Biotechnologie léčiv – Genové terapie Doc. RNDr. Jan Hošek, Ph.D. hosek@mail.muni.cz Ústav molekulární farmacie FaF MU Co je to genová terapie? Léčebný postup nebo postup zmírňující projevy genetické poruchy pomocí geneticky modifikovaných buněk pacienta s terapeutickým přínosem pro pacienta Symptomatická léčba geneticky podmíněných chorob neléčí podstatu, ačkoli je známa příčina onemocnění Genová terapie léčí příčinu onemocnění Genová terapie × symptomatická léčba  Dodání chybějícího enzymu u enzymopatií  Dodání jiných chybějících látek (substrátů, proteinů...)  Vyvarování se substrátu, který nelze správně metabolizovat (speciální diety)  Chirurgické zákroky  Farmakologické ovlivnění narušených fyziologických procesů  Farmakologické zlepšení kvality života  Jiné ovlivnění fyziologických procesů nebo kvality života (přístroje, pomůcky)  Transplantace chorobou poškozeného orgánu Symptomatická léčba  Zahrnuje jakoukoliv proceduru, určenou k léčení nemoci genetickou modifikací buněk pacienta  Do buněk se transferují: geny, jejich části nebo oligonukleotidy Genová terapie https://www.science.org/doi/10.1126/science.aan4672 Sahají do roku 1990 - provedeny první klinické studie při léčbě deficience adenosin-deaminázy (adenosine deaminase deficiency, ADA). V této studii byly transformovány lymfocyty periferní krve ADA deficientních pacientů retrovirovým vektorem, který exprimoval funkční adenosin-deaminázu. Ještě 10 let po tomto zásahu lymfocyty jednoho pacienta exprimovaly funkční enzym, což znamená, že genová terapie může mít dlouhodobý účinek. U jiného pacienta se vyvinula imunitní reakce k transportnímu systému, a proto se u něj terapeutický gen neexprimoval, což už tehdy poukázalo na problémy, které jsou s genovou terapií spojeny. Počátky genové terapie N Engl J Med 2019;381:455-64.  Genová terapie in vitro (ex vivo): odběr buněk, provedení genové modifikace mimo organismus, návrat buněk zpět  Genová terapie in vivo: intravenózní transformace přímo genovým konstruktem  Genová terapie in situ: (modifikace in vivo) genový konstrukt je injikován do postižené tkáně nebo její blízkosti Techniky genová terapie N Engl J Med 2019;381:455-64.  Vrozené poruchy (genetická deficience genového produktu, nepřiměřená exprese genu)  Nádorová onemocnění (poruchy biologické funkce protoonkogenů, nádorových supresorových, apoptotických a reparačních genů)  Nemoci imunitního systému (alergie, záněty a autoimunní choroby)  Infekční nemoci (virový nebo bakteriální patogen) Co lze léčit genovou terapií?  Musíme znát přesnou příčinu genetické choroby – tzn. gen, jeho umístění, povahu produktu a hlavně mechanizmus patolo-gického účinku  Správně vytvořenou strategii genové terapie  Součástí strategie je i volba vhodného vektoru a vytipování cílových buněk genové terapie  S ohledem na jistou kontroverznost této terapie je třeba provádět genovou terapii pouze pokud je úspěšně otestována a schválena k použití Kdy lze použít genovou terapii?  Je cílem genové terapie opravit dědičnou genetickou poruchu nebo vnést do recipientních buněk novou funkci? Pokud půjde např. o léčbu cystické fibrózy, pak se jedná o nápravu defektního stavu. Naopak v případě léčby AIDS se můžeme pokusit o transformaci buněk genem s novou funkcí; např. genem, jehož produkt bude interferovat s replikací viru HIV.  Má být terapeutický gen fungovat po dlouhou nebo krátkou dobu? Většinou půjde o požadavek, aby gen fungoval dlouhou dobu, ale v případě léčby nádorového bujení nebo požadavku vnesení DNA vakcíny může jít i o účinek relativně krátkodobý. Další otázky pro použití GT - 1  U většiny aplikací je zapotřebí kontinuální exprese terapeutického genu. V některých případech je zapotřebí expresi regulovat, například při léčbě diabetes mellitus. Další otázky pro použití GT - 2  Výběr cílových buněk Podle charakteru postižení; například v případě familiární hypercholesterolémie je zapotřebí vnést do hepatocytů gen kódující receptor pro LDL (low density lipoprotein). Při saturaci nízkých hladin srážecích faktorů (vede k hemofilii), je třeba zacílit specifickou populaci buněk; zde je třeba vnést gen produkující uvedené srážecí faktory do takových buněk, které je budou schopny přivést do místa účinku, tedy do krevního řečiště. V případě faktoru IX se povedla transformace myoblastů, které tento srážecí faktor secernovaly v krvi. Výběr cílových buněk je také závislý na dostupných technikách manipulace s konkrétními buňkami. Další otázky pro použití GT - 3 1) Vytvoření genetické informace (metodami rekombinantní DNA), která