Josef Skopalík Přednáška F1SB1 (27. 4. 2023) Kódování proteinů a mutace (aneb vybranné související analýzy DNA, RNA a proteinu v praxi) !! DOMÁCÍ ÚKOL – za extra body ke zkoušce !! Je zadán na konci této prezentace - Odevzdání možné 11.5. na přednášce nebo do 15.5. v IS.MUNI (využijte prezentace z různých týdnů) • O čem to dnes bude: A) Úvod - opakování o DNA a RNA kódu B) První analytická metoda – PCR C) Druhá analytická metoda – DNA idnetifikace D) Struktura DNA a možné mutace, které se propisují do proteinů (A) Úvod • Proteiny vznikají v každé buňce na základě genetického kódu primární kod DNA, následuje přepis do RNA a translace do proteinu DNA (dlouhodobý kód proteinu) a RNA (krátkodobý kód) Komponenty („kodovací písmena“) v DNA a RNA: Adenine(A), Guanine(G), Cytosine(C), Uracil (U) and Thymine (T) DNA: A, G, C, T RNA: A, G, C, U How is the code of RNA recoded to amino-acid DNA a transkript RNA v různých buňkách • !!! Každá buňka má identické DNA ve svém jádře, ale rúzné specifické buňky přepisují jen určitou část genetické informace: Například: úsek s genetickým kodem pro tropomyosin -- velký rozdíl mezi neuronem v mozku a svalovou buňkou RNA se ve stejném typu buněk nemusí generovat stejně: Produkce mRNA v sadě B-lymfocytů nacházejících se různě po tělě VYUŽITÍ RNA a DNA v klinické a technické (kriminální) praxi Pozn: obecně na analýzu DNA i RNA existují dvě skupiny metod: 1) „ABSOLUTNI METODA“ - nazývaná odborně SEKVENOVÁNÍ DNA nebo RNA (docela drahé a pomalé) (v Brně díky jednomu panu profesorovi též povolen název sekvencování, ve zbytku ČR se moc ale neužívá) je souhrnný termín pro metody, které umožňují popsat pořadí nukleotidů v určitém úseku DNA. Tedy i absolutní pořadí v celém genomu daného jedince (protože DNA je v principu jednorozmerný provázek genů a balastního kodu v řadě za sebou == 3.2 miliardy nukleotidů) V praxi jsou dnes používány především dvě metody založené na replikaci DNA – starší Sangerova sekvenace a novější, principem složitější sekvenování nové generace – Next Generation Sequencing. Těmito sekvenačními metodami se v této přednášce nebudeme zabývat. 2) „METODA HLEDÁNI SPECIFICKÉHO OTISKU PRSTU v kupce sena“ - nedetekujeme absolutní sekvenci nějakéo useku DNA, nýbrž známe nějaký gen předem a využíváme tzv. PRIMER, tj. jeho „otisk jeho palce“ tedy zrcadlovou DNA, která „přesně komplementárně pasuje“ na specifickou sekvenci na začátku hledaného genu, respektive využívá i nějakou navazující laboraotrní metodiku, která detekuje navázání PRIMERU a eventuelně kvantitativní určení kolik takových genetických kodu v buňce je (musíme samozřejmě vybrat takový PRIMER, která náhodou nemá i jiný gen) ---- na základní metody „hledání v kupce sena“ se podíváme blíže PCR (B) Analytická metoda 1 - tzv. PCR …aneb jak zjistit zda danou sekvenci (například mutaci) pacient nebo podezřelý má ve svém DNA nebo nemá??? PCR • Například potřebujeme ověřit zrovna tento úsek (např odpovědný za vadný protein inzulin) PCR • Přečíst u daného pacienta celý genom písmeno po písmenu a najít přesně tuto sekvenci by bylo časově nereálné a příliš drahé. Proto se v klinice ujala PCR neboli Polymerázová řetězová reakce (anglicky polymerase chain reaction) PCR Co potřebujeme v laboratoři na PCR 1) Primer pairs (laicky řečeno „značku“ kterou má daný hledaný gen na svém předním a zadním „nárazníku“, podobně jako SPZ hledaného automobilu) : Primers are short oligonucleotides (synthetic short DNA strand), which complement the target sequence and bind to the single-stranded DNA. These