Biotechnology of Drugs - Practical Classes

photo practical class 3

Navážíme 1,0 g nadzemních mladých částí rostliny Amaranthus caudatus (tato část rostliny obsahuje tenkostěnné buňky vhodné pro izolaci DNA): 

Navážení provedeme do porcelánové třenky: 

Třenku pak zalijeme tekutým dusíkem (-196 °C) - rostlinné pletivo zkřehne a lépe se rozdrobí, zároveň dojde k potlačení rozkladných enzymatických reakcí po popraskání buněčných vakuol a stěn. V tomto bodě je postup odlišný od izolace plazmidové DNA. Obě buňky bakteriální i rostlinná obsahují buněčnou stěnu, tak je však u bakterií výrazně slabší. Rostlinná buněčná stěna naopak obsahuje celulózu, lignin a další látky těžko rozložitelné, proto kromě chemické lyze a vortexování, zapojujeme ještě zmíněný tekutý dusík: 

Těrkou je třeba rostlinný materiál pořádně podrtit, dokud se veškerý dusík neodpaří. S tekutým dusíkem je třeba pracovat maximálně opatrně, aby nedošlo ke zranění: 

Nadrcený rostlinný materiál přeneseme pomocí plastových kartiček do plastové mikrozkumavky: 

Analogickým způsobem obereme a pracujeme čerstvě narostlé klíčky bramboru Solanum tuberosum: 

Pro maximální výtěžnost je zase třeba materiál zalít tekutým dusíkem: 

Do obou mikrozkumavek (s amarantem i bramborem) napipetujeme  400 µl pufru PL1. Vzhledem k tomu, že obsahuje detergenty, chelatační činidla, atd. dojde k ještě větší desintegraci buněčného obsahu: 

Oba vzorky poté vortexujme 30 sekund pro důkladné promíchání: 

Pak přidáme dalších 400 µl pufru PL1: 

A opět důrazně vortexujeme: 

K oběma vzorkům pak přidáme 10 µl roztoku enzymu RNázy A, který předtím uchováváme v lednici: 

Teplotní optimum tohoto enzymu je do 70°C, proto obě mikrozkumavky inkubujeme 20 minut při 65°C. Tento enzym byl měl (jak vyplývá z názvu) rozložit veškerou RNA ve vzorcích, aby nám pak nerušila stanovení konc. DNA spektrofotometricky - proto také stanovujeme poměr A260/A280: 

Po inkubaci obou mikrozkumavek centrifugujeme maximální rychlostí (14 000xg; 5 minut), abychom oddělili zbytky rostlinného pletiva (po centrifugaci dole) od extraktu (supernatant). Část supernatantu (cca 500 µl) do kolonky s fialovým proužkem. Kolonku i se sběrnou mikrozkumakou pak centrifugujeme další 2 minuty maximální rychlostí. Tento krok slouží k odstranění lipidů, proteinů a sacharidů ze supernatantu - nás totiž zajímá hlavně DNA: 

Po dokončení centrufugaci tedy vyhazujeme kolonku a uchováváme roztok, který se přefiltroval:

K filtrátu k předchozího kroku přidáme 450 µl pufru PC a vortexujeme. Pufr PC obsahuje jednomocné sodné a draselné kationty, které se záporně nabitou DNA tvoří komplexy a následně dochází až k precipitaci DNA, tedy vytvoření sraženiny: 

Následující