Fyzikálně-chemické parametry ovlivňující účinek léčiv Rozpustnosti, lipofilita, hydrofobicita Rozpustnost ve vodě •nutná pro uvolnění LČ z pevné lékové formy do obsahu GIT, transport LČ tělními tekutinami •pro p.o. podání stačí malá - v GIT se vytváří nasycený roztok, látka se kontinuálně vstřebává přes mukózní vrstvu a rozpuštění pokračuje, dokud se LČ nevstřebá (2 dymamické rovnováhy: LF - tekutina GIT; tekutina GIT - mukóza krevní plazma) •podobně i.m. a s.c. podání (postupné uvolňování z "depa" ve svalu či pod kůží) •pro i.v. podání však nutná dostatečná rozpustnost (proto tvorba solí, hydrofilních proléčiv, inkorporace do dutiny (3-cyklodextrinu apod.) •vyjadřuje se např. v g/100 ml vody, g/l vody, mmol/l vody apod. (nezaměňovat s koncentrací - jedná se zpravidla o množství vztažené na objem čistého rozpouštědla, nutno však zdroj studovat pozorně); relativní přesně definované vyjadřování viz ČL 2009 Rozpustnost v lipidech •nutná pro průnik LČ bariérami organismu (membránami) •hydrofobní interakce se rovněž uplatňují při vazbě LČ na receptor nebo aktivní místo enzymu •absolutní rozpustnost v lipidech či lipofilním rozpouštědle se stanovuje zřídka; její znalost může mít význam např. technologický (kupř. salicylová kys. je nerozpustná ve vazelíně, pro její solubilizaci lze použít ricinový olej) •častěji se vyjadřuje (hydro)lipofilita, hydrofobicita © Oldřich Farsa 2015 Lipofilita, hydrofobicita látky •pojmy téměř synonymní •vyjadřují "afinitu" látky k vodné či lipidové fázi na jejich rozhraní •kvantifikace lipofility- nejběžněji rozdělovači koeficient P, nejčastěji jako log P, aby mezi hodnotami pro jednotlivé látky nebyl rozdíl několika řádů Cy CL, Cv - rovnovážné koncentrace v lipidové a vodné fázi; lipidy zpravidla nahrazeny vhodným org. rozpouštědlem •používané soustavy: oktanol/voda (oktanol "mimikuje" vlastnosti biomembrán), ve farmacii, resp. farm. chemii nejčastější, tisíce hodnot publikovány; chloroform/voda, cyklohexan/voda ...; pro kyseliny a baze zpravidla nastaveno pH vodné fáze (silná kyselina, zásada, pufr) •způsob stanovení: vytřepávání v dělící nálevce (nebo jiné vhodné nádobě), v ideálním případě až do rovnováhy (nutno stanovovat), zpravidla ale jen po omezenou, předem definovanou dobu; pak log P' (zdánlivý rozdělovači koeficient); poměry objemů fází nutno volit dle předpokládaného log P tak, aby koncentrace v jedné z fází byla zvolenou analytickou metodou stanovitelná •u disociovatelných látek (kyseliny, baze) je nejlipofilnější nedisociovaná forma - viz dále Příklady vlivu lipofility na průnik bariérami organismu .hematoencefalická bariéra: pro látky pronikající pasivní difúzí optimum log P ,1,5 až 2,7 s maximem 2,1 Tight junction Reccptor-mediated tmnscytosis Hematoencefalická bariéra (řez mozkovou kapilárou) Bukální, střevní a kožní bariéra skin buccal mucosa small intestine Fii;. 1. A structural comparison of the skin, buccal mucosa, and small intestine. The- skin and buccal mucosa arc covered by a strati tied squamous epithelium, whereas the surface o ťthe small intestine consists of a simple columnar epithelium. The region associatd with the barrier properties o ť each tissue is highlighfcd by the asterisk. 