primers are short compared to the template, only 20-40 nucleotides long (18 nucleotides minimum). Pairs of primers are employed in each reaction, but they should have melting temperature (Tm) values within 5°C of each other. Large variation in the Tm of a primer pair results in poor amplification. Primers should contain 50% GC (guanosine-cytosine content)-content (Tm 56-62°C), ideally. This content predicts their annealing temperature to the template; higher GC-levels correlate with a high Tm. A lower Tm will result in nonspecific products and a high Tm will result in decreased amplicon yield. In addition, perfect base pairing between the template and the 3' end of the primer is critical. Each reaction should contain no more than 0.05-0.1µM of each primer at final concentration. 2) dNTPs: DNA polymerase requires deoxynucleotide triphosphates – also known as dNTPs – the nucleic acid components, or nucleotide bases - adenine, thymine, cytosine and guanine (A, T, C, G) - to generate new DNA. In general, 20-200μM (50μM of each is ideal) of each dNTP should be included in the reaction. Excess dNTPs inhibits polymerase activity; whereas low dNTP concentration enhances the fidelity of polymerization but reduces the amplicon yield. Longer target sequences may require an increase in dNTP concentration. However, one must keep in mind that as dNTP concentration increases, so does the amount of (Mg2+) needed for optimal :amplification. 3) DNA polymeraseDNA polymerase is a thermostable enzyme that synthesizes copies of DNA with every consecutive cycle of PCR. Polymerases are responsible for binding free nucleotides complementary to the template DNA. The enzyme first binds and adds a nucleotide to the 3'-OH group of the primer. The polymerase then moves in a 5'->3' direction, constantly adding dNTPs. It’s necessary for the polymerase to come from alternate organisms from humans or other common vertebrates so the enzyme won’t be broken down at the temperatures required to denature DNA during the PCR reaction. As such, bacteria from hot springs have provided some of these polymerases Tyto tři komponenty přidáme k DNA pacienta (analyzovaná DNA), vše se vejde do malé ependorfky a vložíme do zařízení, které precizně zahřívá a ochlazuje obsah ependorfky …začneme tzv „cyklovat“ • PCR Úsek DNA = Gen který hledáme (zda je ve vzorku nebo není ve vzorku) Tedy daný úsek, pokud je ve vzorku, se množí a množí … • Stále dokola cyklujeme: Celkové zjednodušené schema PCR v čase: PCR • Po deseti cyklech můžeme většinou „makroskopicky“ (elektroforéza, spektofotometrie) stanovit zda se v ependorfce specifický produkt výrazně zmnožil nebo ne. • Obdobně jako DNA můžeme analyzovat například i RNA specifickou sekvenci v lyzátu tkáně či nádoru. Ale zde je potřeba tzv. reverzní PCR (neboť RNA nemá v přírodní formě dvouřetězec) Touto metodou pak například lze zjistit zda v dané buňce se určitý úsek přepisuje málo, moc nebo vůbec (případně porovnávat jak je to před léčbou a po léčbě) DNA idnetifikace (C) Analytická metoda 2 - srovnání DNA vraha z místa činu a DNA podezřelého …aneb jak zjistit ze zajištěné stopy na místě činu, že DNA se shoduje s nějakým konkrétním podezřelým sousedem ??? DNA dvou lidí se liší jen ve variabilních usecích, zbytek přes 99% mají všichni lidé stejný Opět bychom tedy museli sekvenovat a zapisovat celý genom u obou získaných vzorků ??? Ne, není třeba… DNA identifikace Jde do chytře jinak: Policejní laboratorní přístroje (opět fungují na principu PCR) mají naprogramováno, že v celé dlouhé