Biotechnologie léčiv – Exprese rekombinantních proteinů v eukaryotických buňkách Doc. RNDr. Jan Hošek, Ph.D. hosek@mail.muni.cz Ústav molekulární farmacie FaF MU Cíle transfekce živočišných buněk 1. Přenos genů do živočišných buněk • vyhledávání genů, poznání jejich funkce a regulace a studium fenotypu (př. procesů diferenciace a jejich poruch) • studium proteinových interakcí • tvorba a purifikace cizorodých proteinů 2. Příprava transgenních živočichů • studium fungování genů v rámci celého organismu • modely pro studium genetických chorob • příprava zvířat s lepšími užitkovými vlastnostmi • hledání možností pro genovou terapii • vytváření cizorodých proteinů (animal farming) Expresní systémy hmyzích buněk • Hostitelské buňky odvozené z – Spodoptera frugiperda → Sf9 buňky – transientní exprese – Trichoplusia ni → High Five™ buňky – transientní exprese – Drosophila melanogaster → S2 buňky – stabilní exprese – Mohou růst adherentně nebo v suspenzi • Baculovirový vektor ➢ Nejběžnějším zástupcem je Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV) parazitující na zástupcích řádu lepidoptera (Spodoptera frugiperda a Trichoplusia) → široké spektrum hostitelů ➢ Velké tyčkovité dsDNA viry infikující hmyz ➢ Virové částice jsou obaleny ochrannou matrix sestávající z proteinu polyhedrinu – umožňuje přežití ve vnějším prostředí a efektivní šíření mezi buňkami, v podmínkách in vitro není zapotřebí ➢ Promotor pPolh umožňuje expresi polyhedrinu nebo rekombinantního proteinu - až 50% celkového proteinu na konci cyklu bakuloviru Baculoviry Baculovirové expresní vektory I. • Gen zájmu pod pPolh promotorem • GOI na plasmidu → homologní rekombinace na AcMNPV DNA • Nízká úspěšnost rekombinace (cca 0,1 %) • Náročné vyhledávání rekombinantních (polyhedrinnegativních) virových plaků • Využití linearizovaných (nereplikujích se) AcMNPV DNA → úspěšnost rekombinace 10- 20%, BakPAC systém až 95% DOI: 10.1016/S0076-6879(09)63014-7 DOI: 10.1016/S0076-6879(09)63014-7 Baculovirové expresní vektory II. • Využití transpozice místo homologní rekombinace • Transpozice probíhá v E. coli, která nese „helper“ plasmid kódující transponázu • Úspěšnost rekombinace 100 % DOI: 10.1016/S0076-6879(09)63014-7 ➢ binární vektor, který se může replikovat v Escherichia coli a hmyzích buňkách (obsahuje úplný genom baculoviru (bez PH), nízkokopiový počátek replikace z F plazmidu a att místa pro transpozon T7) ➢ nese rezistenci ke kanamycinu ➢ nese gen lacZ, jím transformované kolonie tedy rostou modře, v přítomnosti IPTG ➢ rekombinantní gen je do něj vnášen transpozicí z jiného vektoru, transpozice směřuje do lacZ, výsledné kolonie rostou bíle Bacmid http://strubiol.icr.ac.uk/extra/baculovirus/introduction.html transponáza https://www.creativebiomart.net/baculovirus-insect-cell-expression-systems.htm ➢ vhodný k produkci vysokých hladin rekombinantních proteinů (až 1 000 mg/mL) ➢ správně posttranslačně modifikované (sbalení, tvorba S-S můstků, oligomerizace, glykosylace, acylace, proteolytické štěpení) ➢ rekombinantní proteiny biologicky aktivní a funkční ➢ rekombinantní gen je vnesen do oblastí virového genomu, které nejsou nutné pro replikaci viru Základní vlastnosti hmyzího systému I. ➢ rekombinantní bakulovirus ztrácí jeden z postradatelných genů (polh, v-cath, chiA ...), který je nahrazen genem rekombinantním ➢ rekombinantní protein je exprimován v kulturách hmyzích buněk nebo hmyzích larvách (není tak běžné) http://www.ent.iastate.edu/dept/faculty/bonningb/files/images/zebracaterpillar.jpg Základní vlastnosti hmyzího systému II. ➢ Vysoké hladiny genové exprese, zvláště u intracelulárních proteinů ➢ Rekombinantní proteiny jsou většinou rozpustné, posttranslačně modifikované a snadno se izolují, obsah rodičovských proteinů je nízký, exprese probíhá v pozdních fázích infekce ➢ Hmyzí buňky se dobře kultivují v suspenzních kulturách – snadný převod do biorektorů ➢ Heterooligomerní proteiny lze exprimovat využitím simultánní infekce dvěma nebo více virovými vektory nebo vektorem s více expresními kazetami ➢ Bakuloviry mají omezené spektrum hostitelů z řad bezobratlých – bezpečná technologie Výhody hmyzího expresního systému Glykosylace proteinů v hmyzích buňkách • Hmyzí buňky mají rozdílnou glykosylaci ve srovnání se savčími ➢ Snížená biologická aktivita ➢ Imunogenita / alergická reakce • Používání hmyzích buněk s transfekovanými savčími glykosyltransferázami doi:10.1038/nbt1095 DOI:10.1016/S0065-3527(06)68005-6 doi:10.1021/acs.iecr.8b0098 doi:10.1021/acs.iecr.8b0098 Transientní exprese v hmyzích buňkách • Využívají se hlavně Sf9 buňky http://dx.doi.org/10.5772/67849 doi:10.1021/acs.iecr.8b0098 Využití transientní exprese http://dx.doi.org/10.5772/67849 doi: 10.1002/biot.201400438 Stabilní exprese v hmyzích buňkách • Hlavně S2 buňky → rekombinantní rS2 buňky • Gen je integrovaný do jaderné DNA • Stabilní exprese, vysoká homogenita