6. Stanovení „kyselé“ disociační konstanty nitrofurantoinu Princip metody Pro disociaci slabých kyselin, mezi něž se řadí i klasické chemoterapeutikum močových cest nitrofurantoin, tj. 1-[(5-nitrofuran-1-yl)methylenamino]imidazolidin-2,4dion, platí Hendersonova-Hasselbachova rovnice, kterou lze psát ve tvaru pKa = pH + log ([HA]/[A]) , [1] kde [HA] je rovnovážná koncentrace nedisociované formy kyseliny a [A] rovnovážná koncentrace její disociované formy. Spektrofotometrické stanovení disociační konstanty vyžaduje výrazné změny absorpčního spektra v závislosti na pH. Jako optimální vlnovou délku pro toto stanovení volíme takovou, při níž je největší rozdíl absorbancí spektra změřeného v silně kyselém a silně bazickém roztoku, t.j. mezi plně disociovanou a plně nedisociovanou formou sloučeniny. Změříme tady absorbanci látky v plně disociované formě (v naší úloze v roztoku NaOH o koncentraci 0,01 mol.l-1 ) a ve formě, kde je disociace zcela potlačena (v našem případě v roztoku HCl o koncentraci 0,01 mol.l-1 ). Pro absorbanci látky platí Lambert-Beerův zákon A = e.c.l , [2] kde A je absorbance, e je molární absorpční koeficient, c koncentrace látky a l délka vrstvy, kterou záření prochází, t.j. v praxi šířka kyvety. Pro absorbanci fenytoinu v plně disociované formě, t.j. v roztoku silné baze lze psát AA= eA. [A]. l = eA. cF . l , [3] kde cF je celková koncentrace fenytoinu, protože veškerá látka je za těchto podmínek disociována, tzn. [A] = cF . Pro absorbanci fenytoinu v plně nedisociované formě platí obdobně AHA = eHA . [HA] . l = eHA . cF . l , [4] OO2N H N N N H O O B OO2N H N N N O O BH+ + Mr =238,16 protože veškerá látka je v nedisociované formě, tzn. [HA] = cF . Změříme dále absorbance sady roztoků nitrofurantoinu s pH odstupňovaným tak, aby v nejkyselejším z nich byla látka prakticky úplně ve formě HA a v nejbazičtějším téměř zcela ve formě A. Pokud jsme schopni hodnotu pKa nějak odhadnout, např. na základě analogií nebo výpočtem pomocí vhodného programu pro predikci disociačních konstant, měla by hodnota pH číselně odpovídající odhadu pKa ležet přibližně ve středu intervalu pH měřených roztoků. Pro absorbanci každého takového roztoku platí A = eA. [A] . l + eHA . [HA] . l [5] Řešením rovnic [2]-[5] dostaneme pro poměr rovnovážných koncentrací v měřených roztocích [HA] / [A- ] [HA] / [A] = (AA - A) / (A - AHA ) [6] Dosazením vztahu [6] do rovnice [1] dostaneme pro hledané pKa vztah pKa = pH - log {(AA - A) / (A - AHA )}[7]] Postup 1.Příprava roztoků Ze základních roztoků fosfátových pufrů o koncentraci 0,1 mol.l-1 a pH 6,6 – 7,8 naředíme sadu pracovních roztoků pufrů o koncentraci 0,01 mol.l-1 , na stejnou koncentraci naředíme roztok kyseliny chlorovodíkové a hydroxidu sodného. Připravíme 100,00 ml základního roztoku nitrofurantoinu v acetonu o koncentraci 0,005 mol.l-1 . Nitrofurantoin je v roztoku fotolabilní, proto chráníme odměrnou baňku se základním roztokem před světlem hliníkovou fólií a pracujeme co nejrychleji. Do sady 9 odměrných baněk odpipetujeme po 0,5 ml základního roztoku nitrofurantoinu a doplníme baňku po rysku příslušným roztokem kyseliny, pufru nebo hydroxidu. Obdobně připravíme sadu porovnávacích roztoků („blanks“), pouze s tím rozdílem, že odpipetujeme po 0,5 ml čistého acetonu. 