Biotechnologie léčiv – Aplikace biotechnologií ve farmacii Doc. RNDr. Jan Hošek, Ph.D. hosek@mail.muni.cz Ústav molekulární farmacie FaF MU Přehled základních biotechnologických výrob ve farmacii ➢ Enzymy ➢ Polysacharidy ➢ Steroidy ➢ Antibiotika ➢ Antimykotika ➢ Vitamíny ➢ Alkaloidy ➢ Hormony ➢ Aminokyseliny ➢ Cytokininy Dva přístupy ➢ Produkty získané klasickými technikami mikrobiální biotechnologie ➢ Produkty rekombinantních technologií Nejčastější produkt = ENZYMY ➢ příprava léčiv – antibiotika, steroidy, aminokyseliny ➢ léčiva – digestiva, rozpouštění krevních sraženin atd. ➢ diagnostické účely – součást detekčních souprav Využití enzymů ve farmacii Výstupní formy enzymu ➢ Enzymový preparát ➢ Enzym v čisté formě ➢ Imobilizovaný enzym ➢ Imobilizované buňky Příklady enzymů Proteázy ➢ trypsin, chymotrypsin, pepsin, chymosin ➢ papain, ficin, bromelain ➢ bakteriální proteázy (Bacillus) ➢ proteázy produkované plísněmi (Aspergillus) Glukosidázy ➢ α-amylázy, β-amylázy ➢ produkují bakterie (Bacillus) a plísně (Aspergillus) Medicína ➢usnadnění trávení škrobu při dyspepsii ➢omezení meteorismu před chirurgickým výkonem a v pooperačním období Potravinářství ➢výroba piva, alkoholických nápojů, lihovin ➢zpracování škrobu na glukózové a maltózové sirupy a krystalickou glukózu ➢sirupy s vysokým obsahem fruktózy Použití amyláz Původ ➢ pankreas ➢ pšeničné klíčky ➢ Aspergillus niger, Rhizopus sp., kvasinky Použití ➢ součást digestiv ➢ potravinářský průmysl – výroba sýrů Katalyzují hydrolýzu triacylglycerolů Lipázy Mechanismus ➢ hydrolýza penicilinu na kyselinu 6-aminopenicilanovou Původ ➢ Escherichia coli, Neurospora crassa, Torula sp., Rhodotorulla sp. Použití ➢ výroba polosyntetických penicilinů Hydrolázy štěpící vazby jiné než C-N Penicilinacyláza Příklady enzymů II. ➢ Produkty buněk schopné v nízkých koncentracích inhibovat růst jiných buněk ➢ Nejčastější producenti G+ bakterie rodu Streptomyces ➢ Příprava nových ATB modifikací známého ATB, tzv. mutační syntéza nové ATB Mutace MO produkující ATB + vhodný prekurzor ANTIBIOTIKA ➢ fyziologický účinek závisí na přesné poloze substituentů v základním skeletu ➢ chemická syntéza je velmi náročná Biotransformace steroidů 1) Kultivace mikroorganismu - nárůst biomasy 2) Přidání steroidu, následná biotransformace 3) Izolace do organického rozpouštědla 4) Purifikace chromatograficky a krystalizací STEROIDY O O 11α-hydroxylace příprava 11-a-progesteronu Rhizopus nigricans, R. arrhizus, Aspergillus ochraceus 11β-hydroxylace příprava kortisolu Curvularia lunata, Cunninghamella blakesleeana Příklady biotransformací I 16a-hydroxylace příprava 16a-hydroxy-9a-fluoroprednisolonu (triamcinolon) Streptomyces roseochromogenes dehydrogenace mezi C1-C2 Bacillus lensus, Arthrobacter simplex výroba prednisonu, prednisolonu, triamcinolonu, 6-methylprednisolonu, dexamethasonu… O O Příklady biotransformací II Zdroje Claviceps purpurea (pěstování na žitě) Claviceps paspali (submerzní kultivace) Sklerocia paličkovice nachové na žitu Výtrusnice na sklerociu NÁMELOVÉ ALKALOIDY esenciální živočišné nutriční faktory Výroba ➢ chemická syntéza ➢ izolace z přírodního materiálu ➢ mikrobiální biosyntéza ➢ biotransformace VITAMÍNY ➢ riboflavin (B2) ➢ kobalamin (B12) ➢ kyselina askorbová (C) ➢ ergosterol (D2, D3) ➢ provitamín A ➢ provitamín DDOI: 10.1533/9780857093547.2.571 ➢ Chemická syntéza ➢ Izolace z přírodních zdrojů ➢ Enzymové přeměny - kultivace MO