Biotechnologie léčiv – Základy genového inženýrství I. Doc. RNDr. Jan Hošek, Ph.D. hosek@mail.muni.cz Ústav molekulární farmacie FaF MU Studijní materiály • Prezentace PřF:Bi8090 Genové inženýrství Zajímavá stránka http://learn.genetics.utah.edu/ https://learn.genetics.utah.edu/ 1. Klasickým biotechnologickým postupem  křížení  mutageneze populace buněk  selekce buněk/organismů s vhodnými vlastnostmi  nelze jimi přinutit organismus, aby produkoval protein, který mu není vlastní 2. Genovým inženýrstvím - rekombinantní DNA technologií  klonování genů → technologie rekombinantní DNA  genetické manipulace in vitro  boří bariéry mezi druhy → heterologní systémy Biotechnologický produkt může vzniknout: Snaha geneticky zakódovat syntézu komerčně výhodného produktu do organismu, který jej bude produkovat levně a s vysokým výtěžkem. Cíl rekombinantních technologií 2000 kg slinivky 200 mL inzulínu Rekombinantní technologie - klonování genů - potřebuje začlenění cizorodé DNA do hostitelské buňky  vnesení DNA (transformace) do buňky  zabezpečení přežití cizorodé DNA  schopnost replikace  zajištění exprese Základní principy rekombinantních technologií  vlastní gen – fragment DNA  vektor – plasmid, fág, kosmid  hostitel – příjemce rekombinantní DNA  inzert = gen začleněný do vektoru  rekombinantní DNA = vektor s inzertem Co je potřeba pro klonování genů https://microbenotes.com/gene-cloning-requirements-principle-steps-applications/ Permanentní dědičná změna v genetickém materiálu buňky způsobená přijetím a začleněním cizí genetické informace Zdroje cizí genetické informace živočišný rostlinný mikrobiální syntetický  schopnost replikace  schopnost exprese Důsledek klonování genů = transformace Rekombinantní protein může být:  Finální produkt (např. hormon, protilátka)  Nástroj pro další syntézu (např. různé enzymy) Jak získat gen nebo jeho fragment? Izolovat DNA v nativním stavu (viz Metody mol. biol.) Opracovat enzymy Provést PCR Přímá syntéza Pouze klonovat A jak postupovat dál? 2) Mám jí v dostatečném množství a kvalitní? a) Opracovat DNA enzymy (viz Metody mol. biol.) b) Provést PCR (viz Metody mol. biol.) ANO NE 1) Získal jsem nukleovou kyselinu? ANO NE Faktory ovlivňující expresi klonovaných genů Regulační sekvence pro genovou expresi 1. Transkripce a. Síla promotoru b. Terminátor transkripce c. Stabilita mRNA 2. Translace a. Struktura vazebného místa pro ribozom b. Využití kodonů 3. Transport proteinu a. Charakter signální sekvence Vlastnosti vektorů 1. Počet kopií vektoru v buňce 2. Stabilita vektoru Fyziologie hostitelské buňky 1. Růstové podmínky 2. Enzymový aparát hostitelské buňky Vlastnosti inzertu • Obsahuje kódující sekvenci • Obsahuje začátek translace (start kodon ATG) • Obsahuje konec translace (stop kodon) • Nese vhodné kodony pro konkrétní aminokyseliny Signály ovlivňující transkripci a translaci strukturního genu prokaryot Vliv vzdálenosti mezi promotorem a startem translace sekundární strukturu mRNA a na množství exprimovaného proteinu Možnosti zajištění vysoké proteosyntézy • Rychlost proteosyntézy závisí na množství mRNA v buňce • Modifikace v 3´-UTR nebo 5´-UTR mohou prodloužit poločas rozpadu mRNA • Sekvence PuPuUUUPuPu poblíž ShineDalgarnovy sekvence je nezbytná pro translaci eukaryotických genů v E. coli • Konstrukce homopolycistronických expresních kazet • Proteiny v periplasmě mají delší poločas než v cytoplasmě • Cílená inhibice specifických proteáz • Tvorba fúzních proteinů – protein z hostitelského organismu (stabilizující partner) + protein zájmu Vliv využívání kodonů • Různé druhy využívají kodony s různou frekvencí → souvisí s množstvím tRNA • Řešení: – Klonování vzácných tRNA spolu s genem zájmu – Záměna vzácných kodonů za běžné cílenou mutagenezí http://2014.igem.org/Team:Penn_State/CodonOptimization  Plasmidy  Bakteriofágy  Kosmidy  Umělé chromozómy  BAC (bacterial artificial chromosomes)  YAC (yeast artificial chromosomes) Vektory https://www.sciencedirect.com/topics/nursing-and-health- professions/artificial-chromosome Anatomie expresního vektoru 1) počátek replikace (ori), který je podmínkou produkce nových kopií 2) inducibilní promotor, který umožní regulovat expresi požadovaného proteinu 3) selekční znak, zajišťující zvýhodněný růst transformovaných bakterií 4) klonovací místo (MSC), umožňující vložit do plasmidu fragment cizorodé DNA Front. Microbiol., 17 April 2014 | https://doi.org/10.3389/fmicb.2014.00172 Příklady regulovatelných promotorů v expresních vektorech  extrachromozomální kružnicové dsDNA  výskyt u mnoha bakteriálních druhů  velikost 1 000 až 200 000 bp  nesou pouze geny kódující druhotné znaky (rezistence k antibiotikům)  autonomní replikace  velikost inzertu = do 25 kbp Plasmidy jako vektory Trend poslední doby → plasmid synthes on demand 1) malá velikost = schopnost transformace 2) stabilita plasmidu 3) velký počet kopií v buňce = výtěžek 4) snadná manipulace 5) „shuttle“ vektory = fungují ve více hostitelských druhů (např. E. coli + savčí buňky) Kritéria vhodnosti plasmidu https://www.genome.gov/genetics-glossary/Plasmid bla (ApR) rep MCS lacZα Plasmidy