Současná spektrometrie v
klasické infračervené oblasti
= absorpční molekulová
rotačně - vibrační
spektrometrie
Vymezení základních pojmů, vztahů a veličin
λ = c / f
λ [m] - vlnová délka
c - rychlost elmag. vlnění ve vakuu (≈3.108
m.s-1
)
f [Hz] - frekvence (kmitočet)
ν[cm-1
] = 1 / λ[cm]
ν [cm-1
] - vlnočet
12 500 cm-1
- 5000 cm-1
- blízká infračervená oblast (NIR)
5000 cm-1
- 250 cm-1
- střední („klasická“) infračervená oblast
od 250 cm-1
- vzdálená infračervená oblast
Energie IČ záření při absobování sloučeninou mění v energii
vibračního a rotačního pohybu atomů na vazbách
Typy vibrací
Valenční - ν - změna délky vazby
C
HH
C
HH
ν(CH2)s
symetrické
ν(CH2)as
asymetrické
Typy vibrací
Deformační δ - změna vazebného úhlu
C
H H
δ(CH2) - nůžková („scissoring“)
C
C
C
H H
C
H H
C
twisting torzní vibrace
Významné vibrace
Absorbance
Infračervené spektrum butyl-4-hydroxybenzoátu
„otisk palce“
(finger print)
ν(OH)
ν(CO)
ν(C-H)
ν(C=C)
Příprava vzorku
•
disperze v tabletě z KBr (pevné vzorky)
•
disperze v nujolu (čištěném paraf. oleji)
•
roztok v CHCl3 nebo CCl4
•
nativní vzorek (kapaliny)
•
kyveta z anorg. soli (kapalné vzorky)
•
ATR nástavec - měření odrazovou technikou (nativní kapaliny, nízkotající pevné látky)
•
rozpouštědlo nebo dispergens ovlivňuje spektrum ⇒ spektra z různých prostředí se liší
Srovnání funkce klasických IR a FT- IR spektrometrů
Klasický - postupně se proměřuje absorpce záření vzorkem v celém vybraném rozsahu, vlnočet
vybírán monochromátorem; detektor termočlánek; výstup na zapisovač se speciálním papírem
Čas potřebný pro získání spektra: desítky minut
FT - IR - na vzorek se přivádí vhodně modulované IČ záření v celém rozsahu spektra najednou,
vzorkem prochází i záření odražené, toto záření spolu s referenčním, které vzorkem neprošlo, je
zachyceno detektorem a z jeho průběhu je Fourierovou transformací vypočítáno IČ spektrum;
detektorem fotonásobič; výstup na počítač
Čas potřebný pro získání spektra: zlomky sekundy ⇒ měření možno provádět opakovaně ⇒
nižší úroveň šumu
Oba systémy - veškerá optika, kterou záření prochází, z anorg. sloučenin, které v IČ
neabsorbují (NaCl, KBr, ZnSe), často velmi hygroskopické, nutno chránit před vlhkem; před
čočkami často upřednostňována dutá zrcadla (kulová, parabolická)
Využití IČ spektroskopie
•
strukturní analýza - dnes převážně zjištění (potvrzení) přítomnosti významných funkčních
skupin (C=O, -C≡N, -OH, -NH …) a seskupení atomů (-C=C-, -CH2-…); zde je IČ spíše
doplňkovou metodou k NMR a MS
•
identifikace sloučenin porovnáním jejich IČ spektra včetně oblasti finger printu se spektrem
ověřeného standardu (lékopisy - zkoušky totožnosti) nebo IČ spektry v databázích
•
rozlišení polymorfů = různých krystalových modifikací téže látky; významné např. ve farm.
technologii
•
kvantitativní analýza - pro tento účel je vhodnější absorbance, pík vhodné dostatečně
intenzivní vibrace (např. ν(C=O)), platí Lambert-Beerův zákon
•
měření spekter biomakromolekul a celých tkání pomocí reflektančních IČ technik - např.
studium změn struktury kůže při průniku xenobiotik do ní
•
aj.
Spektroskopie nukleární magnetické rezonance (NMR)
= absorpční spektroskopie v oblasti velmi krátkých radiových
vln (20 – 1000 MHz) za spolupůsobení stacionárního
magnetického pole
•
r. 1945 poprvé pozorovány signály vodíku, od 50. let sériově
vyráběné spektrometry
Proč NMR spektroskopie?
•
nukleární – využívá vlastností jader některých prvků, která mají rotační moment
neboli spin a s ním spojený magnetický moment. Spin je charakterizován spinovým
kvantovým číslem I, které může nabývat hodnot násobku ½, např.