obsahujících příslušný enzym - separace buněk - k buňkám se přidá substrát určený pro enzymovou přeměnu ➢ Biosynteticky - kultivace mikroorganismu - izolace AMK z kultury AMINOKYSELINY Bakterie přirozeně se vyskytující - Corynebacterium - Brevibacterium - Micrococcus Rekombinantní kmeny - Escherichia coli - Serratia marcescens ➢ lídrem jsou USA (Food and Drug Administration) ➢ desítky léčiv, všechny na bázi proteinů ➢ hormony ➢ enzymy ➢ hematopoetické růstové a koagulační faktory ➢ cytokiny a interferony ➢ protilátky a jejich deriváty ➢ vakcíny ➢ další produkty Typy rekombinantních léčiv rozdílné biologické účinky alterace sekvence aminokyselin změny farmakokinetiky širší léčebné postupy Rekombinantní hormony r. 1979 - Goeddel a kol. - produkce inzulínu a somatotropinu pomocí Escherichia coli r. 1982 (28.10.) - inzulín - první klinicky použitý rekombinantní hormon (USA) (Humulin-R, Eli Lilly a Genentech) r. 1985 - somatotropin Rekombinantní hormony byly první Lispro (HUMALOG) ➢ obrácené pořadí lysinu a prolinu v pozici B28 a B29 ➢ produkce v Escherichia coli ➢ krátce působící inzulín Aspart (NOVORAPID) ➢ substituce prolinu kyselinou asparagovou v pozici B28 ➢ Saccharomyces cerevisiae ➢ krátce působící inzulín Analoga inzulínu Glargin (LANTUS) ➢ adice 2 argininů k C-konci řetězce B a náhrada asparaginu glycinem na A21 ➢ Escherichia coli ➢ prodloužený účinek Detemir ➢ odstranění threoninu na B30 a acylace (kys. myristová) lysinu na pozici B29 ➢ prodloužený účinek Další typy inzulínu ➢ rychlejší a pravidelnější vstřebávání z podkoží ➢ nejlépe napodobují prandiální sekreci ➢ léčba nemocných od 3 let ➢ kratší biologický účinek – nižší riziko hypoglykémie Výhody oproti lidským krátkodobě působícím inzulínům Polypeptidový hormon (29 AMK) Účinky ➢ glykogenolytické ➢ hyperglykemizující ➢ relaxace hladké svaloviny GIT Příprava ➢ Escherichia coli ➢ Saccharomyces cerevisiae Indikace ➢ hypoglykémie ➢ radiologická vyšetření – inhibice pohybu GIT Glukagon Druhově specifický polypeptid (191 AMK) Účinky ➢ stimulace růstu ➢ zvyšuje proteosyntézu ➢ snižuje proteokatabolismus Indikace ➢ poruchy růstu Příprava ➢ Escherichia coli (od konce 80. let) Somatotropin folikulostimulační hormon (FSH) Dvě podjednotky – alfa (92 AMK), beta (111 AMK) Produkce ➢ ovariální buňky čínského křečka Indikace ➢ anovulační cykly ➢ amenorea ➢ poruchy spermatogeneze urofollitropin Folitropin Příprava léčiv ➢ antibiotika, steroidy, aminokyseliny Léčiva ➢ digestiva (rozpouštění krevních sraženin, léčba leukémie) Diagnostické účely ➢ Taq polymeráza ➢ Restrikční endonukleázy Rekombinantní enzymy Epoetin α (165 AK, glykosylovaný) Účinky stimulace tvorby krevních buněk Příprava savčí buňky Indikace léčba anémie Hematopoetické a růstové faktory Interferony α, β, γ Interleukin IL-2 Účinky imunomodulační účinky Příprava Escherichia coli Indikace terapie nádorových onemocnění Cytokiny a interferony Protilátky DOI:10.3389/fmicb.2017.00495 Existuje několik strategií produkce http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3548171/ ➢ Metody reverzní genetiky ➢ Rekombinantní subjednotkové vakcíny ➢ Produkce „virus-like“ částic ➢ DNA a RNA vakcíny ➢ Vakcíny na bázi virových vektorů Rekombinantní vakcíny Snad příští týden… ovce Polly ➢ srážecí krevní faktor IX ➢ léčba hemofilie kozy ➢ antitrombin III ➢ zabraňuje vzniku krevních sraženin ➢ GTC Biotherapeuticals, USA krávy ➢ lidský laktoferin ➢ Pharming, Nizozemí Transgenní zvířata Biotechnologické produkty pro terapeutické použití musí být přesně specifikovány, zvláště když jsou určeny k parenterální aplikaci. doi: 10.1002/0471140864.ps0601s80 krystalizace, odpařování, sušení, lyofilizace tekutá kultura úprava kultivační tekutiny úprava pH, zahřátí, přídavek látek způsobujících koagulaci proteinů a buněk separace buněk odstředění nebo filtrace produkt v kapalině (extracelulární) produkt v buňkách (intracelulární) izolace produktu srážení, extrakce, chromatografie dezintegrace buněk Enzymatická chemická fyzikální oddělení buněčných stěn produkt konečné úpravy produktu odstředění nebo filtrace Izolace a čištění produktů Differential centrifugation of E. coli cell lysates. Cells are broken with a French press or by lysozyme treatment. Insoluble (inclusion body) proteins, from either the cytoplasm or periplasm, are located in the low-speed pellet, which is subjected to preextraction to remove outer membrane and peptidoglycan material. Inclusion bodies are extracted from washed pellets with strong protein denaturants such as guanidine·HCl. The solubilized protein, which is denatured and reduced (free sulfhydryl residues), is either directly folded and oxidized (disulfide bonds formed) or purified before folding. Soluble proteins (from the periplasm and cytoplasm) are located in the low-speed and high-speed supernatants. The latter can be used directly for chromatography, whereas the former requires clarification by other techniques such as ammonium sulfate fractionation or membrane filtration. Curr Protoc Protein Sci. 2015; 80: 6.1.1–6.1.35. Published online 2015 Apr 1. doi: 10.1002/0471140864.ps0601s80 Localization of secreted and periplasmic proteins in E. coli. Periplasmic protein produced via a secretion vector can leak into the medium and be recovered by centrifugation (supernatant, S1) or filtration. Washing cells with an isotonic solution such as lightly buffered 0.15 M NaCl or 0.25 M sucrose can also release protein (S2). The compartmentalized periplasmic proteins are released by isotonic shock treatment by directly suspending normal cell paste or plasmolyzed cell paste into hypotonic medium. Plasmolyzed cell paste is derived by suspending cells in hypertonic medium and then pelleting. (In hypertonic medium the cell contracts, separating the inner membrane from the cell wall, and is said to be osmotically sensitized.) The hypertonic wash often releases protein (P1). The supernatant from shocked cells (P2) will contain constitutive E. coli proteins and the recombinant product. Osmotically sensitized cells can also be treated with lysozyme to fragment the outer membrane, thus releasing periplasmic proteins (P3).The pellet from the lysozyme treatment contains spheroplasts (cells with fragmented outer membranes), which are easily disrupted by detergents, sonication, or hypotonic shock to release cytoplasmic proteins. Purification of soluble proteins from bacterial cell and other cell lysates. Abbreviations for ion-exchange resins are as follows: CM, carboxymethyl; DEAE, diethylaminoethyl; Q, quaternary ammonium; S, methyl sulfonate. The order of preference for the stages of ion-exchange (2) and other methods (3) is based on the author’s opinion and does not necessarily represent a consensus view. On the other hand, the use of a DEAE-based matrix at an early stage (1) is common practice. Affinity