Biotechnologie léčiv - Základy genového inženýrství II. Klonování Klasická definice - vytváření nového jedince geneticky identického (shodného) s předlohou Biotechnologická definice -spojení vektoru s genem —► vytváření geneticky identických buněk/organismů nesoucích vektor s inzertem Human clone Gene clone Cell clone * • S ft t* V C 4* <- Purification and SDS-PAGE anahsis Cultivation of cloned cells and induce with IP K i https://doi.org/10.1016/j.procbio.2017.12.007 Štěpení DNA restriktázami I Neorientované klonování - spojujeme fragmenty DNA s vektorem po jejich rozštěpení stejnou restriktázou = stejné přečnívající konce na obou stranách Foreign DNA Restriction site LacZgene Bacteria (may take up plasmid with or without the insert, or may not take up Plasmid at all). Bacterial genome is missing the lacZ gene Blue colonies have plasmids without i n sen. White colonies have plasmids with the foreign insert. The foreign DNA and plasmid are cut with the same restriction enzyme, which recognizes a particular sequence of DNA called a restriction site. The restriction site occurs only once in the plasmid, and is located within the lavZ gene, a gene necessary for metabolizing lactose. The restriction enzyme creates sticky ends that allow the foreign DNA and cloning vector to anneal. An enzyme called ligase glues the annealed fragments together. The ligated cloning vector is transformed into a bacterial host strain that is ampicillin sensitive and is missing the lacZ gene from its genome. Bacteria are grown on media containing ampicillin and X-gal, a chemical that is metabolized by the same pathway as lactose. The ampicillin kills bacteria without plasmid. Plasmids lacking the foreign insert have an intact lacZ gene and are able to metabolize X-gal, releasing a dye that turns the colony blue, Plasmids with an insert have a disrupted tacZ gene and produce white colonies. Orientované klonování - pro štěpení vektoru a klonované DNA jsou použity různé restriktázy = různé přečnívající konce na každé straně cut insert (what you want to put in) and vector (home you want to put it in) with the same 2 restriction enzymes EcoRI ^ BamHI BamHI EcoRI BamHI 5'... G GATCC.. 3' 5'... GjAATTC... 3' 3'... CCTAG G... 5' 3'... CTTAAJG... 5' This generates DNA pieces with complementary"sticky ends"you can mix & match (once you separate them) .G3' 5'GATCC... .CCTAG 5' 3'G... ...G3' 5'AATTC... ...CUM 5' 3'G... ...G3' 5'GATCC. ...CCTAG 5' 3'G.. ...G3' 5'AATTC. ...CTTAA5' 3'G. purify the pieces you want run an agarose gel to separate by size, then cut out & purify those you want mix em ■- + V > C/3 CD C/3 >. to TD LfS CO CO N C cd c o u g O) c C/l CD Ó) C 'c/3 13 Ó) 'c o o - J? u CD 13 .Q CD CD U C CD O C/l Ligace = kovalentni spojeni vektoru s fragmentem Nick Nicked DNA c Ligase-AMP ► Ligase PPi ATP AMP AMP -P \ Up Up Up Nicked DNA is joined 5' 3' 5 3 OH • • • • • • GA CTTA • • • • • • GA ATTC // CTTA AG spojeni ligäzou + 2 x ATP ATTC AG • • • • • • OH samovolne pripojeni 3 ' 5' 3 5 5' . . . GAATTC ... 3' 3'... CTTAAG ... 5' Vytvoření přečnívajících konců - linkery ( ngace 5'... CCGAATTCGG 3'... GGCTTAAGCC 3' 5' cilová DNA cilová DNA 7A^2 CCGAATTCGG;cilová DNA GGCTTAAGCC:cilová DNA CCGAATTCGG CCGAATTCGG GGCTTAAGCC GGCTTAAGCC EcoR\ T T 5' . . 