Přednáška Biotechnologie léčiv 20 1) Pojem biotechnologický proces a jeho fázování 2) Suroviny pro fermentaci 3) Procesy sterilizace 4) Bioreaktory a fermentory 5) Procesy kultivace, růstové parametry buněčných kultur 6) Biotechnologický kámen mudrců SUBSTRAT 1. fáze = „u pst ream processing" □ 2. fáze = bioproces 3. fáze = „downstream processing" PRODUKT Dílčí postupy biotechnologického procesu 1) Předběžná úprava výchozí suroviny Sterilizace látek v kultivačním prostředí Vlastní biochemická přeměna Dezintegrace produkčního mikroorganismu (neplát pro secernovaný produkt) Izolace produktu Dodatečná úprava produktu Produkty biotechnologického procesu Biomasa Extracelulární produkty Biomasa i extracelulární produkty obsahují metabolity > primárni > sekundárni príprava inokula fermentace inokula příprava media sterilizace media čištění a konečné úpravy produktu extrakce produktu produkt tekutá kultura separace buněk v \7 supernatant bez buněk likvidace efluentu biomasa M V dezintegrace buněk príprava inokula fermentace inokula příprava media sterilizace media čištění a konečné úpravy produktu extrakce produktu produkt tekutá kultura separace buněk v \7 supernatant bez buněk likvidace efluentu biomasa M V dezintegrace buněk Suroviny pro fermentacní proces > Komplexní substráty > Rostlinné oleje a živočišné tuky > Petrochemické zdroje > Syntetické alkoholy > Organické kyseliny 2. Vzduch 3. Zdroje uhlíku > Sacharidy 1. Voda 4. Makroelementy 5. Mikroelementy 6. Růstové faktory 7. Odpěňovací prostředky Voda m fermentamím procesu Normální pitná voda upravená (deionizovaná voda) > příprava živných půd > vypírání biomasy Technická voda > chlazení živného média > na regulaci teploty kultivace > mytí kultivačních zařízení Vzduch m fermentamím procesu > Většinou se jedná o aerobní procesy > Provzdušňování - mícháním, profukováním, ... > Provzdušňování - povrchové nebo submerzní Některé organismy naopak v přítomnosti kyslíku nerostou a neprodukují příslušný metabolit -^odstranění kyslíku probubláváním média metanem nebo C0o Makroelementy ve fermentamím procesu Zdroje dusíku > amoniak, amonné soli > aminokyseliny, močovina > kukuřičný výluh, mouky rostlinného původu > pepton, kvasničný extrakt Zdroje fosforu > anorganický fosfor (K3P04, Na3P045 (NH4)3P04) > přírodní zdroje (kukuřičný výluh, arašídová mouka, sójová mouka, odpady při zpracování masa a ryb -kosti Mikroelementy ve fermentačním Laboratorní podmínky > anorganické soli, nejčastěji sírany a chloridy Průmysl > kukuřičný výluh, sojová a arašídová mouka, řepná melasa, syrovátka, ... procesu Biogenní prvky K, S, Ca, Mg, Na Stopové prvky Fe, Zn, Mn, Cu, Co, ... Růstové faktory, prekursory, ochranné Vitamíny > B = pekařské kvasinky Aminokyseliny > v čisté podobě nebo přírodní materiály Prekurzory > přídavek kyseliny fenyloctové nebo fenylacetamidu zvyšuje výtěžek penicilinu G Pufry > udržení pH, například CaCOs Antibiotika > pokud neinterferují s produkcí a následnou purifikací i Odpenovaa prostředky > pěnění je typickým průvodním jevem většiny průmyslových fermentačních půd s vysokou koncentrací substrátů > struktura pěny je ovlivněna řadou faktorů (pH, media, teplota, viskozita...) > každý použitý substrát určitým způsobem ovlivňuje tvorbu pěny > odpěňovací prostředky (přírodní rostlinné nebo živočišné a syntetické) často zároveň slouží i jako zdroj uhlíku > obecně by pro ně mělo platit, aby působily již v nízké koncentraci a dlouhodobě, aby nebyly toxické vůči danému mikroorganismu > používají se přírodní oleje a tuky, vyšší alkoholy, deriváty sorbitanu, polyethery a silikony různého složení 17 Sterilizace Cílem sterilizačního procesu je odstranění všech přítomných mikroorganismů Způsoby sterilizace > teplem > filtrací > chemicky (p-propiolakton, ethylenoxid, propylenoxid a glutaraldehyd) > záření (RTG, p-záření, UV-světlo a ultrazvuk) Koncept steriliiac Sterilizace je pojem absolutní = neexistují stupně sterility !!! Nelze garantovat sterilitu, jen vyjádřit pravděpodobnost sterility!!! Pravděpodobnost sterility Vyjadřuje se v hodnotách 106, tedy 1 přeživší mikroorganismus z milionu Pravděpodobnost sterility nbn&i ilk ra^ne. Rychlost eliminace organismu Hodnota D (decimální redukční čas) = čas vyžadovaný k redukci populace na 10% Hodnota Z parametr vyjadřující vliv teploty na rychlost eliminace (počet °C nezbytných pro změnu hodnoty D 10x) Hodnota F = určený pro srovnání efektu eliminace mezi autoklávy (umožňuje např. změnit dobu eliminace při konstantním nastavení teploty) POZOR! Graf pro 1ml ampule. Po 5 minutách přežije 0,1 cfu/ml, tedy v 10ml ampulích bude 9 sterilních a 1 nesterilní, atd... Vysvětlení hodnoty D čas vyžadovaný k redukci populace na 10% = rychlost inaktivace bakterií Křivka přežití při D= 45 sekund 1.5 1 0.5 E 2 o M * -0.5 -1 -1.5 -2 Hodnota D ^^^^ D = 0,75 minuty N0 = počet bakterií na počátku, N = počet bakterií na konci, t = čas expozice, D = hodnota D IF (při 121°C) po dobu 15 min (při D = 1,2min) = 1015/1>2 = 1012'5 To znamená, že populace poklesne 10x ve 12,5 cyklech udává teplotu (ve °C) při které dojde k redukci hodnoty D 10x Teplota par (°C) Hodnota D (min) 120 110 12 121 1,2 r Hodnota Z se v tomto případě rovná? 11°C Hodnoty se pohybují mezi 8-14°C, používá se proto hodnota 10 28 Stanovte hodnotu D při sterilizaci spór za teploty 121°C , jestliže víte, že při 115°C byla hodnota Z = 10,5°C a hodnota D = 9 minut. í je na dalším snímku Vztah Za D- řešení Z = (Ta-T^logDHogDa) \ logD! -logD2 =(T2-T,)/Z log9 - logD2= (121-115)/10.5 = 0,571 logD2 = log9 - 0,571 logD2 = 0,383 D2 = 2,42 minuty Vysvětlení hodnoty F Pro běžně používané hodnoty Z = 10 užíváme hodnotu F0 F0= AtxX10/z Je-li teplota 115°C udržována po dobu 1 minuty, pak F0 = 1 x10(115"121/z) F0 = 1 x10(-6/1°) F0 = 0,251 minut Tzn., že 1 minuta expozice při 115°C má stejný efekt jako 0,251 minuty při teplotě 121°C 31 Pokud je pro sterilizační efekt nutné udržovat teplotu stabilně při 115°C po dobu 30 minut, jakou dobu bude nutné sterilizovat při teplotě 121°C? Výsledek Hodnota At = 30, tedy F0 = 30 x 0,251 = 7,53 minuty 32 Autokláv se ohřívá a chladí a i tyto teploty mají vliv na sterilizaci Proto je ve vzorci ta £ Parametry sterilizace se tedy počítají jako součet dílčích časů a dílčích konkrétních teplot K tomu je možné využít softwarové nástroje, třeba tabulku v EXCEL Leta lita 0.4 0.2 0.8 0.6 1.2 33 teruizace živného media a zamení -1 Tepelná destrukce mikroorganismů > tepelné denaturace jednoho nebo několika enzymů základního významu Rychlost destrukce je ovlivněna > vnějším prostředím (množství vody, pH média, koncentrace rozpuštěných látek v médiu,...) > fyziologickým stavem buněk Tepelně nejodolnější jsou spory Sterilizace živného média a zařízení - II Vsádková