VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO
FARMACEUTICKÁ FAKULTA
Ústav chemických léčiv
Cvičení z analytické chemie 2
Analytická chemie kvantitativní
Jiří Pazourek
Iva Kapustíková
Klára Odehnalová
Tato výuková opora vznikla v rámci řešení projektu:
„Zvyšování pedagogických, manažerských a odborných dovedností pracovníků VFU“
s registračním číslem CZ.1.07/2.2.00/28.0110.
Tento projekt je spolufinancován Evropským sociálním fondem
a státním rozpočtem České republiky.
BRNO 2014
Cvičení
z Analytické
chemie 2
Jiří Pazourek, Iva Kapustíková, Klára Odehnalová
Ústav chemických léčiv
Farmaceutická fakulta VFU Brno
Analytická chemie
kvantitativní
1
Obsah
SLOVO AUTORŮ ...............................................................................................3
LABORATORNÍ CVIČENÍ 1 – GRAVIMETRIE. STANOVENÍ ŽELEZITÉ SOLI JAKO
OXIDU ŽELEZITÉHO ..........................................................................................4
Úvod.............................................................................................................4
Stanovení železité soli jako Fe2O3 ................................................................6
LABORATORNÍ CVIČENÍ 2 – NEUTRALIZAČNÍ TITRACE. STANOVENÍ
NEROZPUSTNÉHO UHLIČITANU ZPĚTNOU TITRACÍ .........................................8
Úvod.............................................................................................................8
Stanovení nerozpustného uhličitanu zpětnou titrací ..................................9
LABORATORNÍ CVIČENÍ 3 – CHELATOMETRIE. STANOVENÍ DVOU KATIONTŮ
VEDLE SEBE ....................................................................................................10
Úvod...........................................................................................................10
Chelatometrické stanovení dvou kationtů vedle sebe ..............................10
LABORATORNÍ CVIČENÍ 4 – FOTOMETRIE. METODA KALIBRAČNÍ KŘIVKY ....12
Úvod...........................................................................................................12
Fotometrie .............................................................................................12
4A. Stanovení Cu2+
Chelatonem III.............................................................14
Optimalizace podmínek stanovení.........................................................14
Fotometrické stanovení Cu2+
Chelatonem III pomocí kalibrační křivky.15
4B. Stanovení fenazonu v Antipyrinu železitými ionty ..............................17
Fenazon..................................................................................................17
Fotometrické stanovení fenazonu v Antipyrinu železitými ionty pomocí
kalibrační křivky .....................................................................................17
Optimalizace podmínek stanovení.........................................................18
LABORATORNÍ CVIČENÍ 5 – POTENCIOMETRICKÁ TITRACE...........................19
Úvod...........................................................................................................19
2
Vyhodnocení bodu ekvivalence (BE)......................................................21
5A. Argentometrické stanovení halogenidů ve směsi s potenciometrickou
indikací bodu ekvivalence..........................................................................22
Úvod.......................................................................................................22
Potenciometrická titrace........................................................................23
5B. Alkalimetrické stanovení kyseliny fosforečné s potenciometrickou
indikací bodu ekvivalence..........................................................................25
Úvod.......................................................................................................25
Potenciometrická titrace........................................................................26
LABORATORNÍ CVIČENÍ 6 – VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ
CHROMATOGRAFIE........................................................................................28
Úvod - Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) .........................28
Chromatogram.......................................................................................29
Stanovení kofeinu v Acifeinu .....................................................................32
A. Přístroj HPLC YL9100..........................................................................35
B. Přístroj HPLC Agilent, System 1200....................................................38
LABORATORNÍ CVIČENÍ 7 – KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA..............................41
Úvod - Kapilární elektroforéza (CE)............................................................41
Teorie .....................................................................................................41
Kapilární zónová elektroforéza (Capillary Zone Electrophoresis, CZE) ..42
Stanovení kyseliny acetylsalicylové v Acifeinu...........................................44
A. Přístroj CE3D Agilent..........................................................................49
B. Přístroj PrinCE 500 .............................................................................54
LITERATURA A ZDROJE...................................................................................58
3
SLOVO AUTORŮ
Tato skripta navazují na „Cvičení z Analytické chemie 1, analytická
chemie kvalitativní“. Jsou určena pro magisterský studijní program Farmacie
vyučovaný na Farmaceutické fakultě VFU Brno.
Skladba úloh vychází z původních skript „R. Opatřilová, J. Jampílek, I.
Liška, Návody do cvičení z analytické chemie. Kvantitativní analýza, VFU
Brno, 2007“, ale jsou modernizované (instrumentální úlohy) a zaměřené na
konkrétní analyty i instrumentaci tak, aby odpovídaly možnostem a
potřebám výuky.
Proto bychom chtěli zdůraznit, že tato skripta v žádném případě
nenahrazují učebnici analytické chemie; jedná se pouze o praktické návody
na provedení konkrétních laboratorních cvičení, vždy s nezbytným minimem
teorie v úvodu. Navíc v úlohách, kde se používají složitější přístroje (HPLC,
CE), jsou také nezbytné informace k pochopení příslušného softwaru.
Studentům FaF VFU Brno doporučujeme jako přípravu na cvičení i
zkoušku materiály nacházející se v e-learningovém systému MOODLE,
https://amos.vfu.cz/moodle v předmětu „Analytická chemie II (cvičení)“,
případně „Analytická chemie II“. Pro hlubší náhled do problematiky lze
doporučit učebnici „Karlíček a kol., Analytická chemie pro farmaceuty,
Praha, Karolinum 2005“.
Autoři
červenec 2014
J.P., K.O., červenec 2018
J.P., K.O., leden 2020
4
LABORATORNÍ CVIČENÍ 1 – GRAVIMETRIE. STANOVENÍ
ŽELEZITÉ SOLI JAKO OXIDU ŽELEZITÉHO
ÚVOD
Vážková analýza neboli gravimetrie patří k nejstarším kvantitativním
analytickým technikám. Vážková analýza zahrnuje všechny analytické
techniky, při nichž se z měření hmotnosti (nebo jejich změn) stanovuje přímo
hmotnost analytu ve vzorku (proto je to absolutní metoda). Tato metoda, ač
je časově náročná, je technicky velice jednoduchá, není zatížená
systematickou chybou (je správná), a proto mnohdy slouží jako referenční.
Začátkem gravimetrické analýzy je převedení stanovovaného
analytu na formu vhodnou pro vážení. Využívá se typicky srážecí reakce
(nebo reakce za vzniku komplexu), která se provádí ve vodném roztoku.
Vzniklou pevnou fázi pak oddělujeme filtrací. V řadě případů je však
nezbytné adjustovat odfiltrovanou sraženinu na stechiometricky přesně
definovanou formu; pokud nestačí vysušení (odpaření vody), nejčastěji se
využívá žíhání. Pak se teprve měří hmotnost vzniklé sloučeniny (váží se).
