Biotechnology of Drugs - Practical Classes
photo practical class 3
Navážíme 1,0 g nadzemních mladých částí rostliny Amaranthus caudatus (tato část rostliny obsahuje tenkostěnné buňky vhodné pro izolaci DNA):

Navážení provedeme do porcelánové třenky:
Třenku pak zalijeme tekutým dusíkem (-196 °C) - rostlinné pletivo zkřehne a lépe se rozdrobí, zároveň dojde k potlačení rozkladných enzymatických reakcí po popraskání buněčných vakuol a stěn. V tomto bodě je postup odlišný od izolace plazmidové DNA. Obě buňky bakteriální i rostlinná obsahují buněčnou stěnu, tak je však u bakterií výrazně slabší. Rostlinná buněčná stěna naopak obsahuje celulózu, lignin a další látky těžko rozložitelné, proto kromě chemické lyze a vortexování, zapojujeme ještě zmíněný tekutý dusík:
Těrkou je třeba rostlinný materiál pořádně podrtit, dokud se veškerý dusík neodpaří. S tekutým dusíkem je třeba pracovat maximálně opatrně, aby nedošlo ke zranění:
Nadrcený rostlinný materiál přeneseme pomocí plastových kartiček do plastové mikrozkumavky:
Analogickým způsobem obereme a pracujeme čerstvě narostlé klíčky bramboru Solanum tuberosum:
Pro maximální výtěžnost je zase třeba materiál zalít tekutým dusíkem:
Do obou mikrozkumavek (s amarantem i bramborem) napipetujeme 400 µl pufru PL1. Vzhledem k tomu, že obsahuje detergenty, chelatační činidla, atd. dojde k ještě větší desintegraci buněčného obsahu:
Oba vzorky poté vortexujme 30 sekund pro důkladné promíchání:
Pak přidáme dalších 400 µl pufru PL1:
A opět důrazně vortexujeme:
K oběma vzorkům pak přidáme 10 µl roztoku enzymu RNázy A, který předtím uchováváme v lednici:
Teplotní optimum tohoto enzymu je do 70°C, proto obě mikrozkumavky inkubujeme 20 minut při 65°C. Tento enzym byl měl (jak vyplývá z názvu) rozložit veškerou RNA ve vzorcích, aby nám pak nerušila stanovení konc. DNA spektrofotometricky - proto také stanovujeme poměr A260/A280:
Po inkubaci obou mikrozkumavek centrifugujeme maximální rychlostí (14 000xg; 5 minut), abychom oddělili zbytky rostlinného pletiva (po centrifugaci dole) od extraktu (supernatant). Část supernatantu (cca 500 µl) do kolonky s fialovým proužkem. Kolonku i se sběrnou mikrozkumakou pak centrifugujeme další 2 minuty maximální rychlostí. Tento krok slouží k odstranění lipidů, proteinů a sacharidů ze supernatantu - nás totiž zajímá hlavně DNA:
Po dokončení centrufugaci tedy vyhazujeme kolonku a uchováváme roztok, který se přefiltroval:
K filtrátu k předchozího kroku přidáme 450 µl pufru PC a vortexujeme. Pufr PC obsahuje jednomocné sodné a draselné kationty, které se záporně nabitou DNA tvoří komplexy a následně dochází až k precipitaci DNA, tedy vytvoření sraženiny:
Vortex kvůli promíchání:
Vznikající sraženinu DNA zachytíme na kolonce se zelným pruhem. Přepipetujeme maximum vzorku (cca 700 µl):
A centrifugujeme jednu minutu:
DNA se nám v tomto kroce zachytí na membráně kolonky, proto vyhazujeme filtrát a uchováváme kolonku!
Do kolonky napipetujeme 450 µl pufru PW1. PW1 pufr slouží k promytí zachycené DNA:
Kolonku s DNA centrifugujeme jednu minutu:
Poté přidáme do kolonky 700 µl pufru PW2 - zase na promytí, tento pufr obsahuje ethanol:
Filtrát, který po centrifugaci projde kolonkou vyhodíme:
Kolonku se zeleným pruhem vložíme do nové, čisté mikrozkumavky. Část pufru PE přepipetujeme do další čisté mikrozkumavky a inkubujeme několik minut při 65 °C.
Následující