je určená pro transport do buněk 2) Vytipování buněk, do kterých bude upravená genetická informace vnesena 3) Výběr vhodného vektoru 4) Po provedení genové terapie je třeba pacientův stav pečlivě monitorovat a všímat si jak zlepšování zdravotního stavu, tak i nástupu případných komplikací Provedení genové terapie zahrnuje  Reparace genů in situ - terapie genů  Ektopická reparace – terapie geny Základní strategie KLASICKÁ  Optimální exprese vloženého genu  Tvorba chybějícího produktu  Přímá likvidace nemocných buněk  Aktivace imunitního systému NEKLASICKÁ  Inhibice exprese patogenního genu  Restaurace normální exprese  siRNA Strategie genové terapie Jejím cílem je dopravit geny do vhodných cílových buněk tak, aby bylo dosaženo optimální exprese vnesených genů a  Zajistit produkci látky, která chybí  Aktivovat buňky imunitního systému ve snaze pomoci odstranit nemocné buňky Genová terapie „klasická“  Inhibice exprese genů asociovaných s patogenezou  Korekce genetického defektu a obnovení normální genové exprese Genová terapie „neklasická“ Genová terapie podle typu buněk Zárodečné buňky  Do oplodněného vajíčka se dodá kopie správné verze příslušného genu a vajíčko se implantuje zpět do těla matky  Gen je zpravidla přítomný ve všech buňkách nového jedince  Provádí se mikroinjekcí DNA do vajíčka  Teoreticky použitelná k léčení jakékoli dědičné choroby Somatické buňky  Manipulace s buňkami, které lze z těla odebrat, transfekovat a vrátit zpět do těla  Nadějná pro léčbu dědičných onemocnění krevních buněk  Vnášejí se geny do kmenových buněk kostní dřeně  Jako vektory slouží viry – retroviry, adenoviry  Problém s dominantními znaky kmenová buňka nový gen transfekce implantace diferenciace Všechny zralé buňky obsahují nový gen T-lymfocyt B-lymfocyt bazofil eozinofil neutrofil makrofág GT kmenových buněk  Současná genová terapie se omezuje na terapii somatických mutací  Etické problémy s potenciální terapií zárodečných mutací Somatické nebo zárodečné buňky?  Vytvoření genetické informace (metodami rekombinantní DNA), která je určená pro transport do buněk  Vytipování buněk, do kterých bude upravená genetická informace vnesena (in vivo, in vitro)  Výběr vhodného vektoru  Po provedení genové terapie je třeba pacientův stav pečlivě monitorovat a všímat si jak zlepšování zdravotního stavu, tak i nástupu případných komplikací Provedení genové terapie zahrnuje Ex vivo (in vitro)  Transfer klonovaných genů do buněk v kultuře (transplantace autologních geneticky modifikovaných buněk) In vivo (in vivo, in situ)  Transfer se děje přímo do tkáně pacienta pomocí liposomů nebo virových vektorů Genetický transfer cDNA s kompletní DNA kódující sekvencí je modifikována k zajištění vysoké hladiny exprese, např. pomocí silného virového vektoru Následná inzerce genu se děje  do chromozómu  extrachromozomálně Principy genetického transferu  gen se bude rozšiřovat do dalších buněk  vysoká úroveň exprese (kmenové buňky)  náhodná inzerce - různá lokalizace  různá úroveň exprese  smrt jednotlivé buňky  nádorové zvrhnutí (aktivace onkogenu, deaktivace supresorového nebo apoptotického genu) (výhoda transferu ex vivo) Inzerce do chromozómu  Nejistý dlouhodobý účinek  Gen je exprimován po dobu života buňky Inzerce extrachromozomálně 1) Zvýšení genové exprese – efekt genové dávky 2) Usmrcení „nemocných“ buněk 3) Usmrcení buněk za asistence imunitního systému 4) Cílená inhibice genové exprese 5) Cílená oprava mutace Důsledky genové terapie Princip ex vivo genové terapie N Engl J Med 2019;381:455-64. Princip in situ / in vivo genové terapie NEnglJMed2019;381:455-64. Příklad I. – vnesení funkčního genu buňky s deficiencí gen T pro toxin T T T Buňky zabité exprimovaným toxinem gen P pro prodrug Buňky zabité léčivem P P P Příklad II. – cílené zabití buněk Příklad II. buňky s deficiencí gen pro antigen gen pro cytokin likvidace buněk vystavení antigenu buňky imunitního systému produkce cytokinů Příklad III. - Usmrcení buněk za účasti imunitního systému Příklad III. buňky s deficiencí antimediátorový gen Inhibice genové exprese Zablokování produkce „patologického“ proteinu A A A Příklad IV. - Cílená inhibice genové exprese Příklad IV. X - X - X buňky s deficiencí Xgen X+ Genová konverze Normální fenotyp X + X + X + gen X+ gen XPříklad V. - Cílená oprava mutace Příklad V. replikující se virus nereplikující se virus Lyze buněk Syntéza virionů Syntéza virových a rekombinantních proteinů, nekompletní viriony retrovirus Integrace do genomu buňky syntéza rekombinantních proteinů Virový transfer  