2
H (=2
D), 14
N,I=1
1
H, 13
C, 15
N, 19
F, 29
Si, 31
PI = ½
12
C, 16
O, 32
SI = 0
•
magnetická – protože magnetické momenty těchto jader zaujmou v homogenním
mag. poli 2I + 1 orientací lišících se energií, např. dvě orientace pro jádra s I=1/2, a
to po směru a proti směru vnějšího mag. pole, přičemž vektor mag. momentu
vykonává precesní pohyb kolem směru mag. pole;
počet orientací m = 2I + 1 … magnetické kvantové číslo
•
rezonanční – protože jádra na nižší energetické hladině jsou schopna absorbovat
energii z vysokofrekvenčního pole (v oblasti velmi krátkých radiových vln), jestliže
frekvence precesního pohybu jejich mag. momentu a kruhová frekvence
radiofrekvenčního pole je stejná, tj. jsou-li v rezonanci
•
spektroskopie- protože vlastnosti těchto jader a jejich poloha v molekule se dají
odvodit ze spektra vzniklého jako záznam intenzity absorpce rf záření v závislosti
na jeho frekvenci
Precesní pohyb vektoru magnetického momentu µ pod úhlem α v magnetickém poli indukce
B
Larmorova frekvence ω = γ.B
γ… magneogyrický poměr (viz dále)
B…indukce vnějšího mag. pole
µ
B
ω
α
Co lze vyčíst z NMR spektra?
a) počet signálů – udává, kolik je strukturně neekvivalentních atomů sledovaného izotopu
v molekule
b) poloha signálů – odráží vliv elektronů z intra- a intermolekulárního okolí zkoumaného
jádra
c) intenzita signálů – odpovídá relativnímu zastoupení v jednotlivých skupinách
ekvivalentních atomů
d) stěpení signálů – charakterizuje ovlivnění lokálního mag. pole působícího na jádro
mag. momenty jader vázaných v blízkém okolí
Interpretace spektra = přiřazení jednotlivých signálů atomům v molekule s využitím
těchto 4 charakteristik
CW a FT-NMR spektroskopie
CW (continuous wawe) – sleduje se, jak se mění absorpce radiového vlnění s postupnou
plynulou změnou frekvence tohoto vlnění
FT (Fourier transform) – krátkým vysokofrekvenčním pulzem se docílí absorpce energie v
širokém frekvenčním rozsahu a matematickým zpracováním pulzní odezvy (návrat jader
do základního stavu - FID - free induction decay - volné doznívání indukce) Fourierovou
transformací (FT) se pak z časové závislosti získá frekenční závislost absorbovné
energie
•
spektra získaná oběma metodami jsou při stejné základní frekvenci spektrometru
prakticky totožná
Interpretace 1
H-NMR spektra N-butylacetanilidu
0.50.51.01.01.51.52.02.02.52.53.03.03.53.54.04.04.54.55.05.05.55.56.06.06.56.57.07.07.57.58.08.0
N
CH3
O
CH2
CH2
CH2
CH3
HH
H
H H
δ[ppm]
Principiální schéma CW NMR spektrometru
Póly (elektro)magnetu
Vzorek v NMR kyvetě
„Vysílací“ cívka
„Přijímací“ cívka
Principiální schéma FT NMR spektrometru
měřící cívka
FID a FT-NMR spektrum
ethanol
0.200.20 0.400.40 0.600.60 0.800.80 1.001.00 1.201.20 1.401.40 1.601.60 1.801.80
1.01.01.21.21.41.41.61.61.81.82.02.02.22.22.42.42.62.62.82.83.03.03.23.23.43.43.63.63.83.84.04.0
⇓ Fourierova transformace
t [s]
δ [ppm]
Signály v NMR spektroskopii a jejich počet
Podmínka rezonance - závislost rezonanční frekvence, tj. frekvence, při níž do chází k absorpci
energie spojené spřechodem na vyšší energ. hladinu na daném jádře (izotopu)
2π f = γ B
γ … magnetogyrický poměr - konstanta charakteristická pro daný izotop
B … magnetická indukce
•
jednotlivé izotopy se navzájem liší magnetogyr. poměry, přirozeným výskytem a citlivostí ⇒ nelze
měřit různé izotopy v jednom experimentu
Stínění - elektrony kolem jádra i ostatní elektrony v molekuly vytvářejí vlivem mag. pole magnetu
spektrometru B0 sekundární mag. pole, které specificky zeslabuje mag. pole působící na jádro ⇒
podmínka rezonance zohledňující indukci použitého magnetu:
2 π f = γ B0 . (1 - σ) ,
kde σ je stínící konstanta charakterizující polohu jádra v molekule, čili jeho chemické okolí
Signál = absorpční linie příslušející jednomu jádru nebo skupině jader chemicky ekvivalentních,
která může být rozštěpena na více píků, čili tvořit multiplet
Jak zjistit, zda jsou jádra chemicky ekvivalentní?
