17.4.2020
1
Ústav chemických léčiv, Farmaceutická fakulta VFU,
Palackého 1/3, 642 12 Brno
Doc. Ing. Pavel Bobáľ, CSc.
Organická chemie
25. Biomolekuly:
aminokyseliny, peptidy a
bílkoviny
2
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
Bílkoviny (proteiny) – dlouhé řetězce – z mnoha aminokyselinových jednotek
- bazická aminoskupina a kyselá karboxylová skupina
2
Úvod
H3C
OH
O
H2N H
alanin
- peptidy – řetězce menší než 50 aminokyselin
- proteiny – řetězce větší než 50 aminokyselin
amidové vazby
mnoho
3
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
- struktura betainů, zwitteriontů
3
Struktura aminokyselin
H3C
OH
O
H2N H
H3C
O
O
H3N H
+
-
alanin
(bez náboje) (zwitterion)
- dipolární ionty – vnitřní soli,
- velké dipólové momenty, rozpustné ve vodě, nerozpustné v organických
rozpouštědlech, krystalické látky s vysokými teplotami tání
- amfoterní – reagují jako kyseliny i jako báze
4
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
4
Struktura aminokyselin
H3C
O
O
H3N H
+
-
(zwitterion)
+ H3O+
H3C
OH
O
H3N H
+
+ H2O
H3C
O
O
H3N H
+
-
(zwitterion)
+ OH- H3C
O
O
H2N H
+ H2Ov
kyselém prostředí
v bazickém prostředí
R
O
O
H3N H
+
-
postranní
řetězec
O
O
-
N
H
H
H
+
prolin
sekundární -aminokyselina
primární -aminokyselina
17.4.2020
2
5
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
5
Struktura aminokyselin
H3N
O
O
-
+
HS
O
O
-
+
NH3
O
O
-
+
NH3
O
I
I
HO
I
I
-aminomáselná kyselina
(GABA)
homocystein thyroxin
COO
(S)
CH3
HH3N
+
- COO
(S)
CH2OH
HH3N
+
- COO
(R)
CH2SH
HH3N
CHO
(S)
CH2OH
HHO
+
-
L-alanin
(S)-alanin
L-serin
(S)-serin
L-cystein
(R)-cystein
L-glyceraldehyd
Fischerova projekce – L-aminokyseliny
Nebílkovinné aminokyseliny – biologicky aktivní
6
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
6
Struktura aminokyselin
- 20 aminokyselin – nezbytných pro lidský organismus
- 10 - esenciální aminokyseliny
- 15 neutrálních aminokyselin
- 2 kyselé aminokyseliny
- 3 bazické aminokyseliny
NH3
COON
N
H
+
-
bazický:
pyridinového
typu
nebazický:
pyrrolového
typu
imidazolový kruh
histidin
7
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
Izoelektrický bod – pI – pH neutrálního dipolárního iontu
7
Izoelektrický bod
H3N R
COO
+
H2N
R
COO
H3N
R
COOH
+
H3O+ -
OH
nízké pH
(protonovaná)
vysoké pH
(deprotonovaná)
izoelektrický bod
(neutrální dipolární ion, zwitterion)
pH
Elektroforéza
8
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
Acetamidomalonátová syntéza
8
Syntéza aminokyselin
OH
O
OH
O
Br
OH
O
NH2
4-methylpentanová
kyselina
2-brom-4-methylpentanová
kyselina
(R,S)-leucin (45 %)
1. Br2, PBr3
2. H2O
NH3
N
H
COOEt
O COOEt
COOEt
COOEt
HOOC
NH2
COOH
NH
EtOOC
O2. BrCH2COOEt
1. NaOEt H3O+
zahřívání
diethyl-acetamidomalonát (R,S)-asparagová
kyselina (55 %)
17.4.2020
3
9
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
Reduktivní aminace α-ketokyselin
9
Syntéza aminokyselin
O
COOH COOH
NH2H
pyrohroznová kyselina (R,S)-alanin
NH3
NaBH4
10
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
- amidové (peptidové) vazby
- dipeptid
10
Peptidy a bílkoviny
11
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
- sekvence atomů -NH-CH-CO- - řetězec (backbone – páteř))
- N-koncová (N-terminální) aminokyseliny – vždy vlevo
- C-koncová (C-terminální) aminokyseliny – vždy vpravo
11
Peptidy a bílkoviny
12
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
12
Kovalentní vazba v peptidech
N
H
H
N
N
H
H
N
N
H
R1
O R2
O R3
O R4
O R5
O
různé postranní řetězce
C-konecN-konec
amidové vazby
Bílkovina
17.4.2020
4
13