Po převedení analytu do roztoku a úpravě reakčních podmínek
(objem, teplota, pH..) je stanovovaná látka srážena pomocí nejrůznějších
činidel, přičemž je třeba dbát na vhodné podmínky (zředěné roztoky, pomalé
přidávání činidla), aby nedošlo ke ztrátám nebo znečištění sraženiny (srážení
musí být kvantitativní). Sraženinu je nutné promýt, vysušit, případně vyžíhat
- převést na definovaný produkt. Je nutné dbát na optimální vlastnosti
sraženiny, nesmí vznikat koloid. Vyloučenou sraženinu zbavíme nečistot a
matečného louhu sérií operací, z nichž nejběžnější je zrání, dekantace,
filtrace, promývání na filtru. K filtraci lze použít papírový filtr nebo filtrační
kelímek (porcelánový, skleněný).
Izolovanou sraženinu převedeme na sloučeninu přesně definovanou,
jednotného složení, odolnou proti vlhkosti, pokud možno s vysokou
molekulovou hmotností, a to sušením nebo žíháním.
Gravimetricky lze v podstatě stanovit každý prvek nebo část
sloučeniny (a to i sloučeniny organické), které lze převést na chemicky
definovatelnou sraženinu. Stanovení může být buď přímé, při němž se sráží a
váží stanovovaný analyt, nebo nepřímé, při němž se analyt z roztoku
nevylučuje, ale oddělí se od něj všechny nečistoty a zůstane pouze
stanovovaná látka – popel, který se váží.
Pokud má gravimetrie přinášet přesné a správné výsledky, je důležitá velká
pečlivost a správná technika provedení celého postupu stanovení.
5
Schematické znázornění důležitých kroků při srážecí gravimetrii
1/ Správný postup srážení
2/ Správná filtrace
3/ Skládání filtračního papíru pro filtraci
4/ Skládání filtračního papíru do kelímku
5/ Správná poloha kelímku při žíhání nad kahanem
2
3
54
6
STANOVENÍ ŽELEZITÉ SOLI JAKO Fe2O3
Roztok železité soli se za horka a za přítomnosti NH4Cl (zvýšení
iontové síly) sráží zředěným hydroxidem amonným (čpavkovou vodou).
Vyloučená rezavá sraženina se odfiltruje a žíháním převede na Fe2O3, který
se váží.
Fe3+
+ 3 NH4OH  Fe(OH)3 . x H2O + 3 NH4
+
2 Fe(OH)3  Fe2O3 + 3 H2O
Sraženina, která je v první rovnici zjednodušeně zapsána jako
hydroxid železitý, je ve skutečnosti ve vodném prostředí nestechiometrická
sloučenina hydratovaného hydroxidu železitého Fe(OH)3 . x H2O, jejíž složení
závisí na podmínkách srážení (zvláště pH, iontové síle roztoku, ale i na
počáteční koncentraci Fe3+
atd.). Proto nestačí pouhé vysušení sraženiny,
nýbrž abychom dostali stechiometrickou sloučeninu, je sraženinu nutné
žíháním převést na Fe2O3 (druhá rovnice). V průběhu spalování na filtru se
může Fe3+
částečně redukovat na Fe2+
, který je nutné převést zpátky na Fe3+
(jinak dochází k negativní chybě). Toho lze dosáhnout delším žíháním za
přístupu vzduchu (kyslíku).
Pomůcky: kleště, stojan, kruh, kelímek porcelánový, kahan, exsikátor,
400ml kádinka, skleněná tyčinka, filtrační papír,
gravimetrická filtrační nálevka
Chemikálie: 5% NH4OH, 1% NH4NO3, pevnýNH4Cl
Pracovní postup
Vzorek Fe3+
soli kvantitativně přeneste do kádinky přiměřeného
objemu (400 ml). Zřeďte čištěnou vodou na objem cca 150 ml. Pro zvýšení
iontové síly, které později vede k rychlejšímu srážení, přidejte 1 g pevného
NH4Cl a zahřejte k varu. Za stálého míchání přidávejte po kapkách 5% roztok
amoniaku ve vodě tak dlouho, až ucítíte zřetelný zápach unikajícího
amoniaku. Po vyloučení hydroxidu železitého roztok se sraženinou zahřívejte
(téměř k varu nebo na vodní lázni), až dojde ke „sbalení“ sraženiny. Poté
opakovaně dekantujte (asi 3x) 1% roztokem NH4NO3; (vyšší teplota a
přítomnost dusičnanu amonného zabraňují přechodu sraženiny na koloidní
formu).
7
Sraženinu začněte filtrovat přes filtrační papír. Sraženinu na filtru
promývejte roztokem 1% NH4NO3. Sraženina je promyta tehdy, jestliže
v kapce filtrátu slabě okyseleného kyselinou dusičnou po přídavku AgNO3
nevzniká bílá sraženina (tj. neobsahuje ionty Cl-
).
Filtrační papír se sraženinou vyjměte z nálevky, sbalte a vložte
do porcelánového kelímku, který byl předtím vyžíhán do konstantní
hmotnosti a zvážen. Konstantní hmotnosti se dosáhne, pokud tři poslední
změřené hmotnosti vykazují změnu v rámci přesnosti analytických vah
(na posledním zobrazovaném místě), tzn. desetiny mg. Kelímek vždy před
vážením nechte vychladnout v exsikátoru!
Stanovovaný analyt i s filtračním papírem v kelímku opatrně spalte a
vyžíhejte do konstantní hmotnosti. Po ukončení žíhání dejte vždy kelímek
vychladnout (asi půl hodiny) do exsikátoru (pozor - špičky kleští je třeba před
manipulací s kelímkem nahřát, aby kelímek nepraskl).
Po vychladnutí kelímek zvažte na stejných vahách, na kterých jste
vážili kelímek prázdný, a vypočtěte obsah Fe nebo železité soli v g.
____________________________________________________________
pozn.:
Gravimetrický faktor (GF)
• Udává poměrné zastoupení hledaného prvku (nebo sloučeniny)
ve vážené sloučenině
• Může být menší i větší než 1
• Používá se pro přímý výpočet obsahu stanovovaného prvku z hmotnosti
vážené sloučeniny: x = GF * m
příklad:
Gravimetrický faktor pro Fe stanovované jako Fe2O3
2 Fe  1 Fe2O3 (stechiometrie reakce)
M (Fe) = 55,85 g/mol M (Fe2O3) = 159,70 g/mol
výpočet:
𝐺𝐺𝐺𝐺 =
2 ∗ 55,85
1 ∗ 159,70
= 0,6994
8
LABORATORNÍ CVIČENÍ 2 – NEUTRALIZAČNÍ TITRACE.