3' . . AATTCGG GCC cilová DNA cilová DNA CCG GGCTTAA 3' 5' Klonování produktů PCR - I —► připojení restrikčních míst a reštrikční štěpení GAATTC ^^^^^J ATGCAGGTAG GCTAGTGTCA H CGATCACAGT NNNCG i amplifikace t reštrikční štěpení you can use use PCR to make lots of copies of the insert something with insert you want and you can use the primers to add on cut sites you want (TO 4 this cutting leaves you with phosphorylated ends but the primers are usually synthesized without phosphates - this only comes into play if your vector is dephosphorylated https://thebumblingbiochemist.com/365-days-of-science/molecular-cloning-using-restriction-enzymes/ onovani produktů PCR - II TA Honování Taq polymeráza vytváří jednonukleotidové 3'-přesahy, nejčastěji A CCT ggG NLaz-Prom á IJJAG - pCRII-TOPO NLaz-Prom ÍTTC - D H 5a™ Escherichia coli D. Pérez Torres et al. / Revista Clínica (2011) Vnesení konstruktu do hostitele • Transformace = vnesení nevirové DNA do prokaryot a neživočišných eukaryot • Transfekce = vnesení DNA do euraryotické buňky • Transdukce = přenos DNA pomocí virových vektorů Metody transformace/transfekce 8 Heat shock + CaCI. Elektroporace Heat-Shock + CaC\2 Lipofekce Transformation Bulk elect ropo ration Application of the electric field Fl Single cell localised eleclroporation I 3 I Electric fieW and mermal fluctuation Delivery of proteins into the cell Nanofounlain probe localised eleclroporation 1 < < > > ^ u u u1 Nanopore eleclroporation (NanoEP| Nanostraws electroporation system (NES) „Heat shock" Chemokompe-tentní buňky s CaCI2 Příjem cizí DNA do buněk Přidat DNA, 4° C, 30 min Selekce transformantů DNA & the cell membrane are both negatively-charged so they'd normally repel phospholipids Mine's even in my hair! lipopoly'saccharides N*tf»dWy»<»«M Ca' lets them stick + Calcium ions treatment DNA Allow meto bring you "i"0"^^ Vqu^sjo^inep^sitivity! q^2+ + Ca2+ helps the DNA get "in place" Temperature treatment oooL m°-GG Ah3 Lipid loss 0-42*C JJW Y foQ'(jÄ "* SSM heat shock opens the , pores wider and \ helps some of the Q : ' DNA get in https://thebumblingbiochemist.com/365-days-of science/bacterial-transformation-heat-shock- chemically-competent-cells/ DNA transferred into the cell https://doi.org/10.3389/fmicb.2017.02169 Elektroporace • Elektrické impulzy způsobují vznik pórů buněčné membrány a exogénni DNA do buňky Before Pulse During E-field After Pulse Cell membrane Electric field induces a voltage across cell membrane https://www.socmucimm.org/news-m r Lipofekce Tvorba liposomů s enkapsulovanou DNA Možnost transfekce oligo DNA, RNA, siRNA, YAC Hojně využívané u eukaryot Možnost transfekce in vivo Structure of the synthetic cat ionic lipid component of the Trans FastIM Reagent. DNA Lipoplex Moghaddam, B. (2013). Design and development of cationic liposomes as DNA vaccine adjuvants. *—+ Cationic Liposome Endosomal Release Cell Membrane Figure 1.5: Proposed mechanisms of cationic lipoplex condensation and uptake. In brief, cationic liposomes are attracted by electrostatic interactions to the negative charges of DNA forming a lipoplex. Lipoplex binding to the cell surface followed by