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
13
Kovalentní vazba v peptidech
N
O R H
RH H
N
O R H
RH H
-
+
omezená rotace
N
O R H
RH H
-
+
planární
Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2
S S
disulfidový můstek
vasopresin
N (R)
S
S
(R)
N
H
O H
OH2N
NH2
H
H
disulfidová vazba
N (R)
SH
HS
(R)
N
H
O
H
O
H2N
NH2
H
H
cysteinové zbytky
+
14
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
- analyzátory aminokyselin - ninhydrin
14
Stanovení struktury peptidů: aminokyselinová analýza
O
O
OH
OH
O
OH
R
H2N+
O
O
N
O
O
-
O
R H
CO2+ +
ninhydrin -aminokyselina (purpurové zabarvení)
OH
H2O
-
15
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
Určení sekvence – Edmanovo odbourávání (omezení 50 cyklů)
15
Stanovení sekvence aminokyselin: Edmanovo odbourávání
peptid
RH2N
O
H
NS
C
N
Ph
PITC
+
peptid
RN
O
H
N
N
HS
Ph
peptid
RN
H
N
N
S
Ph
OH
peptid
RN
H2N
N
S
Ph
H H
H
O
+
HCl
H3O+
RNS
N
H
OPh
N-fenylthiohydantoin
(PTH)
anilinothiazolinon
(ATZ)
16
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
Určení sekvence – Edmanovo odbourávání (omezení 50 cyklů)
- enzymatická hydrolýza – fragmenty – kratší peptidy
16
Stanovení sekvence aminokyselin: Edmanovo odbourávání
Val-Phe-Leu-Met-Tyr-Pro-Gly-Trp-Cys-Glu-Asp-Ile-Lys-Ser-Arg-His
chymotrypsin štěpí tyto vazby trypsin štěpí tyto vazby
17.4.2020
5
17
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
enzym – karboxypeptidasa – selektivní štěpení C-koncových aminokyselin
17
Stanovení sekvence aminokyselin: určení C-koncové
aminokyseliny
H
N
OH
O
RO
N
H
R'
peptid
H2O
karboxypeptidasa
H2N
OH
O
RO
N
H
R'
peptid OH +
Proteomika – hmotnostní spektrometrie
18
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
Biokatalyzátory – látky (biologické povahy), které snižují nebo modifikují rychlost
chemické reakce v živých organismech, beze změn v jejich struktuře
- enzymy (proteiny)
- ribozymy (nukleová kyselina) – můžou mít enzymatickou funkci
- první zmínky (18. století) – kvasné procesy – fermenty,
- Berzelius (1835) – tisíce katalyzovaných reakcí probíhá v rostlinách
a živočiších, schopnost sladu štěpit škrob,
- Pasteur (1860) – kvašení způsobeno fermenty – spojení s buňkou,
- Kühne (1878) – „en zymé“ = v kvasnicích,
- Sumner (1926) – bílkovinná povaha enzymů
18
Enzymy
19
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
Enzymy - jsou obvykle vysokomolekulární bílkoviny, které působí jako katalyzátory
biochemických reakcí (katalyzují chemické přeměny v živých organismech),
- jako všechny katalyzátory ani enzymy neovlivňují polohu rovnováhy a nemohou
vyvolat reakci, která je jinak nevýhodná,
- enzymy určují povahu a rychlost chemických reakcí a vytvářejí tak v živých
organismech harmonickou souhru chemických funkcí,
- aktivita enzymů spočívá v ovlivnění rychlosti chemických reakcí snižováním
aktivační energii reakce, dochází k urychlení chemických reakcí (glykosidasa působí
při hydrolýze polysacharidů, zvyšuje reakční rychlost > 1017 krát - doba
reakce z miliónů let → milisekundy),
- aktivita enzymů je závislá zejména na koncentraci substrátu, teplotě, pH,
aktivátorech nebo inhibitorech,
19
Enzymy
20
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
- enzymy (na rozdíl od mnoha katalyzátorů používaných v laboratoři) jsou obvykle
vysoce specifické,
- často mohou katalyzovat pouze jedinou reakci jediné sloučeniny, která se
označuje jako substrát pro daný enzym - amylasa v lidském zažívacím traktu
katalyzuje pouze hydrolýzu škrobu na glukosu (celulosa a další polysacharidy
se nemění),