sterilizace teplem > živné médium se ohřívá přímo v reakční nádobě > po určité výdrži na sterilizační teplotě se opět ochlazuje > ohřev se provádí buď přímou horkou parou nebo pomocí tepelného výměníku > Účinnost sterilizace závisí na teplotě a době sterilizace 121 °C..................15 min 126 °C..................10 min 134 °C....................3 min Uvedené teploty odpovídají tlaku syté páry teríiizace živného média a zařízení - li i Kontinuální sterilizace teplem > velká úspora nákladů na páru a chladící vodu > zkrácení celkové doby sterilizace na 5 - 8 min > používají se vyšší teploty = 135 °C > menší poškození termolabilních složek v médiu > možnost přesnější a automatické regulace procesu Kontinuální sterilizace je vhodná pro komplexní média, která neobsahují tuhou fázi, ale mohou obsahovat termolabilní růstové faktory Provedení kontinuální st 919 1) Do kapalného média se proudícího trubkou přivádí přímá pára, po průtoku vstupuje kapalina do expanzní nádoby, kde se prudce ochladí 2) Ohřev a chlazení deskového výměníku, perioda se zkrátí na cca 20s až 5min, vlastní výdrž při sterilizační teplotě 135°C je 2 až 3 min terilizace živného média a zařízení- iV Sterilizace média filtrací -1 > pouze u médií, která obsahují termolabilní látky a nelze tedy provést sterilizaci teplem > zároveň médium může obsahovat pouze rozpustné látky > filtry o velikosti pórů 0,2 um Sterilizace živného media a zařízení - V Sterilizace média filtrací - II > před vlastní filtrací je nutné sterilizovat i toto filtrační zařízení (často jsou dodávány ve sterilním balení již od výrobce, případně je nutná sterilizace teplem, párou, chemicky nebo UV-zářením) Sterilizace živného média a zařízení - VI Sterilizace bioreaktorů > pokud se používá kontinuální sterilizace média nebo sterilizace média filtrací, je nutné sterilizovat bioreaktor prázdný 1) horkou parou (121 °C) 2) horkým vzduchem (150-180°C) 3) chemicky 1) teplem, 2) UV-zářením 3) EM-vlnami 4) filtrací - z ekonomického hlediska převážně v průmysl Hrubé předčištění vzduchu > porézní materiál, např. práškové uhlí a koks, případně i skelná vlákna Filtrace > na membránách (nitrocelulóza) > hloubková - vzduch prochází několik desítek cm silnou filtrační vrstvou (skelná vlákna, nitrátová celulóza, teflon, nylon nebo polyakryl) Čím menší ústav, tím menší reaktor Z obhajob bakalářských prací, Mikrobiologie MU ACID/BASE FOR PH CONTRDL STEAM FOR SIERIUZATION nejdulezitejsi časti, srdcem výrobní linky biotechnologického procesu > nádoba různého objemu, ve které probíhá biologický proces > dochází zde k růstu buněk a tvorbě produktů nebo přeměně substrátu na jeden či více produktů Fermentor je bioreaktor pro práci s bakteriálními buňkami á * části bioreaktorú > přívod a odvod média > přívod inokula > míchací zařízení s motorem > ventil na přívod vzduchu > zařízení na odběr vzorků > vyhřívání > teploměr, tlakoměr, měřící a regulační články pH, koncentrace 02 5 C025 atd. Steam Catalyst in Motor Acid base or nutrient addition Fresh medium Feed forward control Temperature recorder and control Harvest line reservoir y Pressure indicator pH recorder and control Outlet stream Air supply Fermentor pH regulering Syre Base Médie ind ISensor N r 23 Motor Bmgt medíe/| produkt ud v V Rotor MTJ 16/6,02 > Vířivé reaktory (airlift bioreactor) > S pevnými nosiči (např. fixed-bed