Máme-li více jader stejného izotopu v molekule,
1) provedeme jejich myšlenkovou substituci jiným izotopem, který se v molekule ještě nevyskytuje
2) zjišťujeme, zda vznikající sloučeniny jsou shodné nebo rozdílné; shodné ⇒ chem. ekvivalentní,
neshodné ⇒ chem. neekvivalentní
Substituční postup při zjišťování chemické ekvivalence
CH3
CH
CH3
C
H2
OH
CH3
C
H2
C
H OH
CH3
XCH2
C
H2
C
H OH
CH3
CH3
C
H2
C
H OH
CH2
X
isobutylalkohol - substitucí stejné látky - methyly chem. ekvivalentní - 1 signál
sek. butylalkohol
substitucí vzniknou rùzné látky - methyly nejsou chem. ekvivalentní - 2 signály
Poloha signálu v NMR
•
závisí na umístění odpovídajícího atomu v molekule, t.j na jeho chemickém okolí, k vyjádření
se obvykle nepoužívá rezonanční frekvence v Hz, která je závislá na pracovní frekvenci
přístroje, ale chemický posun δ [ppm]
δ = (f – fs) / f0
kde f … rezonanční frekvence jádra [Hz]
fs…rezonanční frekvence standardu (pro 1
H a 13
C tetramethylsilan) [Hz]
f0…pracovní frekvence přístroje [MHz]
Spin – spinová interakce
•
chem. posun jádra δ je ovlivňován spinem sousedního jádra ; ovlivnění závisí na orientaci
mag. momentu interagujícího jádra vzhledem k vnějšímu poli B0; u jader s I = ½ jsou orientace
2: ve směru a proti směru mag. pole B0;
•
orientace ve směru B0 ⇒ ↑ lok. mag. pole B ⇒ ↑ δ
•
orientace proti směru B0 ⇒ ↓ lok. mag. pole B ⇒ ↓ δ
•
obě orientace stejně pravděpodobné ⇒ rozštěpení signálu 1 sousedícím jádrem na 2 píky; n
sousedících jader štěpí signál na n + 1 píků (platí pro interakci mezi anisochronními jádry, tj. s
různými δ) ⇒ multiplet
Interakční konstanta J
= vzdálenost píků vzniklých rozštěpením signálu spin-spinovou interakcí vyjádřená v Hz
•
velikost nezávisí na použitém magnetickém poli
•
určitá hodnota J se ve spektru vyskytuje nejméně 2×, sousední jádra se štěpí navzájem
Přehled chemických posunů významnějších funkčních skupin a seskupení atomů
Multiplety prvního řádu a určování interakčních konstant
Multiplet 1. řádu = soubor píků vzniklých štěpenímsignálu spin-spinovou interakcí a dokonale od
sebe oddělených a s intenzitami v definovaných poměrech
Počet sous. jader Multiplet Zkr. rel. intenzity
0 singlet s 1
1 dublet d 1 1
2 triplet t 1 2 1
3 kvartet q 1 3 3 1
4 kvintet qi 1 4 6 4 1
5 sextet sx 15 10 10 5 1
6 septet sp 1 6 15 20 15 6 1
•
poměry intenzit platí u homonukleárního štěpení v případě, že rozdíl posunů interagujících jader
v Hz je mnohem větší než. int. konstanta
∆f » J
•
pokud se rozdíl řádově blíží int. konstantě (mezí šestinásobek)
∆f ≥ 6J ,
nastává zkreslení relativních intenzit - tzv. stříškový efekt
Multiplety prvního řádu a určování interakčních konstant
856856858858860860862862864864866866868868870870872872874874876876878878880880882882884884886886
1360136013701370138013801390139014001400141014101420142014301430144014401450145014601460147014701480148014901490150015001510151015201520
706706708708710710712712714714716716718718720720722722724724726726728728
J J J
J
Jdublet
triplet
kvartet
Stříškový efekt
∆ f ∼ 6 ⇒ zkreslení intenzit multipletu; na straně obrácené k signálu interagujícího jádra intenzita
větší; spojnice vrcholů píků tvoří „stříšku“; lze použít ke zjištění, která jádra interagují
6.806.806.906.907.007.007.107.107.207.207.307.307.407.407.507.507.607.60
Interpretace a výpis 1
H-NMR spektra
Možný postup při ověřování struktury připravené (izolované) sloučeniny
1. Nakreslíme strukturní vzorec látky se všemi vodíky, vodíky spočítáme.
2. Najdeme signál, který odpovídá zmámému počtu vodíků, vydělením integrální intenzity
(relativní plochy) tohoto signálu odpovídajícím počtem vodíků získáme podíl integrální
intenzity, připadající na jeden vodík(„jednotkový integrál“)
3.Vydělením integrálních intenzit „jednotkovým integrálem“ získáme počty vodíků odpovídající
jednotlivým signálům.