STANOVENÍ NEROZPUSTNÉHO UHLIČITANU ZPĚTNOU TITRACÍ
ÚVOD
Zpětná titrace představuje titrační stanovení se dvěma odměrnými
roztoky: nejprve se přidá k roztoku stanovované látky přesný objem prvního
odměrného roztoku v nadbytku a analyt se nechá kvantitativní zreagovat.
Poté se nezreagovaný přebytek prvního odměrného činidla titruje druhým
odměrným činidlem. Vypočítá se nezreagované množství prvního
odměrného roztoku a pak jemu odpovídající zreagované množství, které je
ekvivalentní stanovovanému analytu (n označuje přebytek činidla):
( 1 MeCO3 + 2 HCl ) + n HCl  ( 1 Me2+
+ 2 Cl+
1 CO2  + 1 H2O ) + n HCl
n HCl + n NaOH  n Na+
+ n Cl+
n H2O
Smyslem takového postupu je odstranění problémů, které by vznikly
při jednoduché přímé titraci: v tomto případě fakt, že stanovované uhličitany
jsou nerozpustné ve vodě (nemůžeme tak připravit homogenní roztok) a
také fakt, že při přímé acidimetrii by vznikala další kyselina (H2CO3), která
snižováním pH zkresluje určení správného bodu ekvivalence acidobazickým
indikátorem.
Vysvětlení principu zpětné titrace při stanovení nerozpustných uhličitanů.
Červená svislá čára představuje bod ekvivalence, obdelníky množství analytu
resp. činidel.
9
STANOVENÍ NEROZPUSTNÉHO UHLIČITANU ZPĚTNOU TITRACÍ
Pomůcky: byreta 25/50 ml; pipeta 10/20 ml, 250ml titrační baňky;
250ml kádinka, nálevka, lžička
Chemikálie: odměrné roztoky HCl a NaOH, indikátor methyloranž
Pracovní postup
Na analytických vahách odvažte třikrát asi 0,4 g přesně (tzn.
na 4 desetinná místa) vzorku a kvantitativně spláchněte do tří titračních
baněk. Přidejte byretou 50 ml odměrného roztoku kyseliny chlorovodíkové o
přesně známé koncentraci (0,1M; standardizace – viz níže). Roztok povařte.
Po rozpuštění uhličitanu a vychladnutí přidejte 2 – 3 kapky methyloranže.
Titrujte odměrným roztokem hydroxidu sodného o přesně známé
koncentraci (0,1M; standardizace – viz níže) do oranžového zbarvení.
Provádí se 3x.
Výsledek
Z rozdílu spotřeb vypočítejte látkového množství resp. hmotnost
nerozpustného uhličitanu ve vzorku a stanovte jeho obsah %(m/m) vztažený
na navážku vzorku (čistotu). Výsledek uveďte v gramech na čtyři desetinná
místa resp. v procentech na dvě desetinná místa.
Standardizace odměrného roztoku 0,1M HCl na navážku základní látky
Na analytických vahách odvažte tolik hydrogenuhličitanu sodného,
aby po rozpuštění byla spotřeba kyseliny asi 20 ml. Tři takové navážky
spláchněte do tří titračních baněk. Do každé baňky po rozpuštění uhličitanu
přidejte 2 – 3 kapky methyloranže, dále 50 – 100 ml vody a titrujte
odměrným roztokem kyseliny chlorovodíkové ze žlutého do oranžového
zbarvení. Roztok v titrační baňce krátce povařte (unikne CO2) a dotitrujte
do oranžového zbarvení.
Standardizace odměrného roztoku 0,1M NaOH na roztok kyseliny
chlorovodíkové o známé koncentraci
Do tří titračních baněk napipetujte tolik odměrného roztoku kyseliny
o známé koncentraci, aby byla spotřeba standardizovaného roztoku asi 10
nebo 20 ml. Přidejte 2-3 kapky indikátoru, zřeďte na 50-100 ml a titrujte do
změny barvy z červené do oranžové.
10
Komplex Chelatonu III s kovovým
kationtem v alkalickém prostředí;
vždy vznikají komplexy 1:1
LABORATORNÍ CVIČENÍ 3 – CHELATOMETRIE. STANOVENÍ
DVOU KATIONTŮ VEDLE SEBE
ÚVOD
Tato volumetrická metoda je založena na rozdílné stabilitě chelátů
stanovovaných kationů s Chelatonem III, což je dihydrát disodné soli EDTA
zjednodušeně zapisovaný jako Na2H2Y (M=372,24 g/mol). Protože EDTA je
vícesytnou karboxylovou (tj. slabou) kyselinou H4Y, její stupeň disociace je
silně ovlivněn pH prostředí (pKa1 = 2,0; pKa2 = 2,7; pKa3 = 6,2; pKa4 = 10,3).
Z toho je zřejmé, že stabilita chelátů roste se stupněm disociace
kyseliny a tedy s rostoucím pH. Některé kovové ionty tvoří stabilní komplexy
již v kyselém prostředí (Bi3+
, Ti4+
), většina kationtů v prostředí neutrálním a
některé kationty k tomu potřebují pH až silně alkalické (Mg2+
, Ca2+
). Vždy se
ale tvoří komplexy 1:1 (faktor titrace je vždy Ft = 1).
Titrační stanovení více kovových iontů vedle sebe lze provést, pokud
se konstanty stability jejich chelátů výrazně liší. Principem tohoto
laboratorního cvičení je postupná titrace dvou iontů, z nichž první (Bi3+
) tvoří
stabilní komplexy s EDTA (a s indikátorem) již v kyselém prostředí (pH = 2),
zatímco druhý (Zn2+
) až v prostředí slabě kyselém (pH = 5). Pokud jsou
konstanty stabilit podobné (Ca2+
, Mg2+
), je nutno použít selektivní
indikátor(y) a titrovat nadvakrát.
pH = 2 : Bi3+
+ H4Y  Bi[H3Y]2+
+ H+
pH = 5 : Zn2+
+ H4Y  Zn[H2Y]+
2 H+
pH=10: Ca2+
+ H4Y  CaY + 4 H+
Chelatometrické stanovení dvou kationtů vedle sebe
Pomůcky: 250ml odměrná baňka; byreta; pipeta 10/20 ml, 250ml
titrační baňky; nálevka, lžička
Chemikálie: Chelaton III p.a. M(C10H14N2Na2O8 . 2 H2O) = 372,24 g/mol,
konc. HNO3, urotropin (pevný pufr); indikátory: xylenolová
oranž, Eriochromčerň T, Fluorexon (směsi s pevným KNO3
v poměru 1:100)
11
Pracovní postup
Příprava 0,02Modměrného roztoku Chelatonu III (M=372,24 g/mol)
Vypočítané množství Chelatonu III odvažte na analytických vahách,
spláchněte do 250ml odměrné baňky a dokonale rozpusťte. Podle skutečné
navážky vypočítáte přesnou koncentraci odměrného roztoku (na čtyři platné
číslice)! Koncentrace tohoto roztoku se již nesmí měnit např. ředěním
vodou.