methods (see text and Chapter 9) can be performed at any stage following clarification of the lysate. Folding and purification of inclusion body proteins from E. coli. The protein is extracted with protein denaturants such as guanidine·HCl (Gu·HCl), urea, or an organic acid. The reductant dithiothreitol (DTT) is included to prevent artificial disulfide bond formation (especially intermolecular bonds). The denatured protein can be purified by various methods and then folded, or it can be directly folded. Typically, some purification (e.g., gel filtration in Gu·HCl) prior to folding is recommended as it often results in higher folding yields. Protein folding and oxidation are carried out concurrently. Disulfide bond formation is catalyzed by lowmolecular-weight thiol/disulfide pairs such as reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione. GSH/GSSG ratios of 5:1 to 10:1 are normally used, which are similar to those found in vivo in the endoplasmic reticulum (Hwang et al., 1992). A cosolvent is included to maintain solubility during folding. Folded protein is purified if necessary (purification is usually needed if the protein is directly folded). Gel filtration is a useful final step for removing aggregated and or misfolded protein. Preparation of washed pellets using lysozyme and the French press. Cells are broken with the French press with or without prior treatment with lysozyme. After low–speed centrifugation using a fixed-angle rotor, the contents of the centrifuge tubes have the characteristics shown. The contents of tubes A and B are labeled: s, supernatant; lp, loose pellet; ib, inclusion body protein; and c, unbroken cells and large cellular debris. The loose pellet material is derived from the outer cell wall and outer membrane (see text for further details). After washing the insoluble material (UNIT 6.3), the pellet should consist mainly of the inclusion body layer (tube C), and the supernatant should be fairly clear. ➢ Kvalita se obvykle vyjadřuje v termínech čistoty a reprodukovatelnosti. ➢ Čistota farmaceutických přípravků je většinou vyšší než 99%, pokud jsou podávány parenterálně. ➢ To platí i pro proteinová terapeutika, u kterých je výsledná čistota velmi závislá na procesu purifikace. Kontaminující složky ➢ Hostitelský organismus ➢ Produkt ➢ Proces Původ kontaminujících složek proteinových farmaceutik ➢ Viry ➢ Proteiny a DNA hostitele ➢ Glykosylační varianty ➢ Variantní N a C konce ➢ Endotoxiny (u gram-negativních hostitelů) Kontaminující složky hostitelského organismu ➢ Substituce a delece aminokyselin ➢ Denaturace proteinu ➢ Konformační izomery ➢ Dimery a agregáty ➢ Varianty disulfidických můstků ➢ Deaminované proteiny ➢ Fragmenty proteinů Kontaminující složky původem z produktu ➢ Komponenty růstového média ➢ Purifikační reagencie ➢ Kovy ➢ Materiály purifikačních kolon Kontaminující složky vzniklé v rámci procesu Kategorie Způsob Příklad Inaktivace viru Teplo Pasterizace Záření UV záření Dehydratace Lyofilizace Kroslinkující látky, denaturace, rozklad ß-propionolakton, formaldehyd, NaOH, org. rozpouštědla, detergenty Neutralizace Specifické protilátky Odstranění viru Chromatografie Iontoměničová, imunoafinitní Filtrace nanofiltrace Precipitace kryoprecipitace Jak se zbavit virových částic? Filtrace přes 15 nm membrány, kterými lze zachytit i ty nejmenší známé neobalené viry typu bovinního parvoviru Co je to nanofiltrace? ➢ Bakterie z buněčných kultur lze snadno odstranit filtrací ➢ Pracovat sterilně, čisté prostory (sterilizace vzduchu) ➢ Pracovat pod antibiotiky, která se ale pak dají jen nesnadno odstranit! Bakterie jako kontaminující složka Pyrogeny – různě velké látky s různou strukturou ➢ Citliví lidé – horečka až s fatálními následky ➢ Odstranit iontoměničovou chromatografií ➢ Horkovzdušná sterilizace nástrojů Mykoplasmata ➢ Mění charakteristiky metabolismu, růst, životnost buněk, apod. ➢ Odstranit gentamycinem nebo ciprofloxacinem Čím ještě bakterie škodí? ➢ Při použití savčích buněk se v médiu vyskytují fragmenty DNA ➢ Jaká je bezpečná úroveň? ➢ Evropský lékopis doporučuje, aby množství DNA v konečném preparátu terapeutického proteinu nepřesáhlo 100 pg až 10 ng denní dávky podle druhu kultivačního systému Buněčná DNA jako kontaminující složka ➢ „Cizí“ proteiny mohou být rozpoznány jako antigeny → imunitní odpověď za kterou rekombinantní protein nemůže ➢ Zdrojem hostitelská buňka nebo médium ➢ Pozor na varianty rekombinantních proteinů! ➢ Detekce kontaminujících proteinů imunologicky Kontaminující proteiny Separace buněk ➢ centrifugace ➢ filtrace (bubnové rotační filtry) Dezintegrace buněk ➢ enzymatická: lysozym ➢ chemická: alkálie, detergenty ➢ fyzikální: osmotický šok, drcení buněk s abrazivy, ultrazvuk ➢ centrifugace ➢ filtrace Oddělení buněčných stěn Izolace produktu z kapaliny ➢ Extrakce ➢ systém dvou nemísitelných rozpouštědel ➢ při izolaci proteinů PEG a dextran nebo PEG a specifické soli jako K3PO4 nebo NH4SO4 ➢ Srážení (precipitace) ➢ vysolování proteinů NH4SO4 ➢ srážení organickými rozpouštědly (EtOH, aceton, …) ➢ Chromatografické metody (gelová, ionexová, bioafinitní, adsorpční) ➢ Elektromigrační metody (elektroforéza, isoelektrická fokusace, isotachoforéza) Konečné úpravy produktu Odpařování Sušení ➢ vakuové odparky ➢ pozor na termolabilní látky ➢ pro termolabilní enzymy, jsou nejvhodnější deskové (filmové) odparky ➢ odnímání vody a těkavých látek z produktu ➢ sušárny pásové, lískové, bubnové, rozprašovací ➢ sušárny fluidní-proudové (profoukávání materiálu teplým vzduchem) časté ve farmaceutickém průmyslu Izoelektrická fokusace Dvourozměrná elektroforéza ➢ Pohyb proteinů v gradientu pH po aplikaci elektrického pole ➢ Proteiny migrují do tzv. „izoelektrického bodu“ ➢ Separace izoelektrickou fokusací – na základě elektrického náboje ➢ Separace elektroforézou – na základě velikosti Chromatografie ➢ Separace na základě odlišné propustnosti proteinů náplní chromatografické kolony Metody separace proteinů Hmotnostní spektrometrie Detekce protilátkami ➢ Na základě poměru hmotnosti a náboje ionizovaných molekul (MALDI-TOF) ➢ Protilátky polyklonální ➢ Protilátky monoklonální ➢ Western blot ➢ Imunoprecipitace, imunocytochemie a imunohistochemie Metody identifikace proteinů ➢ Je souhrnné označení pro skupinu fyzikálněchemických separačních metod ➢ Slouží k separaci a analýze složitých směsí látek ➢ Molekuly analyzované látky se u všech typů chromatografických separací rozdělují mezi tzv. stacionární a mobilní fázi ➢ Dělení je založeno na rozdílné distribuci složek směsi mezi mobilní a stacionární fázi Chromatografické metody Podle účelu použití ➢ analytická chromatografie ➢ preparativní chromatografie Podle fyzikálně-chemického principu ➢ adsorpční chromatografie ➢ rozdělovací chromatografie ➢ iontově výměnná chromatografie ➢ gelová chromatografie ➢ (bio)afinitní