2. Měření na jednoduchém UV-VIS spektrofotometru Jenway 6305 Zapneme spektrofotometr vypínačem vzadu a necháme proběhnout všechny testy. Zapneme počítač, přihlásíme se do Windows a spustíme software 63-Zero. V záložce ConcentrationMethod zadáme vlnovou délku 410 nm a potvrdíme Update Instrument. Do prostoru pro kyvetu vložíme kyvetu naplněnou příslušným porovnávacím roztokem a v záložce Measure klikneme na Cal to blank. Je-li v okénku Auto-read jakékoliv číslo, vymažeme ho. Pak vypláchneme kyvetu malým množstvím roztoku vzorku a naplníme kyvetu tímto roztokem. Kliknutím na Read změříme absorbanci. Dvojice porovnávací roztok-vzorek měříme zásadně v pořadí, jak jednotlivá pH následují po sobě, vzestupně nebo sestupně, ale pořadí důsledně zachováváme, a hodnoty absorbance ihned zapisujeme. Mezi měřeními po sobě jdoucích dvojic opakovaně proplachujeme kyvetu malým objemem následujícího porovnávacího roztoku. Takto postupně změříme všechny roztoky počínaje roztokem v kyselině, následují jednotlivá pH od nejnišího po nejvyšší, a končíme roztokem v hydroxidu (nebo opačně, ale důsledně). Bez dodržení pořadí pH se jednak budete těžko orientovat v naměřených hodnotách, ale rovněž bude větší chyba měření, způsobená změnou pH mícháním roztoků se zbytky předchozího. Naměřená data lze vymazat pouze zavřením a novým otevřením 63-Zero. Měření na UV-VIS spektrofotometru Hewlett-Packard 8453 Po zapnutí počítače se po nastartování Windows objeví políčko, požadující jméno operátora a heslo. Zrušíme je položkou Cancel. Jakmile se v dolní liště Windows objeví políčko Bootup server, zapneme spektrofotometr. Poklepáním na ikonu HP UV-Visible Chem Station on line spustíme program, ovládající spektrofotometr. Sledujeme hlášení v dolní části obrazovky. Svítí-li v pravém dolním rohu modré políčko s nápisem busy, počkáme s další činností, až zmizí. V položce Instrument horní nabídky zvolíme Lamps a přesvědčíme se, není-li zapnuta deuteriová výbojka, která je zdrojem ultrafialového záření, jež pro měření ve viditelné oblasti nepotřebujeme (u Deuterium lamp musí být vybráno OFF). Wolframovou žárovku zapneme nebo necháme zapnutou (Tungsten lamp ON). V položce Task zvolíme Fixed wavelenghts a v nabídce Setup vepíšeme do tabulky jedinou vlnovou délku 410 nm. Kliknutím zaškrtneme políčko Prompt for sample information. Rozsah zobrazení spektra Display spectrum zvolíme od 370 do 450 nm. Volby potvrdíme tlačítkem OK. Při vlastním měření vždy dvakrát vypláchneme kyvetu porovnávacím (slepým) roztokem, naplníme tímto roztokem a umístíme do držáku přístroje (není nutné kyvetu zcela zasouvat, špatně se pak vyndává) a přitáhneme páčkou po straně držáku. Kliknutím na tlačítko Blank změříme spektrum slepého roztoku, které se objeví na obrazovce v okně nadepsaném Last blank spectrum. Stejným způsobem změříme spektrum vzorku, jen klikneme na tlačítko Sample a do políčka Name v okně Sample information, které se následně objeví, zapíšeme pH pufru a potvrdíme OK. Takto změříme absorbance všech 9 roztoků proti jejich porovnávacím roztokům. Zvolením položky File a následně Print results vytiskneme naměřená spektra a tabulku absorbancí. (Lze použít i ikonku s tiskárnou.) 3. Výpočet pK a Dosazením do vztahu [7] vypočteme hodnoty pKa pro 7 pufrovaných roztoků a výslednou hodnotu pKa získáme jako jejich průměr. Úkoly: 1. Stanovte pKa disociaciace N-H imidazolidindionového kruhu nitrofurantoinu. 2. Jaké bude procentuální zastoupení disociované formy látky v krevní plazmě při pH = 7,4 ? 3. Jaké bude procentuální zastoupení disociované formy látky v tenkém střevě při pH = 8,0 ? 4. K jaké další disociaci může ještě v organismu u nitrofurantoinu docházet ?