Stanovení kationtů Bi3+
a Zn2+
vedle sebe
Roztok vzorku převeďte kvantitativně do 100 ml odměrné baňky –
pozor! Při ředění vodou se může objevit bílý hydrolyzát Bi(OH)3, v tom
případě zaplňte pouze širokou část baňky, přidejte několik kapek konc. HNO3
(pH asi 1–2), aby se hydrolyzát rozpustil, a pak teprve doplňte po značku a
důkladně promíchejte. K titraci odpipetujte 20,00 ml do titrační baňky,
přidejte MALÉ množství xylenolové oranže (prášek ve směsi s KNO3 1:100),
až se roztok zabarví slabě červenofialově. Červenofialový roztok titrujte
odměrným roztokem Chelatonu III do žluté barvy v bodě ekvivalence. Tato
spotřeba odpovídá množství Bi3+
.
Ke ztitrovanému roztoku přidejte tuhý urotropin, aby se roztok opět
zabarvil červenofialově (pH roztoku se upraví na 5). Znovu se titruje
Chelatonem III do žlutého zabarvení; tato spotřeba odpovídá množství Zn2+
.
Pozor! Velké množství volné XO může změnit barvu volné XO na jahodovou.
Stanovení celkové tvrdosti vody (Mg2+
a Ca2+
) v mmol/l
50,00 ml vzorku vody odpipetujte do titrační baňky. Přidejte špetku
indikátoru Eriochromčerň T a asi 5 ml amoniakálního pufru (pH=10). Vznikne
vínově červený roztok. Titrujte do jasně modrého zbarvení. Spotřeba
odpovídá součtu hořečnatých a vápenatých iontů. Sumu vyjádříme jako
mmol v 1 litru vody. Voda s tvrdostí do 0,70 mmol/l se považuje za velmi
měkkou, nad 3,75 mmol/l za velmi tvrdou.
Stanovení Ca2+
ve vodě na fluorescenční indikátor
50,00 ml vzorku vody odpipetujte do titrační baňky, přidejte špetku
indikátoru Fluorexon a asi 5 ml 2M KOH. Vznikne žlutý roztok se
žlutozelenou fluorescencí (komplex Ca2+
—Fluorexon). Titrujte do růžového
zbarvení, kdy se uvolní Fluorexon a zároveň vymizí fluorescence. Spotřeba
odpovídá pouze množství Ca2+
, z rozdílu od předchozího stanovení lze
vypočítat množství Mg2+
(v mg/l).
Titrace proveďte vždy nejméně 3x.
Výsledek uveďte v gramech Bi3+
a Zn2+
nebo jejich solí.
Celkovou tvrdost vody uvádějte v mmol/l, množství Ca a Mg v mg/l.
12
LABORATORNÍ CVIČENÍ 4 – FOTOMETRIE. METODA
KALIBRAČNÍ KŘIVKY
ÚVOD
FOTOMETRIE
Molekuly vzorku absorbují z dopadajícího záření fotony vhodné
vlnové délky λ (tj. ty, které odpovídají rozdílu jejich energetických hladin).
V UV-Vis oblasti (190 – 850 nm) mají
fotony energii dostatečnou k tomu, aby
jejich absorpce způsobila přechod vnějších
elektronů (200–600 kJ/mol). Skupiny,
v kterých se realizuje takový elektronový
přechod, se nazývají chromofory. U
koordinačně kovalentních sloučenin
(vazba donor-akceptor) se jedná o
energetické přechody v d a f orbitalech.
Některé běžné chromofory
Spektrofotometrie je metoda, která umožňuje stanovit velikost
absorpce záření v určitém prostředí – v našem případě kapalině. Výsledkem
spektrofotometrického měření může být např. závislost velikosti absorpce
záření na vlnové délce světla. Velikost absorpce se hodnotí pomocí veličiny
absorbance. Absorbance (A) je dekadický logaritmus poměru intenzity
záření, které na vzorek dopadá (I0) a intenzity záření, které vzorkem prochází
(I).
𝐴𝐴 = log
𝐼𝐼0
𝐼𝐼
Absorbance A se zjišťuje pomocí spektrofotometru. Protože před
měřením vždy k analytu přidáváme rozpouštědla a činidla, pozorovaná
absorbance je součtem absorbancí všech složek. Abychom získali absorbanci
pouze analytu, je nutno absorbanci tzv. blanku (slepý vzorek) odečítat. U
jednopaprskových přístrojů se to realizuje změřením spektra blanku coby
prvního roztoku.
Absorbance závisí přímo úměrně na obsahu (koncentraci)
absorbující látky ve vzorku (c) a na délce optické dráhy (d), ε je absorpční
koeficient.
𝐴𝐴 = 𝜀𝜀. 𝑑𝑑. 𝑐𝑐
13
Podle těchto rovnic se fotometrie užívá jako metoda kvantitativní
chemické analýzy, tzn. ke stanovení koncentrace c. Absorpční koeficient je
pro určité absorbující prostředí charakteristický a bývá tabelován. Častěji
však, stejně jako v našem případě, se určuje pro konkrétní experimentální
podmínky z kalibračních roztoků, tedy roztoků o známé c, připravených za
konkrétních experimentálních podmínek.
Specifická absorbance (ČL 2009)
Český lékopis používá namísto molárního absorpčního koeficientu
z praktických důvodů (u látek, jejichž molekulová hmotnost nelze určit) i
veličinu zvanou „specifická absorbance“, která udává absorbanci 1% roztoku
v 1cm kyvetě při dané vlnové délce. Přepočet mezi touto veličinou je možný
podle vzorce:
𝐴𝐴1cm
1%
=
10 ∗ 𝜀𝜀
𝑀𝑀𝑟𝑟
Spektrofotometr s diodovým polem (DAD)
U fotometru s diodovým polem, který se používá ve cvičení, je kyveta
ozařována polychromatickým zářením. Toto záření pak dopadá na mřížku,
které jej rozkládá, a v přesných pozicích dispergovaných vlnových délek jsou
umístěny fotodiody. V jednom okamžiku tedy prakticky získáváme informaci
o celém absorpčním spektru.
Schéma
fotometru
s diodovým
polem
14
Metoda kalibrační křivky
Tímto běžným způsobem se zjišťuje odezva detektoru (analytický
signál), kterou v systému vyvolá určitá koncentrace (množství) analytu.
V ideálním případě je tato závislost lineární a zjišťuje se měření tzv.
kalibračních standardů čili vzorků s přesně známým množstvím analytu.
Znalost této závislosti umožňuje nakonec zjistit (vypočítat) ze signálu
neznámého vzorku množství analytu.