chromatografie Druhy chromatografických metod I Podle skupenství mobilní fáze ➢ kapalinová chromatografie ➢ plynová chromatografie Podle uspořádání stacionární fáze ➢ kolonová (sloupcová) chromatografie ➢ kapilární chromatografie ➢ chromatografie na tenké vrstvě (tenkovrstvá chromatografie) ➢ chromatografie na papíře Druhy chromatografických metod II ➢ biologicky aktivní látky tvoří rozsáhlou skupinu sloučenin se speciálními funkcemi ➢ změny pH, iontové síly, koncentrace kovových iontů, kofaktorů atp. mohu mít za následek velké ovlivnění izolovaných biologicky aktivních molekul ➢ aby během izolace nedocházelo ke ztrátám jejich biologické aktivity, je nutné použít pokud možno co nejmírnější separační metody Chromatografie ➢ nízká koncentrace biologicky aktivních látek ➢ směs mnoha podobných látek První stupeň izolace = adsorpce ➢ biospecifická afinitní chromatografie ➢ při fyziologických hodnotách pH je většina proteinů negativně nabitých → sorpce na anex Další stupeň izolace ➢ gelová chromatografie ➢ elektroforetické metody Strategie při purifikaci - I Izolaci čisté biologicky aktivní látky dosahujeme nejčastěji kombinací několika separačních metod Při volbě purifikačního schématu bychom měli dbát na to, aby se neopakovaly metody založené na stejném dělícím principu Strategie při purifikaci - II Je založena na rozdílné adsorpci látek na povrchu sorbentu, tvořícího stacionární fázi ➢ Látky, které jsou za daných podmínek silněji vázány sorpčními silami, jsou v jednotlivých úsecích naadsorbovány častěji a déle než látky jiné ➢ Sorbenty stacionární fáze se liší polaritou nebo kyselostí ➢ nepolární – aktivní uhlí, polární kyselý silikagel (SiO2), polární bazický hydratovaný oxid hlinitý nebo hořečnatý ➢ Mobilní fáze – směsi rozpouštědel (… chloroform, etanol, …) ➢ U plynové adsorpční chromatografie dusík nebo hélium Adsorpční chromatografie Je založena na založena na rozdílné rozpustnosti dělených látek ve dvou různých kapalinách, tedy na rozdílných hodnotách rozdělovacího koeficientu (α = cm/cs) ➢ Jedna z použitých kapalin je mobilní fází, druhá je potom zakotvena na nějakém nosiči a tvoří tak stacionární fázi ➢ Vyšší hodnota α = silnější vazba na stacionární složku = pomalejší průtok kolonou ➢ Normální fáze = ukotvenou stacionární fází je voda ➢ Obrácená fáze = ukotvenou stacionární fázi tvoří nízkopolární organické kapaliny ➢ Nosiče – SiO2, sklo, polymery, škrob, celulóza, aj. Rozdělovací chromatografie ➢ základem je vratná výměna iontů mezi mobilní kapalnou a stacionární fází ➢ stacionární fáze – ionexy (anex nebo katex) Iontovýměnná (ionexová) chromatografie Gendeh, Gurmil et al. “Exploration of pH-Gradient Ion-Exchange Chromatograp y High-Resolution Protein Separations in Biotechnology d Pr teomics.” (2012). Aktivace kolony Nanesení vzorku Adsorbce částic ElucePromytí kolony produkt Průběh ionexové chromatografie Separace makromolekul na základě rozdílné velikosti jednotlivých látek na pórovité stacionární fázi (gelová filtrace) ➢ agaróza ➢ zesíťovaný dextran (Sephadex) ➢ polyakrylamid (BioGel P) ➢ celulosa (Cellufin) ➢ materiály založené na silikagelu nebo porézním skle Stacionární fáze - inertní porézní materiál nasycený kapalinou Gelová chromatografie Jinými slovy: je založena na rozdílné průchodnosti otvorů a dutých výklenků na částicích stacionární fáze pro různě velké částice dělené směsi Gelová chromatografie https://www.mblbio.com/bio/g/support/method/chromatography.html