DNA, kterou dostanou ve zkumavce ze stěru vzorku, musí pomoci speciálních specifických „chemických nůžek“ (detaily například v /publikaci Slabý 2015 níže/ ) vystřihnout jen specifické geny – názvy těchto genů viz dále --- a velmi zjednodušený příklad jaký je technologický princip, aby tento gen v provazci byl poznán je na následujícím obrázku (tento gen je zde například ohraničen zleva i zprava velmi specifickou sekvencí TTATT) /5/ SLABÝ, Ondřej. Molekulární medicína. Praha: Galén, c2015. ISBN 978- 80-7492-121-6. DNA identifikace V momentě, kdy analytický stroj vysekne tento specfický gen pro „vrahův vzorek“ (Obr.3-A) a kdy následně stroj vysekne tento gen pro „vzorek podezřelého souseda 1“ (Obr 3-B), tak stroj prokazatelně detekuje, že písmena v tomto genu (kombinace A,T,C,G) jsou jiné u vraha a jiné u souseda1 • • Obr. 3-A (Gen z DNA zanechané vrahem na místě činu) • ….. TTATT ACA ATA ACA ATA CCA TTATT …. • Obr. 3-B (Gen z DNA podezřelého SOUSED 1 ) • ….. TTATT ATA ATA ACA ATA ATA ATA TTATT …. • Má nejen jiné složení kódu, ale i o tři báze delší celkovou délku (vrah = 15 bazí, soused 1 = 18 bazí) DNA identifikace Policejní metody byla unifikovány díky mezinárodním dohodám – tak aby každý stát neanalyzoval vlastní geny, ale aby byly vybrány srovnatelné úseky („čili stejné geny ve všech státech“) a pak lehce porovnatelné DNA profily mezi státy. Používají se již dvacet let tzv. specifické úseky DNA se SEKVENČNÍM NEBO DÉLKOVÝM POLYMOERFISMEM --- zde například kit firmy Biosystems a názvy úseků: DNA identifikace Vidíme, že ještě v prvních letech tohoto století bylo využití DNA prakticky skoro nulové, několik desítek analýz ročně, zhruba od roku 2010 už ale očividně dosáhlo užití DNA analýz velkého rozmachu Pro základní rychlou a levnou prvotní identifikaci a vyloučení podezřelých na začátku pátránívetšinou policisté například použijí jen jeden úsek (např. CSF1PO), až když vyjde u některého podezřelého shoda s danýmusekem DNA z místa činu, proveří se i další sada DNA úseků. Pokud se nakonec shoduje ve všech, jedná se pevný dúkaz pro soud , že jde o daného pachatele (nebo eventuálně jeho jednovaječné dvojče– pak právníci umí zázraky a laboratorní dákazy nestačí) DNA analýzy se hojně používají teprve od 90. let v USA, v Evropě a jinde zhruba až od konce 20. století. Díky biologickýmarchivům vzorků, se však zpětně můžeme vrátit a analyzovat i stopy z vražd a krádeží i 40 let starých., jakmile se nově najde nějaké svědetví a podezřelá osoba. DNA ve zkumavce ve dvoušroubovici i při pokojové teplotě vydrží století, v mrazáku ještě déle. Mutace (D) MUTACE a JEJICH DETEKCE --mutace je změna genetického kódu v jádře, která se může projevit nejčastěji jako: a) Nemožnost smysluplně přepsat DNA do proteinu (protein pak chybí = narušení metabolismu nebo přímo smrt organismu) b) Možnost přepsat, ale sekvence aminokyselin v proteinu je nepřirozená (někdy protein i tak funguje, ale většinou je abnormálně málo nebo abnormálně moc aktivní oproti tzv. wilde type) Mutace Vybrané metody detekce mutací: Mutace • Vybrané metody detekce mutací: Hodně používaný u barvení specifických mutací u typizace leukemií Mutace I bodová mutace (mutace jedné aminokyseliny) může výrazně ovlinit aktivitu enzymu (důležité například pro metabolizování nějakého farmaka ) Například CYTOCHROM P450 2C9 (matobolizuje například warfarin) : u pacientu s mutací jediná záměna R144 za C144 (arginin zmutován na cystein) ovlivní geometrii vodíkových můstkú a tedy rychlost vstupu warfarinu do centra enzymu (a tím pádem kinetiku