Potřebné roztoky o různých koncentracích (minimálně 4 ─ 5) se
připravují z jednoho zásobního roztoku ředěním (přesnou pipetou)
do odměrných baněk. Koncentrace (množství) v kalibračních roztocích se volí
podle očekávané hodnoty
Nejlepším odhadem lineární kalibrační závislosti je přímka, kterou
lze nalézt graficky (milimetrový papír nebo matematicky lineární regresí
y = a*x nebo y = a*x + b v tabulkovém procesoru, např. Gnumeric, MS Excel).
4A. STANOVENÍ Cu2+
CHELATONEM III
OPTIMALIZACE PODMÍNEK STANOVENÍ
Komplexace kovových iontů je
pro kvantitativní analýzu významná především u
kyseliny ethylen-diamin-tetraoctové (EDTA). Protože
se jedná o čtyřsytnou karboxylovou (tj. slabou)
kyselinu H4Y, její stupeň disociace je silně ovlivněn
pH prostředí.
U chelátů [kationt kovu ─ EDTA] je typické
koordinační číslo 6 (viz obrázek), čili kationt kovu interaguje s
činidlem na šesti místech: se dvěma volnými elektronovými
páry na dusících a se čtyřmi kyslíky karboxylových skupin. Je
tedy zřejmé, že stabilita komplexu roste se stupněm disociace
15
kyseliny a tedy s rostoucím pH. Některé kovové ionty tvoří stabilní komplexy
již v kyselém prostředí (Bi3+
, Ti4+
), většina kationtů v prostředí neutrálním a
některé kationty k tomu potřebují pH až silně alkalické (Mg2+
, Ca2+
). Vždy se
ale tvoří komplexy 1:1, např.
Cu2+
+ [H2Y]2
[CuY]2+
2 H+
V našem případě komplex [CuY]2absorbuje
ve viditelné oblasti
spektra (je tmavě modrý), a proto lze s výhodou měřit jeho absorbanci
v oblasti kolem 710 nm, kde už prakticky neabsorbují ani ostatní složky
roztoku (především činidla), ani samotný Cu2+
, protože je kvantitativně
vázán. Absorpční maximum komplexu [CuY]2zjistíme
z naměřených spekter
(graficky).
Zjištění vhodného pH a koncentrace činidel (Chelaton III i pufr
v nadbytku) je nezbytné pro kvantitativní vytvoření komplexu – v opačném
případě bychom nemohli usuzovat z absorbance komplexu na koncentraci
analytu (Cu2+
).
FOTOMETRICKÉ STANOVENÍ Cu2+
CHELATONEM III POMOCÍ KALIBRAČNÍ
KŘIVKY
Chemikálie: 0,05M CuSO4, Chelaton III, pufry
Kroky pracovního postupu:
• změření absorpčního spektra komplexu ve viditelné oblasti
spektra – výběr λ(max)
• změření závislosti absorbance na pH – výběr pH (graficky)
• změření závislosti absorbance na koncentraci Chelatonu III –
výběr koncentrace Chelatonu III (graficky)
• změření kalibrační závislosti A vs. c(Cu) za optimálních podmínek
• stanovení Cu2+
v neznámém vzorku (lineární regresí)
Vyhodnocení:
koncentraci roztoku vzorku mědi stanovte odečtením z kalibrační závislosti
(pomocí rovnice lineární regrese)
pozn.:
měřte absorbanci vždy proti slepému vzorku!
grafy vynášejte PRŮBĚŽNĚ na milimetrový papír nebo zobrazujte v MS
Excelu
výsledek uveďte jako hmotnost (mg) Cu ve 100 ml vzorku
16
Pracovní postup
1. Závislost A = f(λ): do 50ml odměrné baňky odpipetujte 5,00 ml
základního roztoku CuSO4, 10,00 ml roztoku Chelatonu III, baňku
doplňte po rysku pufrem pH 6,0 a promíchejte. Porovnávací roztok
(blank) připravte stejným způsobem, pouze místo 5,0 ml základního
roztoku CuSO4 použijte 5,00 ml vody. Změřte absorbanci
připraveného roztoku v oblasti 400 ─ 900 nm (absorpční spektrum).
Vlnová délka λ(max), při které se nachází vrchol křivky (kolem
700 nm), udává absorpční maximum vytvořeného chelátu.
2. Závislost A = f(pH): do pěti 50ml odměrných baněk odpipetujte po
5,00 ml základního roztoku CuSO4 a 10,00 ml roztoku Chelatonu III.
Odměrné baňky doplňte po rysku jednotlivými připravenými pufry a
promíchejte. Ke každému vzorku připravte odpovídajícím způsobem
i porovnávací roztok (blank). Změřte absorbanci všech pěti roztoků
proti příslušným slepým vzorkům (blankům) při vlnové délce λmax.
Naměřené hodnoty vyhodnoťte graficky.
3. Závislost A = f(koncentrace Chelatonu III): do pěti 50ml odměrných
baněk napipetujte po 5,00 ml základního roztoku CuSO4. Do první
baňky přidejte pomocí byrety 2,00 ml roztoku Chelatonu III, do
druhé 2,50 ml, do třetí 5,00 ml, do čtvrté 8,00 ml a do páté 10,00 ml.
Odměrné baňky doplňte po rysku pufrem zvoleným podle výsledku
předcházejícího měření a promíchejte. Ke každému vzorku připravte
odpovídajícím způsobem porovnávací roztok (blank). Změřte
absorbanci všech pěti roztoků proti příslušným slepým vzorkům při
vlnové délce λmax. Naměřené hodnoty vyhodnoťte graficky.
4. Závislost A = f(koncentrace Cu) - kalibrační závislost: do pěti 50ml
odměrných baněk odměřte byretou 1,00; 2,00; 3,00; 4,00 a 5,00 ml
základního roztoku CuSO4 a přidejte dvojnásobek potřebného
množství Chelatonu III zjištěného v předchozím měření. Odměrné
baňky doplňte po rysku pufrem (z bodu 2) a promíchejte.
Porovnávací roztok připravte stejným způsobem, pouze místo 5,00
ml základního roztoku CuSO4 použijte 5,00 ml vody. Změřte
absorbanci všech pěti roztoků proti slepému roztoku při vlnové
délce λ(max). Naměřené hodnoty vyhodnoťte graficky.
5. Stanovení obsahu Cu2+
v neznámém vzorku: odpipetujte 5,00 ml z
roztoku vzorku do 50ml odměrné baňky, přidejte dvojnásobek
potřebného množství Chelatonu III, doplňte po rysku pufrem a
promíchejte. Změřte absorbanci připraveného roztoku proti
slepému roztoku při vlnové délce λ(max).
17
4B. STANOVENÍ FENAZONU V ANTIPYRINU ŽELEZITÝMI IONTY
FENAZON
Fenazon byl syntetizován L. Knorrem r. 1883
jako antipyretikum a prodáván pod názvem Antipyrin
(proto se často tyto názvy zaměňují). Tato syntéza byla
historicky velmi významná, protože potvrdila možnost
syntetické přípravy zjednodušeného analoga chininu s
antipyretickým účinkem.