Při průchodu směsi látek porézní stacionární fázi dochází k tomu, že ➢ malé molekuly jsou schopny difundovat dovnitř pórů matrice a jejich pohyb je tedy zpomalen ➢ velké molekuly se nezachytí a prochází matricí rychleji – čím větší molekula, tím rychleji prochází ven z kolony ➢ Postupným promývání mobilní fází se ven z kolony vymyjí i malé molekuly ➢ Důležité je, aby mezi děleným roztokem a matricí nedocházelo k žádným vazbám nebo k denaturaci děleného materiálu Princip gelové chromatografie Malé molekuly mohou „vstoupit“ dovnitř Velké molekuly nemohou „vstoupit“ dovnitř Zesíťované částice gelu Gelová filtrace Principem izolační metody je interakce izolovaného proteinu s ligandem vázaným na pevný nosič založena na výjimečné vlastnosti biologicky aktivních látek tvořit pevné specifické reversibilní komplexy s jinými komplexotvornými sloučeninami, tzv. afinitními ligandy enzym – substrát, kofaktor – efektor, protilátka – antigen, hormon – receptor, apod. Ligand = sloučenina, která s danou izolovanou látkou tvoří biospecifický reversibilní komplex Afinitní (bioafinitní) chromatografie Jako ligand může být použita každá sloučenina, která s danou izolovanou látkou tvoří biospecifický reversibilní komplex ➢ imobilizované pyridinové nebo adeninové nukleotidy ➢ barviva s antrachinonovou strukturou ➢ imobilizovaný hemoglobin nebo kasein pro proteolytické enzymy ➢ musí obsahovat funkční skupinu, kterou se kovalentně váže na pevný nosič ➢ musí mít dostatečnou afinitu k izolované látce Ligandy v afinitní chromatografii http://dx.doi.org/10.1016/j.sbi.2014.04.006 Metoda stanovení molekulové hmotnosti ➢ Rozděluje proteiny (peptidy) podle poměru jejich hmoty a náboje ➢ Molekula se nejprve ionizuje metodou MALDI nebo ESI (electrospray ionization) ➢ Vzniklé ionty jsou vtaženy do analyzátoru elektrickým polem, kde se rozdělují podle poměru hmotnosti a náboje ➢ Následuje počítačové zpracování dat Hmotnostní spektrometrie matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight ➢ varianta hmotnostní spektrometrie ➢ peptidy jsou ionizovány a stanoví se poměr hmoty k náboji na základě doby letu (time-of-flight) k detektoru ➢ vypočte se M a ta je specifická pro každou aminokyselinu Princip MALDI-TOF 1) Není zapotřebí sekvenovat proteiny 2) Stačí jen znalost molekulové hmotnosti 1) Nelze analyzovat multimerní proteiny 2) Měla by být známá sekvence AK Výhody a nevýhody ➢ Slouží ke studiu výsledků translace ➢ Vznikají jako reakce organismu na antigen Oblast antigenu rozeznávaná protilátkou se označuje jako epitop Protilátky jako základní detekční a identifikační nástroj Lineární ➢ Váží se na ně protilátky bez ohledu na konformaci ➢ Rozpoznávají např. denaturované proteiny Konformační ➢ Váží se na ně protilátky v závislosti na způsobu poskládání polypeptidového řetězce ➢ Protilátky specifické pro konformační epitopy budou reagovat pouze s proteiny o přirozené konformaci Epitopy ➢ Identifikace polypeptidů protilátkami po rozdělení na denaturačním PAGE (alkalický pufr = proteiny získají negativní náboj ➢ Rozpoznání neprobíhá v gelu, ale po přenesení polypeptidů na membránu jako u Southernova přenosu Imunoblotting Western blotting Výsledek imunoblottingu ➢ Slouží k izolaci specifických proteinů z proteinových směsí prostřednictvím protilátek ➢ Používá se ke studiu interakcí mezi proteiny Imunoprecipitace https://www.leinco.com/immunoprecipitation/