přeměny a hladinu v organismu pacienta) (obrázek z vizualizačního in silico softwaru – 3D náhled na alfa helix D a vstup do akt. místa) Mutace Mnoho mutací paradoxně nezdegradují sekundární a terciální strukturu enzymů, enzym si zachová relativně stejný tvar, avšak změna je například jen v zúžení nebo polaritě kanálu do aktivného místa ---často bylo pochopeno a až po namodelování tzv. IN SILICO pomoci simulačního softwaru. Například in silico simulace v těchto farmakologických publikacích: [HTML] Comparison of the inhibitory effects of azole antifungals on cytochrome P450 3A4 genetic variants Y Yamaguchi, T Akiyoshi, G Kawamura… - Drug metabolism and …, 2021 (PDF) Computer-Aided (In Silico) Modeling of Cytochrome P450-Mediated Food–Drug Interactions (FDI) Y Guttman, Z Kerem - International Journal of Molecular Sciences, 2022 - mdpi.com [PDF] Computational analysis of missense variant CYP4F2* 3 (V433M) in association with human CYP4F2 dysfunction: A functional and structural impact MF Dehkordi, L Mafakher, F Samiee-Rad, B Rahmani - 2022 Mutace Podrobné info o všech známých lidských proteinech a jejich mutacích lze najít na databázi NIH: Stačí zadat klíčové slovo např: INSULIN nebo CYTOCHROM 2C9 Mutace • Řada mutovaných enzymů má i své mezinárodní medicinské označení, např varianty P450 2C9: Zdrojový článek: Functional Characterization of Pharmcogenetic Variants of Human Cytochrome P450 2C9 in Korean Populations Article --Sep 2019 -- Myung-A Cho Mutace Vnější faktory mohou způsobit v DNA jen klasickou mutaci (záměnu nukleotidů, deleci či přehození sekvence), při malém množství má buňka často opravné mechanismy. Ale velký stresor může také způsobit „slepení“ DNA (nemožnost přepisu), degradaci celého velké části chromozonu nebo enzymů a pomocných proteinů potřebných pro přepis (pak často buňka vyhodnotí situaci a nastartuje buněčnou smrt, např po smrtelné dávce UV nebo gama záření) • I některé protinádorové léky defacto cíleně působí degradaci nebo konzervaci DNA a brání tak přepisu resp. replikaci DNA a dělení nádorové buňky Závěr k mutacím: Obecné působení stresorů na DNA Domácí úkol - za body 29. 505820 122 P450 2C9 30. 509486 240 P450 3A4 31. 507337 P450 2D6 32. 506830 196 P450 2C9 33. 509416 310 P450 3A4 34. 509464 262 P450 2D6 35. 516529 338 P450 2C9 36. 509490 236 P450 3A4 STUDENT aminokyselina Protein 1. 509491 235 P450 3A4 2. 509493 233 P450 2D6 3. 505990 36 P450 2C9 4. 495244 14 P450 3A4 5. 507466 211 P450 2D6 6. 509438 288 P450 2C9 7. 509470 256 P450 3A4 8. 509406 320 P450 2D6 9. 509474 252 P450 2C9 10. 509407 319 P450 3A4 11. 505392 122 P450 2D6 12. 509502 224 P450 2C9 13. 509446 280 P450 3A4 14. 509447 279 P450 2D6 15. 509397 329 P450 2C9 16. 509479 247 P450 3A4 17. 509482 244 P450 2D6 18. 509452 274 P450 2C9 19. 509483 243 P450 3A4 20. 509453 273 P450 3A4 21. 509454 272 P450 3A4 22. 509411 315 P450 2D6 23. 464772 54 P450 2C9 24. 509456 270 P450 3A4 25. 516530 44 P450 2D6 26. 505802 99 P450 2C9 27. 505688 33 P450 3A4 28. 509505 221 P450 2D6 • Domácí úkol: Každý student nalezne v tabulce své učo. Ke každému uču je zadán jeden protein (nějaký cytochrom P450) a pozice aminokyseliny. Úkolem je nalézt pomoci PDB.org a napsat co je na této pozici za aminokyselinu, nalézt v 3D náhledu zda je aminokyselina součástí alfa-helixu a zapsat genetický kód této aminokyseliny (primární kod DNA). Tři tyto jednoduché odpovědi dá každý sám za sebe do txt souboru nebo wordu a vloží do odevzdávárny v IS.MUNI do 15. května 2023. (za správné řešení extra 3 bonus body na zkuškový test)