4. Sečteme počty vodíků celého spektra a součet porovnáme s počtem vodíků předpokládané
sloučeniny. V případě, že počet (alespoň přibližně) souhlasí, pokračujeme dále. Nesouhlas
znamená, že se buď nejedná o předpokládanou strukturu, nebo je látka silně znečištěná.
5. Přiřazujeme δ jednotlivých signálů příslušným skupinám vodíků. Využíváme štěpení (včetně
odečtení J a jejich porovnání s hodnotami v tabulkách), chemické posuny porovnáváme s
hodnotami v tabulkách nebo publikacích, hodnotami vypočtenými s využitím inkrementů
uvedených v literatuře nebo vhodného software. Pokud tyto údaje nestačí, změříme další typy
NMR spekter (13
C, 2D spektra).
5. Hodnoty ze spektra vypíšeme způsobem obvyklým nebo požadovaným v časopise, kde
chceme přípravu (izolaci) látky opublikovat.
Interpretace a výpis 1
H-NMR spektra - příklad
N-(4-butoxyfenyl)chloracetamid
NO
O
Cl
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
HH
H H
H
H
16 H
1H 2H 2H 2H 2H 2H 2H 3H
∑16H
8,44
4,43
7,677,13
1,23
4,20
2,10 - 1,90
1,85 -1,65
ppm (f1)
1.02.03.04.05.06.07.08.0
0
50
100
150
200
250
1.00
2.10
2.32
2.18
2.36
2.35
2.44
3.57
Interpretace a výpis 1
H-NMR spektra - příklad
N-(4-butoxyfenyl)chloracetamid
V syntetických publikacích včetně diplomových a dizertačních prací se zpravidla neuvádějí NMR spektra v
grafické podobě, ale výpisy interpretovaných spekter. V detailech se liší podle požadavků jednotlivých redakcí.
Výpis 1
H-NMR spektra N-(4-butoxyfenyl)chloracetamidu může vypadat např. takto:
1
H-NMR (CDCl3, 200 MHz, δ [ppm], J[Hz]): 8,44 1H s (NH), 7,67 2H d J=8,8 (o-arom.), 7,13 2H d J=8,8 (marom.),
4,43 2H s (CH2Cl), 4,20 2H t J=6,6 (OCH2), 2,10-2,90 2H m (CH3CH2), 1,85-1,65 2H m (CH2CH3), 1,23
3H t J=7,3 (CH3)
Poznámky k 13
C-NMR spektroskopii
Izotop 13
C v organické hmotě představuje jen asi 1 % veškerého uhlíku ⇒
•
metoda je méně citlivá než 1
H-NMR
•
měření trvá déle, k dostačnému odstupu signál/šum je třeba naakumulovat větší počet FIDů
(standardně 1024, při malém množství vzorku řádově více)
•
malá pravděpodobnost sousedství 2 jader 13
C ⇒ nedochází ke spin - spinové interakci
13
C - 13
C, nastává však štěpení 1
H - 13
C, to je však odstraněno elektronickým „dekaplinkem“,
takže výsledné 13
C-NMR spektrum je čarové
•
u 13
C spekter se obvykle nevyužívají integrální plochy, protože různě substituované typy
uhlíků (primární, sekundární, terciární, kvartérní) mají různý tzv. relaxační čas, tj. čas, za
který přejde jádro uhlíku zpět do základního stavu, a proto se zachytí na spektru s různou
intenzitou
•
interpretace se provádí na základě porovnámí posunů na spektru s posuny vypočtenými
nebo nalezenými v literatuře, často se speciálními NMR experimenty rozlišují typy uhlíků
(např. apt = Attatched Proton Test rozliší jádra se sudým a lichým počtem vodíků)
Interpretace a výpis 13
C-NMR spektra
piperidin-2-on
ppm Int. Assign.
172.93 667 1
41.97 863 2
31.46 985 3
22.28 1000 4
20.90 985 5
13
C-NMR (CDCl3, 50 MHz, δ[ppm]: 172,9; 42,0; 31,5; 22,3; 20,9