internalisation and then release of DNA from the lipoplex. DNA enters the nucleus and in the nucleus, RNA will be transcribed. „Gene gun" a mikroinjekce https://doi.org/10.1016/C2011 -0-0581 Pronuclear membrai swells as DNA solution Mechanické vnesení DNA do buňky - kvůli velikosti „vektorů" vhodné hlavně pro eu kary ota Mikroinjekce - vnesení DNA přímo do jádra buňky (vajíčka, embryonální kmenové buňky...) „Gene gun" (biobalistická technika) - vstřelování DNA-pco3t©ó nano/mikročástic obalených DNA do buněk Holding Pipette Pronucleus Plastic disc with DNA-coated gold particles Disc stopped by screen Gene gun Helios™ by BioRad is used to transfect cells in cultures and plant leaves Target plant cells Selekce buněk s rekombinantním genem 1) Reštrikční analýza plasmidové DNA po minipreparaci 2) Inzerční inaktivace 3) a-komplementace 4) Hybridizace kolonií 5) Test PCR 6) Sekvenování f Selekce probíhá primárně na základě rezistence k antibiotikům Hostitelská buňka je senzitivní k antibiotiku Vektor přináší geny rezistence Transformovaná buňka je rezistentní k antibiotiku Cloning foreign DNA using E. coli, cont. Host I Transformation Klonovací místo A.X.KI /lomili Sail 1 Onfcinof rcplicalion (onl All colonies have plasmids Colonies with recombinant plasmids Determine colonies with insert using selection on antibiotic plates https://library.uams.edu/assets/COM/BioChem/Molecul arTools/MolecularToolsSDUO.html selection of transformed cells Agar containing tetracycline colonies transferred for testing Agar containing Agar containing tetracycline (control) ampicillin + tetracycline Inzerční inaktivace - selekce na TETS 8 EcoK\,Xap\ 4359 4arll 4284 Sep\ 4168 Scat 3844 Pviň 3733 Bsum 23 /Sídlil 29 ,£ca32\ 185 Nhei 229 BamH\ 375 ^SgriU 409 /Pae\ 562 Xagi 622 Pst\ 3607 Vsp\ 3537. £co31l 3433 fsro110Sl 3361 BcúSä 939 881 972 ÄspMI 1063 Caň 2834 /WIILfl^LUnl 2473/ Sspl 2350' JVrfef 2295' 0SÍ11O7I 2244/ Bssfií 2225 íVí/ll 2064 Esp3\ 2122 Iflsyl 2217 Mltt1269l 1353 £CíH30l 1369 £«»681 1425 ANst 1444 fl/M/10i 1580 fisjíjl 1650 Kpn2\ 1664 SseJI 1668 TET 77777 [///////// TET kolonie transformovaných buněk o o o o °oOo0o°o o00°oo0o 0°o0o0o00 preočkovaní sterilním párátkem AMP U7TT [///////// inkubace přes noc při 37°C AMP ///// '///////// AMPR, TETS kolonie^/í^ Reštrikční štěpení plasmidu směr transkripce I EcoR I vektor | ATG gen TAA | vektor i vektor AAT gen GTA| vektor Funkce ß-galaktozidazy a-komplementace Funkce p-galaktozidázy OH OH OH ~0 HO HO OH OH Transglycosylation, - 50% OH OH OH Lactose ydrolysis, -50% Ho-A.---—o OH HO ch2oh >hJ-cl i oh OH HO OH OH 7 0 Allolactose oh Galactose OH Glucose * * ) Lac Repressor with Allolactose r~] Lac Repressor bound to Operator ni ES Z Y A Induction of Lac Operon Glycolysis (7G ATP/Lactose) J J Multidis Res Rev 2018 Figure 1: Diagram summarizing the functions of P-galactosidase in the cell. The enzyme can hydrolyze lactose to galactose plus glucose, it can transgalactosylate to form allolactose, and it can hydrolyze allolactose. The synthesis of allolactose which binds to the lac repressor and reduces its affinity for the lac operon is as a result of the presence of lactose. This in turn allows the synthesis of (i-galactosidase, the product