Fenazon (1,5-dimethyl-2-fenyl-2,3-dihydro-pyrrazol-3-on, M=188,23
g/mol) tvoří se železitými ionty v kyselém prostředí oranžově červený
komplex, který poskytuje charakteristické absorpční spektrum s maximem
okolo 460 nm a který lze využít pro identifikaci i stanovení fenazonu.
Fotometrické stanovení analytů v barevném komplexu je typickou
aplikací fotometrie. Pro stanovení kovových kationtů je často barevná změna
způsobena vytvořením donor-akceptorové vazby. Ovšem běžná je situace,
kdy kationt kovu je analyt a vybíráme činidlo, které bude ligandem. V našem
případě je situace obrácená: stanovujeme ligand a kovový kationt je
činidlem.
FOTOMETRICKÉ STANOVENÍ FENAZONU V ANTIPYRINU ŽELEZITÝMI IONTY
POMOCÍ KALIBRAČNÍ KŘIVKY
Chemikálie: čištěná voda, okyselený základní roztok Fe(NO3)3 (c = 0,0125 M).
Kroky pracovního postupu:
• změření absorpčního spektra komplexu ve viditelné oblasti
spektra – výběr λmax
• optimalizace koncentrace činidla
• zjištění kalibrační závislosti A vs. c(fenazon) (lineární regrese)
• stanovení fenazonu v neznámém vzorku Antipyrinu z kalibrační
křivky.
Příprava vzorku:
roztok kvantitativně převedeme do 25ml odměrné baňky, přidáme
optimalizované množství činidla a doplníme po rysku.
18
OPTIMALIZACE PODMÍNEK STANOVENÍ
Protože ligand fenazon nevykazuje ve vodném prostředí významné
acidobazické vlastnosti, vznik komplexu není ovlivněn pH přímo. Pouze je
nutno vyhnout se alkalickému pH, aby Fe3+
nezhydrolyzoval, protože pak by
nebyl zajištěn přebytek činidla pro komplexaci. Je pouze nutné nalézt
takovou koncentraci (množství) činidla, aby byl zajištěn jeho přebytek.
Roztok činidla: 0.05 M Fe(NO3)3 . 9 H2O odbarvený HNO3
Vyhodnocení: Koncentraci neznámého roztoku vzorku fenazonu stanovte
odečtením z lineární kalibrační závislosti.
Výsledek uveďte jako hmotnost (mg) fenazonu ve vzorku
Pracovní postup
Příprava zásobního roztoku: do 50ml odměrné baňky navažte na
analytických vahách přibližně 0,1 g fenazonu a rozpusťte asi ve 30 ml
destilované vody. Po úplném rozpuštění doplňte vodou po rysku a
promíchejte.
• Výběr vlnové délky
do 25ml odměrné baňky odpipetujte 1,00 ml zásobního roztoku
fenazonu a 5,00 ml roztoku Fe(NO3)3 a doplňte po rysku. Změřte
absorpční spektrum vytvořeného komplexu a vyberte vhodnou
vlnovou délku.
• Optimalizace koncentrace činidla
přesně odpipetujte do pěti 25ml odměrných baněk 1,00 ml
zásobního roztoku fenazonu a pak postupně 5,00; 7,00; 10,00;
12,00 a 15,00 ml roztoku Fe(NO3)3. Doplňte po rysku vodou. Ze
získané grafické závislosti odečtěte optimální objem činidla pro
následnou konstrukci kalibrační křivky.
• Kalibrační závislost
Z připraveného základního roztoku fenazonu přesně odpipetujte
postupně do pěti 25ml odměrných baněk 0,20; 0,30; 0,50; 0,70 a
1,00 ml. Přidejte nalezený optimální objem roztoku Fe(NO3)3,
doplňte vodou po rysku a promíchejte. Porovnávací roztok
připravte doplněním roztoku Fe(NO3)3 ve 25ml odměrné baňce
vodou. Změřte absorbanci všech pěti roztoků proti slepému
roztoku při vybrané vlnové délce. Naměřené hodnoty
vyhodnoťte graficky.
19
LABORATORNÍ CVIČENÍ 5 – POTENCIOMETRICKÁ TITRACE
ÚVOD
Potenciometrická titrace (někdy označovaná jako potenciometrie)
není zvláštní analytickou metodou – pouze modifikuje klasické volumetrické
metody, kdy měření elektrochemického potenciálu v průběhu titrace slouží
k objektivnímu stanovení bodu ekvivalence. Při titraci se sleduje závislost
elektrochemického potenciálu v závislosti na přidaném množství titračního
činidla, konstruujeme titrační křivku a bod ekvivalence pak nacházíme
v inflexním bodu křivky. Typicky potenciometrii používáme k určení bodu
ekvivalence u acidobazických, srážecích nebo oxidačně redukčních reakcí.
K měření elektrochemického potenciálu je zapotřebí dvou elektrod,
elektrody měrné (např. stříbrné, skleněné) a srovnávací (referentní, např.
argentchloridové, kalomelové). Potenciál měrné elektrody musí záviset
na koncentraci sledovaného iontu při titraci a naopak potenciál referentní
elektrody se během titrace nesmí měnit; jako referentní elektrody se
nejčastěji využívají nasycená kalomelová elektroda nebo argentchloridová
elektroda. K měření potenciálu mezi těmito elektrodami se používá
potenciometr, což je v podstatě voltmetr s vysokou hodnotou vnitřního
odporu. Typické uspořádání při acidobazických titracích obsahuje skleněnou
elektrodu (citlivou na pH) a nasycenou kalomelovou elektrodu. Tento systém
dvou elektrod bývá spojen do tzv. kombinované pH elektrody.
Typická sestava pro potenciometrickou titraci a titrační křivka
s potenciálovým skokem
20
Obecný postup při potenciometrické titraci:
• Do kádinky odměřte část roztoku vzorku (alikvot).
• Do kádinky vložte čisté (omyté a osušené) míchadlo, kádinku
umístěte na elektromagnetickou míchačku.
• Elektrody připojené k přístroji, opláchnuté čištěnou vodou a osušené
ponořte do roztoku a zapněte/nastavte míchání. Pozor, u
kombinované elektrody musí být ponořena i diafragma!
• Odměrný roztok z byrety přidávejte po určitých stejných objemech
(při první orientační titraci po 0,5 ml; při vlastní titraci (2 ─ 3 x) v
okolí ekvivalenčního bodu po 0,2 ml). Po každém přídavku
odměrného roztoku vyčkejte do ustálení měřených hodnot a
výslednou hodnotu (mV) s příslušným objemem zapisujte do
tabulky.