Retrovirové vektory  Lentivirové vektory  Vektory adeno-asociovaného viru  Adenovirové vektory  Vektory viru herpes simplex Savčí virové vektory 5LTR 3LTRGagy Pol Env Proteiny core Replikace/integrace Obalové proteiny Signál obalování Retrovirus 5LTR 3LTRMarkery Promotor Cizorodý gen Identifikace/separace Exprese genu Opravný gen Signál obalování Postup při genové terapii retrovirem DOI: 10.3390/biomedicines4020009 • Integrace do genomu Genová terapie s adenovirovým vektorem • Neintegruje se do genomu = episomální DNA • Infikuje různé druhy dělících se i nedělících se buněk • Silně imunogenní → využijí při výrobě vakcín a protinádorových léčiv • Replikačně defektní viry → genové terapie a vakcíny • Replikující se (onkolytické) viry → protinádorová léčiva Genová terapie s adeno-asociovaným virem • Neintegruje se do genomu = episomální DNA • Využití v in vivo genové terapii • Rekombinantní AAV je vytvořen z nepatogenního neobaleného parvoviru • Efektivita sbalení viru se výrazně snižuje, pokud je transgenní sekvence delší než 5 kbp • Na myším neonatálním modelu byl prokázán vznik hepatocelulárního karcinomu při využití vysoké dávky AAV, u člověka nebyl pozorován Genová terapie spinální muskulární atrofie N Engl J Med 2019;381:455-64. Schválené genové terapie N Engl J Med 2019;381:455-64. Dle Vyhlášky 84/2008 Sb. (Vyhláška o správné lékárenské praxi, bližších podmínkách zacházení s léčivy v lékárnách, zdravotnických zařízeních a u dalších provozovatelů a zařízení vydávajících léčivé přípravky) je možné připravovat přípravky genové terapie v lékárně (§3(8d)), v podtlakových bezpečnostních boxech s vertikálním laminárním prouděním třídy čistoty vzduchu A a s odtahem mimo prostor, které jsou umístěny v prostoru třídy čistoty vzduchu B a jsou vyhrazeny pro tento účel (§5(f)). Co kdybych chtěl začít používat genovou terapii v ČR?  Endocytóza navozená receptory  Transfer prostřednictvím lipozómů  Přímý přenos DNA  Bombardování částicemi Transfer genů do buněk nevirový voda voda lipid fosfát lipidová dvojvrstva směs transfer fůze cílová buňka jádro aniontové lipozómy kationtové lipozómy In vivo transfer lipozómy Genová terapie SMA N Engl J Med 2019;381:455-64. CAR-T terapie • T-buňky nesoucí chimerický antigenní receptor (CAR) (stabilní transfekce) • CAR → antigen vázající doména za Ig nebo TCR + intracelulární doména pro aktivaci T-buněk • Hlavně cílená léčba nádorů • Výrazná systémová toxicita a nevyjasněný „tumor-off“ efekt. https://www.cancer.gov/about- cancer/treatment/types/immunotherapy/t-cell-transfer- therapy Příklady GT dědičných onemocnění Příklady GT nádorů Etické aspekty genových terapií  Bezpečnost manipulací  Ověření na savčích modelech  Hierarchické schvalování protokolu  Nebezpečí vedlejších účinků  GT zárodečných buněk  Velmi vysoká finanční náročnost  Technická a technologická náročnost  Nízká úspěšnost terapie, pokud jsou problémy s "uchycením" vnášené genetické informace  Náhodnost vložení genetické informace = narušení protoonkogenu, tumor-supresorového genu = maligní transformace buňky  Genová terapie je eticky problematická Nevýhody genové terapie Rizika genové terapie • Inzerční mutageneze – integrace vektoru do genomu může narušit funkci původní DNA • Při in vivo přístupu může vzniknout imunitní reakce na použitý virový vektor NEnglJMed2019;381:455-64. Záchrana života pacientů s těžkými genetickými chorobami či rakovinou Zpříjemnění života mnoha dalším lidem, jejichž choroba sice není natolik závažná, ale stejně jsou odkázáni na podpůrnou terapii Nutné vymezení hranice mezi tím, na co je ještě etické genovou terapii použít a na co už ne. Budou v budoucnosti "děti na objednávku"? Budeme si moc určit barvu očí, vlasů či výšku našich dětí? Dočkáme se éry superlidí? Stane se z genové terapie takový obchod, jakým je dnes třeba plastická chirurgie? Budoucnost genové terapie Editace genomu (např. CRISPR/Cas9 technika) – genový knock-in, knock-out, cílená mutageneze CRISPR/Cas9 technika • CRISPR = Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats • Cas9 = endonukleáza • Prokaryotický imunitní systém, který zajišťuje rezistenci vůči cizím genetickým elementům, jako jsou plastidy nebo fágy, a představuje tedy formu získané imunity. Využití CRISPR/Cas9 v GT https://www.sigmaaldrich.com/CZ/en/technical-documents/technical- article/genomics/advanced-gene-editing/human-ipsc-crispr-protocol https://doi.org/10. 3390/horticulturae 7070193 https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted- genome-editing-a-new-era-in-molecular-biology