of the lacZ gene. operon Escherichia coli enzymy pro metabolismus laktozy Regulatory gene lac operon Promoter DNA Pf lacl gene Plgc 0 lacZ gene lacY gene lacA gene I Operator /acAmRNA /aomRNA I I Repressor J protein /3-galactosidase Galactoside permease Trans-acetylase c 2012 Pearson Education, Inc. I: kóduje represor Z: kóduje enzym beta-galaktozidázu (lac glu + gal) Y: kóduje enzym permeázu A: kóduje enzym thiogalaktozidtransacetylázu induktor - laktóza r Regulace lac operonu a) glc nepřítomna, lac nepřítomna -» vazba represoru na operátor b) glc nepřítomna, lac přítomna -» enzymová indukce c) glc přítomna, lac přítomna -> katabolická represe operátor represor fcŕ~\ promótor operátor O promotor operátor presor r Regulace lac operonu 1 Glucose HIGH Lactose LOW RNA polymerase bound to lad promoter Glucose HIGH Lactose HIGH RNA polymerase bound to lad promoter Glucose LOW Lactose HIGH RNA polymerase bound to lad promoter Figure 17-10 Biological Science, 2/e Operator RNA polymerase bound loosely to promoter NOTRANSCRIPTION lacZ lacY lack CAP site RNA polymerase bound ~\m loosely to promoter INFREQUENT TRANSCRIPTION lacZ lacY lacA RNA polymerase bound tightly to promoter FREQUENT TRANSCRIPTION lacZ lacY lack © 2005 Pearson Prentice Hall, Inc. r Regulace exprese p-galaktozidázy polylinker (MCS) IPTG Isopropyl (3-D-1 -thiogalaktopyranosid operátor lacZ další geny represor IPTG i ch2oh oh j-o s- oh Médium nesmí obsahovat glukózu ! Vznik modrého zbarvení HQ I_0 OH H20 v_z [3-Galactosidase X-Gal Spontaneous Br dimerization and oxidation 5,5 -Dibromo-4,4 -di roste na bakteriích ve formě plak > k infekci potřebuje jen asi 2/3 genomu > nakloňovat lze až 20 kbp DNA > efektivně lze sbalit DNA o délce 78-105% r Hybridizace kolonií nylonová membrána otisk kolonií na membránu ^ lyže, denaturace, fixace o o o o bakteriální kolonie (genomová banka) otisk chromozómové DNA denaturovaná značená cDNA RTG film identifikace kolonie expozice i n ku bace přes noc, hybridizace ^Testování rekombinantních plasmidů metodou PCR 1 vektor 1 klonovací místo vektor vektor primery pro sekvenování Potvrzení přítomnosti inzertu využitím primerů pro sekvenování primer 1 -► | vektor ||| vektor primer 2 primer 1 vektor inzert délky X vektor primer 2 Stanovení orientace inzertu ve vektoru sekvenační primer 1 primer forward -► -► vektor inzert délky X vektor primer reverse sekvenační primer 2 Amplikony vznikají kombinací primerů > sekvenační primer 1 + sekvenační primer 2 (délka amplikonu = N + X) > primer forward + primer reverse (délka amplikonu = X) > sekvenační primer 1 + primer reverse > sekvenační primer 2 + primer forward sekvenační primer 1 9SJ9A9j j 9 lun d -► -► vektor X A>||ap jjazm vektor ] pjeMJOj J9Luud sekvenační primer 2 r Sekvenovani > rozhodující metoda > každý inzert je třeba sekvenovat A Č .G T § 3 . ■ a 2,3 'l-K i.i! AAAGC CTGGGGTGCCTAATGAGTGA 180 190 200 GC TA AC TCAC AT TA AT T GC GTT GC GC TC AC TGC CC GC T' 210 220 230 240 éáMJNjááté rTCCAGTCGGG A A AC CTGTC GT GCCA GC TGCA T TA ATGA ATCGGC 250 260 270 280 • CAAC GCGCGGGGA GAGGC GC 290 300 JWLiWt !T TTGC GTATTGGGC GCTC TTCC GC TTCCTCGC TCAC 310 320 330 340 T GAC TC GC TGC GC TC G GTC GT TC GGC TG< 350 360 37C íftéáikjmM