH
O
H
O
H
H
OH
O
OH
H
OH
H
OH
H OH
H
OH
H
OH
H
OH
OH
H
OH
H
OH
H
OH
O-4,6-Dideoxy-4-(((1S,4R,5S,6S)-4,5,6-trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-2-cyklohexen-1-yl)amino)-α-D-
glukopyranosyl-(1-4)-O-α-D-glukopyranosyl-(1-4)-D-glukosa
akarbosa
Glucobay®
●
inhibitor α-amylasy – léčivo diabetu
Esterhydrolasy
Triacylglycerollipasa, syn. triacylglycerolhydrolasa, EC 3.1.1.3
●humánní gastrická lipasa: 379 zbytků AK, Mr
∼ 45 000
●humánní pankreatická lipasa: 449 zbytků AK, Mr
∼ 50 000
●na Asn166 navázán oligosacharidový řetězec s vysokým zastoupením mannosy nebo
složitější
●mezidruhová variabilita, ale vysoká homologie – myší z 92 % a potkaní z 93 % shodná s
lidskou z hlediska sekvence
●vylučována v „hotové“ formě, ne jako proenzym
●funkční při pH 4,5 – 9, optimální pH 7,0
●
aktivní místo není přístupné v roztoku ⇒ hydrolýza probíhá na rozhraní voda – lipidická
fáze
●k funkci nutné navázání kolipasy, proteinu o Mr
∼ 10 000, rovněž vylučovaného
pankreatem; lipidy jsou emulgovány solemi žlučových kyselin, což brání enzymu v
adsorpci na jejich povrch, navázání kolipasy usnadňuje adsorpci na povrch na rozhraní
voda – lipidy, pokryté solemi žlučových kyselin (vylučuje se jako prokolipasa, peptid z 95
AK, aktivována trypsinem ve střevě)
●struktura: 2 základní domény: velká N-koncová (1 - 336) a malá C-koncová (337 – 449);
velká patří k α/β-hydrolasovým strukturám a obsahuje aktivní místo; povrchová smyčka
zvaná víčková (lid) doména zakrývá aktivní místo v „uzavřené“ konformaci lipasy; kolipasa
se váže na C-terminální doménu a vytlačuje hydrofobní „cípy“ jejích „prstů“ na opačnou
stranu domény, tím dochází k otevření víčka; kolipasa zároveň vytváří rozsáhlou
hydrofobní plochu, která interaguje s fázovými rozhranímm voda-lipid
●„katalytická triáda“: Glu354, His468, Ser221
●vepřová: rovněž Mr
∼ 50 000 (přesně 50 084), 450 zbytků AK, glykosylace
„Uzavřená“ (E) a „otevřená“ (E*)
konformace lipasy
Kvarterní struktura lipasy. Putative NLBD = předpokládaná doména vazby neutrálních lipidů
O
O
O O
NO
H
1-[(3S,4S)-3-hexyl-2-oxooxetan-4-yl]-2-(2S)tridecyl-N-formyl-2-amino-4-methylbutanoát
orlistat
Xenical®
inhibitor pankreatické lipasy – periferně působící anobezikum