bioreactor) > Membránové bioreaktory (např. hollow fiber perfusion bioreactor) 49 Dělení biorea ktoru podle kinetíky iného růstu a způsobu tvorby produktů (a) Qutfet (b) lnicí Qirflet (c) InloL V - const X(t) S(t) Pít) V * const X(t) P(t) Outlet -► V = const X S P const const const Vsádkový (batch) Kultivace mikmomanismů > Diskontinuální (vsádková, „batch", jednorázová) -» vyčerpání živin, zpomalení růstu > Kontinuální - prodloužení exponencionální fáze -» ustálený Stav (velké objemy kultivací, čištění odpadních vod) ■ chemostat ■ turbidostat > Semikontinuální (dávkovači, „fed batch") -» periodické přidávání živin, zpomalení růstu (výroba droždí) Kultivace semidiskontinuální CONCENTRATION sugar\ _______________ i dowl \ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ i ■ ■ ■ ■ i ■ ■ A product/ -............ \ ______________ i i i i ) 2 4 6 3 1 TIME, days i ■ i 0 12 14 > Submerzní = ponořené - vše doposud popsané > Povrchová kultivace na tekutých živných půdách - zejména u vláknitých mikroorganismů např. Aspergilus niger produkující kys. citrónovou > Povrchová kultivace na pevných médiích - v diagnostice mikroorganismů nebo při výchozím namnožení zásobních kultur pro přípravu inokula, kultivace hub 57 Jiná dělení bioreaktorů > pro kultivaci volných buněk, imobilizovaných buněk, enzymů > podle velikosti: laboratorní (do 301), čtvrtprovozní (30-1001), poloprovozní (100-50001) a provozní (nad 5m3) > podle tvaru: válcové, s kulatým dnem, cirkulační, věžové > podle způsobu dodávání energie: s mechanickým (elektromotor), pneumatickým (plyn) a hydrodynamickým (čerpadlo) mícháním > nesterilní (pivovarnictví, zpracování odpadů, sterilní (farmacie), speciální (GMO, tkáňové kultury) > kapalné medium, pevné medium aj. > aerobní, anaerobní Ukázky bíoreaktorů Musí odpovídat především biologickým vlastnostem kultivovaných mikroorganismů nebo buněk. Kromě toho je ale třeba respektovat i chemické, fyzikální ale i technologické parametry. Parametry bi oreo ktorú > Biologické vlastnosti = velikost mikroorganismů a jejich morfologie (jednobuněčné, vláknité, mnohobuněčné, plovoucí, přisedlé, ...) > Charakter substrátu = pevný, polotekutý, kapalný, plynný > Provzdušňování = povrchově nebo submerzně r Sterilizace = nutno vždy odstranit ostatní mikroorganismy > Velikost kultivačního zařízení = přechod v rozsahu jednoho objemového řádu > odolné vůči korozi - nesmí uvolňovat do média kovy > netoxické vůči populaci buněk > schopné sterilizace parou o vysokém tlaku > odolné vůči deformaci - míchadla, vstupní porty > transparentní materiály (sklo) > převedení zakonzervované buněčné kultury ve stavu klidu do živného média do produktivního stavu růstu a množení > několik tisíc buněk —► několik set litrů kultury > transfer do produkční nádoby se provádí na konci exponenciální fáze růstu > inokulum se do kultivační nádoby obvykle dodává v množství okolo 1- 5 % objemu Dílčí kroky při inokulacl > přenést konzervované buňky do reaktivačního média možnostem kontaminace média > sledovat kvantitu a fyziologický stav buněk (zjistit růstovou křivku) Jak monitorovat nárůst kultury > změna pH > spotřeba kyslíku > změna hmotnosti buněk po centrifugaci Stationary co i u í <" : o Log or / í E -• -C exponential / 1 IMF (JEL o _l \ Death Lag 1 l i l l 1 1 Time (hr.) Exponencionální rust kultury > z technologického hlediska nejvýhodnéjší > Lag-fáze > Fáze zrychleného růstu > Exponenciální (logaritmická) fáze > Fáze zpomalujícího růstu > Stacionární fáze růstu > Fáze postupného odumírání > časově omezený > Rychlost dělení > Generační doba > Doba lagu > Specifická růstová rychlost > Maximální růstová rychlost, saturační konstanta Lze je odvodit matematicky a jejich hodnoty je nutno chápat jako relativní, vycházející ze zjednodušeného pojetí růstu a množení buněk. Každá buňka se rozdělí na dvě, tedy N = N0 x 2n N0 = počet buněk na počátku N = počet buněk na konci Výpočet n: logN = logN0 + n x log2 Průměrná rychlost dělení (R) = počet generací (n) v závislosti na době růstu buněčné kultury R = n/t = 1/log2 x (logN-logN0)/(t-t0) t-t0 = doba růstu v hodinách G = Čas potřebný k vytvoření jedné generace > Je převrácenou hodnotou průměrné rychlosti dělení G = 1/R = log2 x (t-t0)/ (logN-logN0) > Platí jen pro exponenciální fázi růstové křivky Rovněž hodnota průměrné rychlosti dělení platí jen pro exponenciální fázi růstové křivky Časový interval mezi začátkem inokulace a zahájením exponenciální fáze růstu Specifická růstová rychlost dX/dt = časový přírůstek na jednotku biomasy dX/dt = u x X X = množství narostlé biomasy (počet buněk, OD, sušina) u = specifická růstová rychlost u = (lnX-lnX0)/t Odvozené vztahy, pokud pracujeme s počty buněk U = 0,693 x R, u = 0,693/G Odráží skutečnost, že hodnota specifické rychlosti růstu (u) je v exponenciální fázi závislá na koncentraci substrátu. u = um x [S/(KS + S)] um = maximální růstová rychlost S = koncentrace substrátu (esenciální živiny) Ks = saturační konstanta Stanovení um se využívá při studiu výživové hodnoty různých substrátů 72 Maximální růstová rychlost II Saturační konstanta Ks odpovídá koncentraci substrátu, pro níž specifická růstová rychlost odpovídá poloviční hodnotě um. Mnohonásobná logaritmická /é > Několik na sebe navazujících exponenciálních fází s různými hodnotami rychlosti dělení > Vyčerpání jedné živiny a přechod na jiný substrát > Např. kultivace E. coli za suboptimálních koncentrací C02 - umožňuje vznik karboxylovaných metabolitů, které mají povahu zásobních látek as Rosypal et al. 1981: Obecná bakteriologie Dvojitá růstová křivka (diauMie) > Ukončení exponenciální fáze růstu a zahájení další fáze lagu > V prostředí, které obsahuje směs látek jako zdroj uhlíku -nejprve využití jedné látky, pak teprve druhé, jejíž využití bylo tou první inhibováno > Např. kultivace E. coli za podmínek tzv. glukózového efektu Využívání Využívaní <}ivkÓ7g Rosypal et al. 1981: Obecná bakteriologie 76 1) Jaká je generační doba fermentované kultury E. coli, jestliže v čase T1 bylo množství bakterií 5 x 106/ml a po 2 hodinách (v čase T2) toto množství činilo 108/ml. 2) Z výše uvedených parametrů určete rychlost dělení bakteriální kultury Generační doba G = log2 x [(T2-T1)/(logN2 - log^)] = log2 x [120/(log108-log5x106)] = log2x [120/(8-6,7)] = log2x[120/1,3] = 28 minut Rychlost dělení R = 1/G = 1/28 = 0,036 ... počet rozdělení buňky za minutu Měření a regulace průběhu procesu Fyzikální > teplota, tlak páry, vody a stlačeného vzduchu, příkon, tvorba a množství pěny, průtok plynů a kapalin Fyzikálně chemické > pH, redox potenciál, množství rozpuštěného kyslíku, chemické činitele (koncentrace stimulátoru a inhibitorů růstu nebo tvorby produktů - C, N, P, S, Mg, K, Na , Fe, regulátory růstu, prekursory..., měření