Po skončení titrace vypněte míchání, vyjměte elektrody a opláchněte. Ze
získaných hodnot sestrojte titrační křivku a určete bod(y) ekvivalence.
spotřeba (ml) potenciál (mV)
0,00
0,50
2,00
2,50
…
10,50
10,70 Oblast bodu
ekvivalence10,90
11,10
…
21
VYHODNOCENÍ BODU EKVIVALENCE (BE)
Graficky
Numericky podle Hahna
(diferenční metoda, konstantní přídavek titračního činidla ∆V)
označíme ∆Emax, aby platilo:
V = spotřeba mezi ∆E1 a ∆Emax
BE = V + a ; když ∆E1 předchází ∆Emax
BE = V – a ; když ∆E1 následuje po ∆Emax
Příklad z tabulky 2: ∆E1 je na titr. křivce před ∆Emax
BE=0,9 + 0,0175 = 0,9175 ml
22
5A. ARGENTOMETRICKÉ STANOVENÍ HALOGENIDŮ VE SMĚSI
S POTENCIOMETRICKOU INDIKACÍ BODU EKVIVALENCE
ÚVOD
Halogenidy (Cl,
Br,
I)
se stanovují argentometrickou srážecí titrací,
body ekvivalence se indikují potenciometricky stříbrnou elektrodou.
X−
(aq) + Ag+
(aq) → AgX (s)
Titrace je založena na postupném sražení halogenidů stříbrných v
důsledku jejich rozdílné rozpustnosti (pKs(AgCl) = 9,75; pKs(AgBr) = 12,31;
pKs(AgI) = 16,08). Registrujeme titrační křivku, na které budou tři
potenciálové skoky. Nejdříve se kvantitativně sráží nejméně rozpustný AgI,
potom AgBr, nakonec AgCl. Objem spotřebovaného odměrného roztoku
v inflexním bodě prvního skoku odpovídá množství I,
rozdíl mezi prvním a
druhým skokem odpovídá množství Bra
rozdíl mezi druhým a třetím
skokem odpovídá množství Cl.
V roztoku měříme potenciál iontově
selektivní elektrody stříbrné, neboť koncentrace iontů Ag+
je díky součinům
rozpustnosti závislá na koncentraci halogenidů: Ks = [Ag+
]*[X-
].
Kombinovaná Ag-elektroda
23
POTENCIOMETRICKÁ TITRACE
PŘÍSTROJE A POMŮCKY
Potenciometrická titrace je prováděna pomocí přístroje pH metr MS22
(Laboratorní přístroje Praha)
Pomůcky: kádinky, 100ml odměrná baňka, pipety, byreta, titrační baňky
Chemikálie: 5% dusičnan barnatý, 0,05M odměrný roztok dusičnanu
stříbrného, pevný NaCl, roztok chromanu draselného
Potenciometr, titrační nádobka a titrační křivka. Šipky ukazují 3 body
ekvivalence odpovídající obsahu 3 halogenidů.
24
Obsluha přístroje:
Zkontrolujte, zda jsou elektrody zapojeny do přístroje, přístroj je
zapojen do elektrické sítě a jistič na zásuvce v poloze zapnuto. Stlačením
tlačítka „ON" zapněte přístroj. Zkontrolujte, zda červená kontrolka svítí u
měření mV, příp. stlačte příslušné tlačítko. Proveďte vlastní titraci (na displeji
odečítejte hodnotu napětí). Po skončení měření elektrody omyjte.
Pracovní postup
• Vzorek kvantitativně převeďte do 100ml odměrné baňky a
doplňte po značku vodou
• Odpipetujte 20,00 ml do 250ml kádinky a přidejte 80 ml vody
• Odměrným válcem přidejte 5 ml 5% roztoku Ba(NO3)2. Dusičnan
barnatý se přidává kvůli zvýšení iontové síly roztoku, aby
sraženina vznikala rychleji
• Do roztoku vložte elektromagnetické míchadlo a zapněte
míchačku
• Ponořte do roztoku kombinovanou elektrodu
• Zapněte míchání a přístroj na měření
• Do tabulky si zapište počáteční hodnotu napětí (mV)
• Titrujte odměrným roztokem dusičnanu stříbrného o přesně
známé koncentraci c(AgNO3)
• Po každém přídavku zaznamenejte do tabulky příslušnou
spotřebu odměrného roztoku (na 2 desetinná místa) a napětí
(mV) roztoku
• Titraci zopakujte 3 x
• Vyhodnocení: ze získaných hodnot sestrojte titrační křivku a
určete body ekvivalence graficky nebo numericky
(matematickým způsobem dle Hahna) – viz str. 21
• Přesnou koncentraci odměrného roztoku určete titrací podle
Mohra
• Pomocí přesné koncentrace titračního činidla vyjádřete výsledek
jako hmotnost (g) Cl,
Bra
Ive
vzorku
Standardizace 0,05M odměrného roztoku AgNO3 na chlorid sodný podle
Mohra
Na analytických vahách odvažte tolik pevného NaCl, aby
po rozpuštění a doplnění na 100,0 ml byla látková koncentrace NaCl
obdobná jako koncentrace odměrného roztoku AgNO3. Odvážené množství
rozpusťte v kádince. Kvantitativně spláchněte do 100ml odměrné baňky,
doplňte po rysku. Po promíchání odpipetujte 10,00 / 20,00 ml do titrační
baňky, přidejte 1 ml 5% roztoku chromanu draselného. Titrujte odměrným
roztokem dusičnanu stříbrného do trvalého, ale slabého červenohnědého
zbarvení chromanu stříbrného. Standardizaci opakujte nejméně 3 x.
25
5B. ALKALIMETRICKÉ STANOVENÍ KYSELINY FOSFOREČNÉ
S POTENCIOMETRICKOU INDIKACÍ BODU EKVIVALENCE
ÚVOD
Kyselina fosforečná je silná trojsytná kyselina, proto ji lze stanovit
alkalimetricky. K indikaci bodu ekvivalence by se dala použít vizuální indikace
(acidobazický indikátor, např. methyloranž, fenolftalein atd.). V tomto
cvičení však využijeme přesnější způsob odečtení spotřeby v ekvivalenčním
bodě z titrační křivky získané zaznamenáváním potenciálu skleněné
elektrody, která je citlivá na pH roztoku.
Hodnoty pKa jednotlivých stupňů jsou dostatečně rozdílné (pKa1 =
2,0; pKa2 = 6,7; pKa3 = 12,7); proto bychom čekali na titrační křivce tři
oddělené skoky (tři disociační stupně kyseliny). Protože však jako odměrný
roztok bude sloužit vodný roztok hydroxidu sodného o přibližné koncentraci
0,1M, titrace do třetího stupně nebude proveditelná (nelze dosáhnout
dostatečně vysoké pH, abychom kvantitativně vytvořili PO4
3).