- enzymy se liší svou specificitou - specifické (amylasa) pro jediný substrát,
- méně specifické - působí v určitém okruhu
substrátů (papain, globulární protein s
212 aminokyselinami, hydrolýzu mnoha druhů
peptidových vazeb,
- většina z ~ 3 000 známých enzymů jsou globulární bílkoviny (rozpustné),
20
Enzymy
17.4.2020
6
21
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
21
Enzymy
- kromě bílkovinné části má většina enzymů v molekule i nízkomolekulové
neaminokyselinové části, nazývané kofaktory,
- je-li pevně vázán na bílkovinnou složku enzymu, můžeme je považovat za
stavební součást molekuly - prostetická skupina (riboflavinové složky
u flavinových transhydrogenas, pyridoxalfosfát u aminotransferas, hem
u cytochromů),
- bílkovinná část takových enzymů se označuje apoenzym a kombinace
apoenzymu s kofaktorem je holoenzym,
holoenzym = apoenzym + kofaktor
- biologicky aktivní je pouze holoenzym, (kofaktor a apoenzym samotné – inaktivní),
- kofaktory mohou být buď anorganické ionty, např. Zn2+, nebo menší organické
molekuly, označované jako koenzymy,
22
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
22
Enzymy
- funkční závislost mnoha enzymů na přítomnosti anorganických kofaktorů
vysvětluje, proč je pro nás nezbytný přísun stopových prvků z potravy,
- ionty železa, zinku, mědi, manganu, selenu a mnoha dalších kovů patří mezi
esenciální minerální látky, potřebné jako kofaktory enzymů, jejich biologická
funkce není dosud úplně známá,
- koenzymy - rozmanité organické sloučeniny (NAD, NADP, …),
- v mnoha případech jsou to vitaminy, nízkomolekulární organické sloučeniny
potřebné ve stopových množstvích, které je nutno dodávat organismu potravou
je nutno dodávat organismu potravou,
23
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
23
Enzymy
- mezi kofaktory oxidačně-redukčních enzymů mají významné postavení pyridinové
koenzymy (NAD+, NADP+) známé již od roku 1906,
- jsou to dinukleotidy skládající se z nikotinamidové, adeninové a ribosyldifosforibosové
části, popř. ještě třetí fosforylové skupiny,
NAD+ NADP+
N
Ribosa
O
NH2
N
Ribosa
O
NH2
HH
NAD+
NADH
24
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
24
Enzymy
Struktura enzymů:
Enzymy = bílkoviny (+nebílkovinná část)
- primární – sekvence aminokyselin v polypeptidickém řetězci, podmiňuje
vlastnosti bílkovin a jejich biologickou funkci,
- sekundární – geometrické uspořádání polypeptidického řetězce (forma
α-helixu, skládaného listu, …),
- terciární – uspořádání α-helixu, skládaného listu, … do konečného
prostorového tvaru molekuly bílkoviny - trojrozměrné uspořádání,
- fibrilární (tvar vlákna)
- globulární (tvar klubka)
- kvartérní – vzájemné prostorové uspořádání subjednotek (několik peptidických
řetězců) v proteinových aglomerátech
17.4.2020
7
25
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
25
Enzymy
Specificita enzymů
- substrátová (vazebná)
– absolutní (ureasa)
– relativní (skupinová) – glukosa/fruktosa (hexokinasa),
– ethanol/methanol (ADH)
- reakční
– deaminace, dekarboxylace, transaminace, dehydrogenace, …
– závisí na apoenzymu i koenzymu,
- stereospecificita – R-, S- (D-, L-)
26
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
26
Enzymy
E + S E + PE - S E - P
Substrát
Enzym EnzymEnzym-substrát
komplex
Enzym-produkt
komplex
aktivní místo
Produkt
Mechanismus katalytického působení enzymů
27
25. Biomolekuly: aminokyseliny, peptidy a bílkoviny
Organická chemie
27
Enzymy
Mechanismus katalytického působení enzymů
nekatalyzovaná reakce
katalyzovaná reakceEnergie