koncentrace NH4+5 Mg2+5 Na+5 Ca2+ P043" atd. specifickými elektrodami) Kontinuální kultivac Chemostat > Regulace závisí na změně koncentrace esenciálního substrátu, ostatní živiny jsou v nadbytku > Změnou rychlosti průtoku média se mění koncentrace esenciálního substrátu a tím i rychlost množení buněk Turbidostat > Regulačním činitelem je rychlost množení buněk > Jakmile dosáhne hustota buněk dané koncentrace, zvýší se průtok média - tím ubyde buněk vyplavením > Pokles hustoty znamená zpomalení průtoku cifíeká růstová rychlost/rychlost > Za ustáleného stavu se při kontinuální kultivaci specifická rychlost (m) rovná tzv. rychlosti zřeďovací D > Je-li p < D, pak se utvoří nový ustálený stav (více substrátu, méně buněk) a to až do hodnoty pmax < D, kdy dojde k vyplavení buněk z bioreaktoru D = F/V F = rychlost průtoku prostředí, V = objem > Je-li p > D, pak se vytvoří nový ustálený stav (méně substrátu vede ke snížení specifické růstové rychlosti Vlastnost kontinuálního spočívající ve vyrovnání hodnot specifické růstové rychlosti a ředící rychlosti označujeme jako samoregulační schopnost systému Synchronizace množení buněk Princip > Různá vývojová fáze buněk = dělení neprobíhá současně = nehomogenní kultura > Synchronizace = zastavení dělení, ale ponechání schopnosti růst Navození > Nejčastěji chladovým šokem > Náraz hladověním > Inokulace buňkami stejné velikosti získané filtrací nebo centrifugací Význam > Homogenní kultura = fyziologickým vlastnostem jedné buňky odpovídá celá populace iotechnologický kámen mudrců Standardní pojetí 1) Umí přeměňovat materiály 2) Umí vyrábět zlato 3) Prmasi vecne mladí Pojetí biotechnologa 1) Umí přeměňovat materiály 2) Vyrábí peníze 3) Radost z práce, ze života > Mějme k dispozici 30ml 12 hodinové kultury Escherichia coli v Erlenmeyerově baňce. Aproximujme a tvrďme, že se jedná o kulturu v exponenciální fázi růstu o koncentraci asi 5 x 108 buněk/ml, a že se množství buněk zdvojnásobí každých 20 minut. > Ptejme se na množství buněk, které vzniknou, pokud necháme kulturu dále růst v optimálních podmínkách po dobu 12 hodin. 86 Co se stan hodin ? > Každou hodinu se buňky rozdělí 3x, tedy za 12 hodin celkem 236x (asi 7 x 1010 nárůst) > Množství buněk za 12 hodin bude tedy 236 x 5 x 108/ml, tedy asi 3,4 x 1019 buněk/ml To si ale neumím představit Zkus se na to tedy podívat jinak > Zachovejme koncentraci buněk, ale měňme objem > Objem kultury se bude zdvojnásobovat každých 20 minut > Za 12 hodin vzroste objem naší kultury ze 30 ml na 236x 30 x 103 litrů = asi 2,06 x 109 litrů kultury ŕ-N No a.... ? L_ _J Za 12 hodin máme 2,06 x 109 litrů kultury Množství vytěžené ropy denně v roce 2020 bylo kolem 100 milionů barelů denně > 1 US barel je 0,159 m3 = 159 litrů > Denně se v roce 2011 vytěžilo asi 1,59 x 1010 litrů ropy Což znamená, že za 12 hodin růstu naše malá kultura za optimálních podmínek vzroste na objem něco málo přes 10% denního objemu těžené ropy! A nechrne ji růst ještě hodinu Kdybychom kulturu nechali růst jen o hodinu déle, tedy 13 hodin, pak by objem vzrostl na 239x 30 x 10"3 litrů = asi 1,65 x IQ10 litrů kultury, což denní těžbu ropy pohodlně pokryje 1) Pojem biotechnologický proces a jeho fázování 2) Suroviny pro fermentaci 3) Procesy sterilizace 4) Bioreaktory a fermentory 5) Procesy kultivace, růstové parametry buněčných kultur 6) Biotechnologický kámen mudrců