'Ibis diaipam is not drawn to scale. Srovnání stavby kůže, sliznice dutiny ústní a tenkého střeva •kůže a mukóza je kryta vrstevnatým dlaždicovým epitelem, povrch tenkého střeva jen jednoduchým cylindrickým epitelem •mukóza ústní dutiny je na některých místech keratinizována, kůže všude (stratum corneum); průnik přes keratinizovanou vrstvu vyžaduje zvýšenou lipofilitu Transportní cesty léčiv přes mukózní sliznici ve srovnání se sliznicí tenkého střeva (a) (b) paracellular transcellular paracellular transcellular střevo m u koza •paracelulární cestou pronikají sloučeniny rel. hydrofilní, trancelulární hydrofobní; u mukózy nutná větší lipofilita Léčiva spontánně pronikající kožní bariérou do krevního oběhu 0„N glycerol-trinitrát log P = 1,62 - též bukálně estradiol log P = 4,01 Climara drm emp tdr skopolamin log P = 0,98 Nitroglycerin-Slovakofarma orm tbl buc nikotin log P= 1,17 Nicopatch drm emp tdr - též bukálně fentanyl log P = 4,05 Durogesic drm emp tdr - též bukálně Effentora orm tbl buc Acidobazické vlastnosti •velká část LČ slabé kyseliny nebo baze •síla kyseliny nebo baze kvantifikována disociační konstantou K, Kb, často jako pK = -log K Pro kyseliny + HA - H + A v [H+][A~] [HA] pK=-\o%K=-\o%[H+]-\o%[Ä ] PKa =PH~ lOg [HA] [A~] Hendersonova-Hasselbachova rovnice [HA] log^-= pH-pKa [HA] a [A~ ] („H-pK ) P'a*' Pro Pom®r disociované a nedisociované formy [H4]~ Dosazení pro ibuprofen v krevní plazmě pK =4,91 pH = 7,4 a iál = io<7^9» = io2-49 = 309,03 => 309,03:1 => = 0,9968 = 99,68% [HA] 310,03 Pro baze B + l-T . BH+ K _ [BH+] b [B][H+] pKb=-\og^-^-\og-^— = -\og^-^--(0-\og[H+]) F b & [B] &[H+] & [B] V &l V [BH ] pKh = - log ——--pH Hendersonova-Hasselbachova rovnice I^J •častěji se u bazí uvádějí pK konjugované kyseliny, pro něž platí pKa + PKb =14 •potom čím vyšší pK , tím je baze silnější •pro podíl disociované a nedisociované formy baze pak platí [BH ] = ^(pKa-pH) [B] Příklad - výpočet podílu disociované formy morfinu v žaludku pH =1 pK=7,87 [BH ] = 10(7'87-y = 7413102,413 => 7413102,413:1 => 7413102>413 = 0,999999865 = 99,9999865 % [B] 7413103,413 •v plasmě při pH=7,4 B. = l0(787-7-4) = 2,951 => 2,951:1 => = 0,74689 = 74.7% [5] 2,951+1 Vztah disociace a lipofility •nejlipofilnější forma je nedisociovaná •látky procházejí bariérami včetně sliznice GIT nejlépe v nejlipofilnější formě •^>z kyselého prostředí žaludku se lépe vstřebávají kyseliny, z bazického prostředí tenkého střeva baze •distribuční koeficient D, častěji log D je log P při daném pH, charakterizuje tedy látku z hlediska lipofility a acidobazických vlastností zároveň Příklad - ciprofloxacin logD -1.80 pH 1 Temp: 25 °C (28) logD -1.79 pH 2 Temp: 25 °C (28) logD -1.78 pH 3 Temp: 25 °C (28) logD -1.75 pH4 Temp: 25 °C (28) logD -1.54 pH 5 Temp: 25 °C (28) logD -1.07 pH6 Temp: 25 °C (28) logD -0.85 pH 7 Temp: 25 °C (28) logD -0.95 pH 8 Temp: 25 °C (28) logD -1.47 pH 9 Temp: 25 °C (28) logD -2.14 pH 10 (28) Q S AR = QUANTITATIVE STRUCTURE - ACTIVITY RELATIONSHIPS KVANTITATIVNÍ VZTAHY MEZI (CHEMICKOU) STRUKTUROU A (BIOLOGICKOU) AKTIVITOU Hledáme vztah, v němž je biologická aktivita funkcí struktury, resp. parametrů, které se strukturou souvisejí A= f (struktura) 2 základní přístupy QSAR •regresní analýza - hledá matematický popis funkce, většinou s použitím lineární apod. regrese •empirické metody - hledají pouze extrémy (maxima a minima) dané funkce Regresní analýza hledá rovnici ve tvaru A = a+ ax+ax+...ax, 0 11 2 2 n n kde A je biologická aktivita, x jsou parametry vyplývající ze struktury sloučeniny, a , b jsou regresní koeficienty (aQ ...absolutní člen), získané výpočtem. V případě tzv. Hanschovy metody jsou x fyzikálně- chemické parametry vyplývající ze struktury, v případě tzv. Free-Wilsonova přístupu parametry x vyjadřují přítomnost nebo nepřítomnost určitého substituentu nebo strukturního fragmentu v molekule. Hanschova metoda regresní analýzy A = a + a x + a x+...a x 0 11 2 2 n n A ... biologická aktivita, často kvůli linearizaci vztahu v převrácené hodnotě nebo logaritmu (1/MIC ... převrácená hodnota minimální inhibiční koncentrace u antimikrobních látek, log LD5Q, logaritmy konstant vyjadřujících afinitu látky k receptoru, také ale některé fa rm ako kin etické parametry, např. log BB, vyjadřující schopnost látky pronikat hematoencefalickou bariérou aj. al ... an... regresní koeficienty, tj. koeficienty získané výpočtem s použitím např. lineární regrese "Klasické" parametry xi ... xn •hydrofobní •elektronové •sterické a) Hydrofobní parametry - v rovnici často v kvadratickém tvaru - vyjadřují poměr rozpustnosti látky ve vodě a v lipidech; mají pro účinek často zásadní význam, zejména pro průnik bariérovými systémy organismu; např. log P(oktanol/voda), log P(cyklohexan/voda) aj., parametr Rm z rozdělovači TLC na tzv. reverzní fázi (stacionární fáze lipofilní, mobilní fáze hydrofilní): dále logaritmus tzv. kapacitního faktoru log k' z rozdělovači chromatografie plynové (GC) nebo vysokoúčinné kapalinové (HPLC) log k =log( tr to ), i r kde tr je retenční čas dané látky a t0 je tzv. mrtvý retenční čas, tj. retenční čas látky, která se na koloně nezadržuje (např. u HPLC na reverzní fázi s oktadecylovaným silikagelem se pro stanovení t0 používá dusitan sodný). (Hanschův) lipofilní parametr n - pro řady (série) látek, obsahující na stejném strukturním fragmentu (nejčastěji benzenovém jádře) různé substituenty Px TT=l0g —= l0gP^-l0gP/y * H kde Px je rozdělovači koeficient substituované látky a PH rozděl, koeficient látky nesubstituované. Vypočtené hydrofobní parametry Kromě experimentálně stanovených hydrofobních parametrů se dnes stále častěji používají odhady těchto parametrů získaných výpočtem podle různých algoritmů, z nichž nejjednodušší jsou patrně výpočetní postupy pro odhad log P (oktan o l/vod a) součtem log P inkrementů podle Rekkera a Nysse i loggia,-/,, kde f. je log P příslušného fragmentu a a. je počet, kolikrát se tento fragment vyskytuje, nebo podle Hansche (a Lea) vzorcem i j kde f. je fragmentová konstanta, f. je korekční faktor a