šarží • Možnost využití perfuzních kultivačních systémů http://dx.doi.org/10.5772/67849 Využití stabilní exprese http://dx.doi.org/10.5772/67849 Vektory pro přenos do savčích buněk 1. Plazmidové vektory - plazmid se nereplikuje, vzácně se začleňuje do genomu buňky • prokaryotický plazmid + eukaryotická transkripční jednotka + selekční marker • využívají se k selekci transfekovaných buněk při kotransfekci a sledování transientní exprese genů 2. Virové vektory - kyvadlové vektory, replikující se v hostitelských buňkách • část bakteriálního vektoru + sekvence eukaryotických virů + selekční marker • vektory odvozené z SV40, bovinního papilomaviru, EBV, retrovirů, bakulovirů, viru vakcinie, adenovirů aj. • využívají se ke sledování stabilní nebo transientní exprese genů a k získávání rekombinantních proteinů ve velkém množství Obecná struktura savčího expresního vektoru • Promotor • Zesilovače transkripce (enhancery) • polyA sekvence • Selekční marker • Počátek replikace https://doi.org/10.1007/s00253-020-10640-w Promotory savčích vektorů • Nejběžnější promotory pro expresi v savčích buňkách: – lidský cytomegalovirus enhancer/promotor (hCMV) – Simian virus 40 brzký promotor (SV40E) – CMV enhancer/kuřecí β-aktin promotor (CAG) – lidský prodlužovací faktor-1α (hEF-1α) – Elongační faktor-1 α čínského křečka (CHEF-1α) • Uměle vytvořený SCP1 (super core promoter 1) promotor → 3× rychlejší než CMV promotor https://doi.org/10.1007/ s00253-020-10640-w Virové konstitutivní promotory • Vysoká míra exprese GOI • Virové promotory jsou často aktivní pouze během konkrétní fáze buněčného cyklu (např. CMV je aktivní během S fáze) • Vysoká produkce cílového proteinu inhibuje růst buněk a může způsobit i apoptózu • Virové promotory jsou náchylné k epigenetickému umlčování Inducibilní promotory • Nejsou závislé na buněčném cyklu • Indukce proteinové exprese na vrcholu exponenciální fáze růstu zajistí maximální výtěžky • IPTG-inducibilní lac operon • Operony represoru tetracyklinové rezistence Tn10 (tetracycline resistance repressor operons) – Tet-Off/Tet-On Další regulační oblasti • PolyA sekvence – v 3‘-UTR terminátoru – polyA sekvence z viru SV40 – zvýšená odolnost k nukleázám • Introny – vložení intronu nebo nepřekládaného exonu před start kodon zvyšují efektivitu transportu mRNA z jádra do cytoplasmy a prodlužuje její poločas • IRES – internal ribosome entry site – vkládá se mezi čtecí rámce bi/poly-cistronních mRNA – zajišťuje expresi více genů z jednoho promotoru – translace genu za IRES je nižší než před IRES • Furin-2A sekvence – malé samoštěpící peptidy – vkládají se mezi dva ORF místo IRES – zajistí stejnou expresi obou genů Selekční markery Tvorba multimerních proteinů • Možnosti přípravy: 1. klonování genů pro podjednotky samostatně a pak jejich spojení in vitro – nízká účinnost 2. klonování genů ve dvou vektorech v jedné buňce – sestavení proteinu in vivo – vysoká účinnost • Možné komplikace: – Ztráta jednoho z vektorů, aktivní protein se nevytvoří – Různý počet kopií vektorů, jedna z podjednotek je v nadbytku, výsledného produktu je málo • Řešení: Klonování genů v bicistronickém expresním vektoru Dvouvektorový expresní systém v jedné buňce Dva geny na jednom vektoru Retrovirové vektory • Infikují široké spektrum buněk živočišných druhů a různé typy lidských buněk • Infekce vede k integraci virového genomu do genomu hostitelské buňky – místo integrace je libovolné (přednostně v transkripčně aktivním chromatinu) • Infekce retrovirem nemá za následek smrt buňky, často vede ke stálé produkci nových virionů • Nevýhodou je schopnost retrovirových vektorů aktivovat transkripci genů sousedících s místy jejich začlenění Vektory odvozené od SV40 viru • Simian virus 40 – polyomavirus napadající opice a člověka • genom = 5,2 kb kružnicová dsDNA • životní cyklus: – v permisivních buňkách (opice) – lytický cyklus – v nepermisivních buňkách (myš, křeček) – integrace do genomu, transformace buněk • Konstrukce vektorů: – náhrada časné nebo pozdní oblasti cizími geny, komplementace chybějících funkcí pomocným virem nebo pomocnými buňkami (COS) COS buňky • Fibroblastům-podobné buňky odvozené z opičí ledvinové tkáně • COS = CV-1 (simian) in Origin, and carrying the SV40 genetic material • Defektní SV40 virus integrovaný do genomu – nemůže se samostatně replikovat, ale tvoří všechny proteiny • Replikace rekombinantních SV40 virů nebo plasmidů s oriSV40 • hlavně transientní exprese Používané savčí buňky • Nejčastěji používané CHO buňky (60-70% rekombinantních biofarmaceutik na trhu) – hlavně stabilní exprese – rostou v suspenzi – produkce proteinu až 10 g/L • Sp2/0 a NS0 myší myelom, YB2/0 potkaní myelom a baby hamster kidney (BHK) buňky • Lidské linie PER C6 a CAP – ideální posttranslační modifikace → nízká imunogenita terapeutických proteinů doi: 10.1007/978-3-319-52287-6_29 doi:10.1007/978-3-319-52287-6_29