pUC18 a pUC19 MCS = multi-cloning site Polylinker pUC18 a pUC19 Expresní plasmid pIRES2-eGFP Vektory na bázi λ bakteriofágu  nahrazují plasmidy je-li třeba klonovat delší fragmenty DNA  Inzerční vektory 8 – 10 kbp  Výměnné vektory 8 – 24 kbp https://bio3400.nicerweb.com/Locked/media/ch19/lambda-vector.html  50 kbp dsDNA  lineární a kružnicová forma  místa cos Bakteriofág λ http://hotcore.info/babki/bacteriophage-lysogenic-cycle.html https://doi.org/10.1016/C2009-0-01986-2 Kosmidy  kombinace plasmidu a fága  prokaryotický počátek replikace oriV  selekční znak  klonovací místo  kapacita 37 - 52 kbp  místa cos bakteriofága λ  pro sbalení nutno přidat sbalovací proteiny  vstupuje jako fág  v buňce se chová jako plasmid  BAC = bacterial artificial chromosome  Odvozeny od plasmidu F´  Určeny ke klonování do bakteriálních buněk  Vyskytují se v počtu 1-2 kopie na buňku  Klonovaná DNA je vysoce stabilní  Klonovací kapacita až 300 kbp (možná i více)  Využity v projektu HUGO  Dnes nahrazovány metodami celogenomového sekvenování, next generation sekvenování a sekvenování třetí generace Bakteriální umělý chromosom https://library.uams.edu/assets/COM/BioChem/MolecularTools/ MolecularToolsSDL12.html Fagemid (phagemid)  Plasmid obsahující počátek replikace fága M13. Používá se k přípravě ssDNA.  Nejznámějšími příklady jsou série klonovacích vektorů pBluescript. Další varianty vektorů Fosmid (phosmid)  Podobný kosmidu, ale je založen na bakteriálním F-plasmidu  Hostitel (E. coli) může obsahovat jen jedinou molekulu  Klonovací kapacita do 40 kbp  Vhodné ke konstrukci stabilních knihoven z komplexních genomů  Vysoce stabilní; schopné udržet lidskou DNA po více než 100 generací (A) Typical bacterial cloning vector. This vector has bacterial sequences to initiate replication and transcription. In addition, it has a multiple cloning site embedded within the lacZ α gene so that the insert can be identified by alpha-complementation. The antibiotic resistance gene allows the researcher to identify any E. coli cells that have the plasmid. (B) Yeast shuttle vector. This vector can survive in either bacteria or yeast because it has both yeast and bacterial origin of replication, a yeast centromere, and selectable markers for yeast and bacteria. As with most cloning vectors, there is a polylinker. (C) Lambda replacement vectors. Because lambda phage is easy to grow and manipulate, its genome has been modified to accept foreign DNA inserts. The region of the genome shown in green is nonessential for lambda growth and packaging. This region can be replaced with large inserts of foreign DNA (up to about 23 kb). (D) Cosmids. Cosmids are small multicopy plasmids that carry cos sites. They are linearized and cut so that each half has a cos site (not shown). Next, foreign DNA is inserted to relink the two halves of the cosmid DNA. This construct is packaged into lambda virus heads and used to infect E. coli. (E) Artificial chromosomes. Yeast artificial chromosomes have two forms: a circular form for growing in bacteria and a linear form for growing in yeast. The circular form is maintained like any other plasmid in bacteria, but the linear form must have telomere sequences to be maintained in yeast. The linear form can hold up to 2000 kb of cloned DNA and is very useful for genomics research. https://doi.org/10.1016/C2009-0-64257-4 Bez ohledu na typ zdroje  bakteriální buňky  kvasinky a plísně  rostlinné i živočišné buňky  celá rostlina nebo živočich Hostitelé = příjemci rekombinantní DNA  G- bakterie, kružnicový chromozóm 3×106 bp  množství použitelných plasmidů  generační doba 20 min. → rychlá tvorba biomasy  nenáročná a levná kultivace  stacionární fáze 2×109 b/mL  řada mutantů (DH5α, HB101, BL21,…)  nevýhody – výrazně odlišné posttranslační modifikace oproti eukaryotům Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae  lineární chromozómy  přibližně 13×106 bp  asi 6 275 genů  Schizosaccharomyces pombe  Pichia pastoris  nejjednodušší eukaryotický organismus  shodný transkripční a translační aparát s dalšími eukaryoty  rozdíly v posttranslačních procesech, např. hyperglykosylace manosou  podobné selekční principy jako u nižších eukaryot či bakterií  využívání binárních „shuttle“ vektorů (bakterie + hmyz)  náhrada polyhedrinové sekvence viru rekombinantním genem  nejčastěji používaná buněčná kultura Sf9 odvozená z Spodoptera frugiperda  baculoviry napadají pouze hmyzí buňky Hmyzí buňky a baculoviry https://www.genscript.com/insect-customized-expression-package.html  vektory jsou typické bakteriální plasmidy, které obsahují rostlinné expresní kazety Relativně bezpečná technologie  transformace přímá  transformace pomocí Agrobacterium  transformace virovými vektory  hostitelské buňky – Nicotiana tabacum, Arabidopsis thaliana, … Rostlinné buňky  člověku nejbližší systémy  nejběžnějším producentem jsou savčí buňky CHO (Chinesse hamster ovary)  rozdílná mezidruhová glykosylace Otázky bezpečnosti technologie !  jako vektory adenoviry, retroviry, herpesviry Savčí buňky a jejich viry Tvorba rekombinantních proteinů v různých organismech