a. a b je odpovídající počet výskytů daného parametru. Častěji se dnes ale používají složitější postupy vyžadující počítače a vhodný software, který často umožňuje i optimalizaci struktury metodami molekulové mechaniky a výpočty dalších parametrů pro výpočty QSAR (pro PC např. Molgen, HyperChem). Shoda vypočteného odhadu log P, často označovaného Clog P, s experimentálně stanovenou hodnotou, bývá pro různé výpočetní postupy velmi odlišná, často však pro výpočty postačí, existuje-li lineární závislost mezi log P a Clog P. Příklad QSAR závislosti pouze s hydrofobním parametrem Účinnost fenolů jako induktorů apoptosy nádorových buněk Hansch, C. etal.: Bioorg. Med. Chem. 11, 617(2003) TU Loj lfC ťredJ&j L/C Cb|F ■ Km rj'j.-.'. 2.7* 2JÍ -fcJQ* J.Ti 4-fů('4iteijoa lir 1.41 -4.14 |J7 4-<:nH.,.:0 A 2JŠ4 Jíl •: •:• 1*7 2*Í : ■- i: 1JŮ 4-i": ľ4-jií£]>:■] L 44 I.4Í □Udí ■ ■■ 1 Jwi ft> ta líhal tůj* 2*9 -4.77 4.M 4- I-JiíiOjo] 2JW 22* -ĎĽÍI 2*0 ■' Hedo!1 ■44 I.7Í : 4- ll 4-MeS-jJrLO> ■in 1.72 ÚlSS 2Jl 2.12 2.41 OH estradiol (1) log 1.c ,, 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0-1.0 log 1/C = 0,67(±0,21)ClogP + 0.37(±0.63) n = 8, ŕ = 0,910, s = 0,201, q2 = 0,863 CH, HO- \\ // // \ // OH H3C diethylstilbestrol (8) Regresní krivka - Inhibitory apoptosy 1 C log P 2.0 3.0 4.0 b) Elektronové parametry -souvisejí s elektronovým obalem molekuly • Hammetovy konstanty a - pro m- a p-substituované deriváty benzenu; vyjadřují elektrondonorové (+M, +1) nebo elektronakceptorové (-M, -I) vlastnosti substituentu; odvozené konstanty: a , a, a*, podobné Swain-Luptonovy konstanty ^HR •parametry ze spekter a jiných fyzikálních měření - chem. posuny ô z NMR, vlnová délka maxima absorbance ^max z UV-VIS spekter, vlnočet v výrazného absorpčního pásu v IČ spektrech, půlvlnný potenciál El/2z polarografie •vypočtené elektronové parametry: polarita, polarizovatelnost, parciální náboj na určitém atomu c) Sterické parametry - vyjadřují "celkovou objemnost" molekuly nebo častěji substituentu na společném skeletu •van der Waalsovy poloměry vp Taftová sterická konstanta Es odvozená pomocí rychlostních konstant hydrolýzy esterů alkanových kyselin kx kde kx je rychlostní konstanta hydrolýzy esteru příslušné alkanové kyseliny RCOOFT a kh obdobná konstanta pro ester kyseliny octové CH3COOR- standard. Egnení čistě sterickým parametrem, zahrnuje částečně i elektronové vlivy (+l). E (CH ) = 0, objemnější substituenty E < 0, méně objemné E > 0 • Verloop sterické parametry - pro jednotlivé substituenty - odvozené (změřené) z počítačově optimalizovaných modelů molekul (Sterimol) - L je délka substituentu, B1 - B4 "poloměry zakřivení" substituentu ("podélné" a "horizontální") (Karboxylová skupina v molekule benzoové kys.) : l Další parametry užívané v QSAR většinou vypočtené >zahrnují často 2 i 3 typy vlivů (hydrof.+elektron.+ster.) "Klasické" •parachor = M_ (1/4) r d y , kde y je povrchové napětí, M molární hmotnost a d hustota. •molární refrakce (= molekulární refraktivita) MR (též CMR); def. vztah označován Lorentzova-Lorenzova rovnice . n d (n +2) d kde n je index lomu. "Neklasické" •solvatační energie - je-li pro vodu, pak hydratační energie AGQW •povrchy molekuly různého typu - polární van der Waalsův, nepolární, přístupný vodě, dynamický polární (DPSA), topologický polární (TPSA) aj. •objemy molekuly - polární, přístupný vodě aj. Free- Wilsonova metoda regresní analýzy •hledá závislost biologické aktivity na přítomnosti nebo nepřítomnosti určitých substituentů nebo strukturních fragmentů v molekule. Jde o vlastně o statistickou separaci aktivity na příspěvky určitých částí molekul, tj. předpokládá se aditivita vlivu substituentů nebo jiných částí molekuly. Metoda vede k řešení soustav rovnic o větším počtu neznámých, které se v jednoduchých případech dají řešit maticovým počtem, jinak pomocí statistických programů umožňujících multilineární regresi (MLR). •obě metody lze též kombinovat. Část nezávislých proměnných pak vyjadřuje fyzikálně-chemické vlastnosti látek, další, nazývané „indikátorové proměnné" (symbol I), udávají přítomnost nebo nepřítomnost určitých molekulových fragmentů. Indikátorových proměnných bývá obvykle malý počet, často pouze jediná. Empirické metody QSAR •používány s výhodou tam, kde nelze jednoduše zjistit matem, popis funkce A = f(struktura) •hledají pouze extrémy (maxima a/nebo minima) dané funkce; matem, popis přitom zůstává "černou skříňkou" •při jejich aplikaci syntetik usměrňuje volbu látky k syntéze na základě biol. hodnocení látky předchozí Optimalizace podle jednoho strukturního parametru - Fibonacciho optimalizace Látky se seřadí podle rostoucí hodnoty strukturního parametru, u něhož se přepokládá, že aktivitu významně ovlivňuje. Počet látek musí odpovídat počtu bodů v některém z Fibonacciho intervalů (viz tab. 1), není-li tomu tak, některá z krajních látek, u nichž je malá pravděpodobnost, že by byly nejúčinnější, se vypustí nebo se naopak přidá fiktivní krajní látka. K syntéze se vyberou látky, které mají v intervalu pořadí uvedené ve druhém sloupci tabulky. Provede se biologické hodnocení těchto látek a podle jeho výsledků se část intervalu od jednoho z krajních bodů směrem k méně aktivní sloučenině vyloučí. Výsledný soubor je dalším Fibonacciho intervalem. Výběr se opakuje tak dlouho, dokud se nedospěje k nejúčinnější sloučenině. Metoda umožňuje podstatně snížit počet syntetizovaných a testovaných látek, např. namísto 589 látek, které by bylo nutno připravit a otestovat, abychom mezi nimi našli nejúčinnější, stačí připravit a stanovit biol. aktivitu u pouhých 13 sloučenin (viz sloupec C tab. 1). Tab. 1. Fibonacciho optimalizace Legenda: A ... počet látek příslušného Fibonacciho intervalu B ... pořadí látek určených pro syntézu a testování v rámci intervalu C ... počet látek potřebný k dosažení optimalizace A B C A B C A B C 2 I a 2 2 20 8 a 13 6 143 55 a 89 10 4 2a3 3 33 13 a 21 7 222 89 a 144 11 7 3a5 4 54 21 a 34 8 366 144 a 233 12 12 5a8 5 88 34 a 55 9 589 233 a 377 13 Optimalizace podle více strukturních parametrů Simplexová metoda Každou látku lze charakterizovat jako bod v n-rozměrném prostoru, ve kterém biologická aktivita je jednou souřadnicí a zbývajících n - 1 souřadnic představují fyzikální a fyzikálně-chemické vlastnosti sloučeniny, o nichž se předpokládá, že aktivitu ovlivňují. Pokud pracujeme v (klasickém) trojrozměrném prostoru, tj. optimalizujeme-li pouze dva parametry, můžeme optimalizaci provést i graficky na milimetrovém papíře. Pracujeme vlastně v průmětu do roviny vlastností. K (syntéze a) hodnocení se vyberou 3 látky, které v rovině souřadnic vlastností nejsou od sebe příliš vzdálené s jejichž souřadnice v této rovině tvoří trojúhelník, nejlépe rovnostranný. Porovnáme aktivity těchto 3 sloučenin a z bodu, patřícího látce o nejnižší aktivitě, vedeme polopřímku středem spojnice dvou bodů s vyššími aktivitami (alternativně bodem, který vznikne rozdělením této spojnice v převráceném poměru aktivit) a na ní nalezneme bod stejně vzdálený, ale opačně orientovaný, než bod s nejnižší aktivitou. Pokud tento bod neodpovídá žádné sloučenině, použijeme k hodnocení látku nejbližší. Z tohoto bodu a dvou předchozích vytvoříme další trojúhelník, který podrobíme stejnému optimalizačnímu pochodu. Postup opakujeme, dokud nacházíme látky o rostoucí aktivitě. Jakmile aktivita začne klesat, můžeme látku s dosaženou nejvyšší aktivitou považovat za optimální. Simplexová metoda Optimalizace podle více strukturních parametrů Optimalizační schémata •postup racionálních myšlenkových pochodů farm. chemika •zohledňují hydrofobní, elektronové a sterické parametry •nejsou univerzální; pro určitý typ obměn na určité struktuře bývá nutné sestavit nové Schéma obměn substituentů na fenylu (Topliss 1972) 3-CI mene 4-OCH, <=" 4-CI 3-CF3) 4-CI; 3-CF3, 4-N02 3,4 CL I 3-CH3, 4-N(CH3)2 stejné 4-N(CH3)2 4-CH, Ny^nebo 4-CF3, (4-Br, 4-I), 2,4-CI2 »4-C(CH3)3; 3,4-(CH3)2 4-NH2; 4-OH; 3-CH3, 4-OCH3 S-NÍCH^; 3-NH2 <= 3-C! 3-CF3; 3-Br; 3-I; 3,5-CI, 3-CH3 - 2-CI; 2-CH3; 2-OCH3 Komentář ke schématu obměn substituentů na fenylu Při optimalizaci podle uvedeného schématu postupujeme tak, že nejprve připravíme nesubstituovanou sloučeninu a její 4-chlorderivát. Substituce chlorem sníží elektronovou hustotu v poloze 1 a zároveň zvýší lipofilitu (4-CI: a = 0,23; 71 = 0,71); je-li 4-chlorderivát aktivnější, lze lipofilitu a elektronakceptorové vlastnosti zvýšit další substitucí chlorem. Je-li 4-chlorderivát méně aktivní, můžeme předpokládat, že pokles elektronové hustoty ovlivnil aktivitu negativně, a připravíme 4-methoxyderivát, který má lipofilitu prakticky stejnou jako nesubst. látka, el. hustota v pol. 1 je však vyšší (4-OCH3: a = -0,27,71 = 0,02). Není-li zřetelný rozdíl mezi aktivitou nesubst. látky a 4-chlorderivátu; můžeme předpokládat, že vliv el. hustoty a lipofility působí proti sobě a zkusíme připravit 4-methylderivát (4-CH3: a = -0,17,71 = 0,56). Je-li u všech látek substituovaných v pol. 4 aktivita nižší něž u nesubstituované látky, je zřejmé, že substituce v poloze 4 je stericky nevýhodná, a budeme připravovat látky substituované v polohách 2 a 3. V jednotlivých větvích tohoto schématu je možné postupovat dále, dokud nedojdeme ke sloučenině s maximální aktivitou.