Na titrační
křivce tedy budou pouze dva potenciálové skoky, které odpovídají
neutralizaci do prvního a druhého stupně. Z obou bodů ekvivalence lze
vypočítat analytickou koncentraci kyseliny:
𝐻𝐻3 𝑃𝑃𝑂𝑂4 + 𝑂𝑂𝐻𝐻−
→ 𝐻𝐻2 𝑃𝑃𝑂𝑂4
−
+ 𝐻𝐻2 𝑂𝑂
𝐻𝐻3 𝑃𝑃𝑂𝑂4 + 2 𝑂𝑂𝐻𝐻−
→ 𝐻𝐻𝐻𝐻𝑂𝑂4
2−
+ 2 𝐻𝐻2 𝑂𝑂
Potenciometrická titrační křivka stanovení kyseliny fosforečné. Skoky
označují body ekvivalence pro první resp. druhý disociační stupeň.
26
POTENCIOMETRICKÁ TITRACE
PŘÍSTROJE A POMŮCKY
Potenciometrická titrace je prováděna pomocí přístroje pH-metr MS22
(Laboratorní přístroje Praha)
Chemikálie: 0,1M odměrný roztok hydroxidu sodného, kyselina šťavelová,
methyloranž, roztok CaCl2
Pomůcky: Kádinky, 100ml odměrná baňka, pipety, byreta, titrační baňky
Potenciometr MS22 a pH titrační křivka kyseliny fosforečné
Obsluha přístroje:
Zkontrolujte, zda jsou elektrody zapojeny do přístroje a přístroj je zapojen
do elektrické sítě (jistič na zásuvce v poloze zapnuto).
Pracovní postup
• Vzorek kvantitativně převeďte do 100ml odměrné baňky a dolijte po
rysku vodou.
• Odpipetujte 20,00 ml naředěného vzorku do 150ml kádinky a
přidejte asi 80 ml destilované vody.
• Zapněte přístroj, zkontrolujte, zda červená kontrolka svítí u měření
mV, příp. stlačte příslušné tlačítko.
27
• Do roztoku vložte elektromagnetické míchadlo, kádinku postavte
na elektromagnetickou míchačku.
• Ponořte do roztoku kombinovanou skleněnou elektrodu a zapněte
míchání.
• Do tabulky si zapište počáteční hodnotu napětí (mV). Titrujte 0,1M
odměrným roztokem hydroxidu sodného o přesně známé
koncentraci.
• Proveďte vlastní titraci – byretou přidávejte odměrný roztok a
po každém přídavku zaznamenejte do tabulky příslušnou spotřebu
(2 desetinná místa) a hodnotu napětí (mV) roztoku.
• Po skončení měření vypněte přístroj stlačením tlačítka „OFF".
Elektrody omyjte.
• Postup opakujte 3 x.
• Vyhodnocení: ze získaných hodnot sestrojte titrační křivku a určete
body ekvivalence graficky nebo numericky (matematickým
způsobem dle Hahna) – viz str. 21.
• Přesnou koncentraci odměrného roztoku určete standardizací
na kyselinu šťavelovou
• Pomocí přesné koncentrace odměrného roztoku výsledek vyjádřete
jako hmotnost (g) kyseliny fosforečné ve vzorku.
Standardizace 0,1M odměrného roztoku hydroxidu sodného na kyselinu
šťavelovou
Na analytických vahách odvažte tolik kyseliny šťavelové, aby
po rozpuštění a doplnění na 100,0 ml byla látková koncentrace H2C2O4
poloviční než koncentrace odměrného roztoku NaOH. Odvážené množství
rozpusťte v kádince ve vodě (za zvýšené teploty). Kvantitativně přelijte
do odměrné baňky na 100,0 ml a doplňte po rysku; po promíchání
odpipetujte 3 x 20,0 ml do tří titračních baněk a přidejte 2 kapky
methyloranže. Titrujte odměrným roztokem hydroxidu sodného z červeného
do oranžového (cibulového) zbarvení. Potom přidejte asi 10 ml 20% roztoku
chloridu vápenatého (vysráží se bílá sraženina). Roztok se opět zbarví
červeně. Ten pak dotitrujte hydroxidem do oranžového zbarvení a odečtěte
spotřebu. Standardizaci opakujte nejméně 3 x.
28
LABORATORNÍ CVIČENÍ 6 – VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ
CHROMATOGRAFIE
ÚVOD - VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC)
HPLC je separační metoda založená na dynamickém (= v toku)
rozdělování analytu mezi dvě (nesmísitelné) fáze – fázi mobilní (obvykle
směs rozpouštědel) a fázi stacionární (zakotvená kapalina na nosiči nebo
tuhá fáze, sorbent).
Analyt, který v tomto systému vykazuje větší afinitu ke stacionární
fázi, je v koloně více zadržován, a proto přichází na detektor později než
analyt jiný, který má ke stacionární fázi afinitu menší a je z kolony rychleji
unášen mobilní fází – takto dochází k jejich oddělení, separaci. Příčinou
chemické afinity jsou 4 typy interakcí: elektrostatické, dipólové, van der
Waalsovy a vodíkových vazeb.
Přístroj, na kterém se provádí HPLC analýzy se nazývá kapalinový
chromatograf. Kapalinový chromatograf tvoří tyto hlavní části: zásobníky
s mobilní fází, vysokotlaká pumpa, dávkovač, kolona a detektor.
Schématický nákres kapalinového chromatografu
(web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html)
Reverzní stacionární fáze
Stacionární fáze je obvykle tvořena nosičem (částicemi silikagelu 3 ─
10 µm), na který je chemicky navázána vlastní stacionární fáze. Reverzní
stacionární fáze může být tvořena například vrstvou nepolárních uhlovodíků
(C8 = silyl+oktyl, C18 = silyl+oktadecyl), nebo polárnějších uhlovodíků
s vhodnou funkční skupinou (např. -CN).
29
Mobilní fáze
Mobilní fází v RP HPLC může být např. voda, methanol, acetonitril a
jejich směsi v různých vzájemných poměrech, pufry a další. Mobilní fáze
vstupuje do interakce se složkami analyzované směsi a konkrétní složení
mobilní fáze může významným způsobem ovlivňovat celou analýzu
(separaci).
Klíčovým pojmem pro výběr vhodných podmínek separace (tzn.
směsi analytů) je proto eluční síla mobilní fáze. Tato síla je vždy vztažena
na konkrétní systém (konkrétní stacionární fázi) a ukazuje schopnost eluovat
analyt ze stacionární fáze („soupeřit“ se stacionární fází o analyt) v procesu
kontinuálního transportu mobilní fáze kolonou. Dobrým odhadem eluční síly
je (v našem případě neionizovaných analytů tzn., když můžeme zanedbat
iontové interakce) polárnost - jak analytu, tak obou fází. Podle distribuce
parciálních nábojů (z posouzení elektronegativity a polohy přítomných
atomů) dané molekuly můžeme pak usuzovat na jejich vzájemnou afinitu:
polární analyt bude mít vysokou afinitu k polární fázi a nepolární analyt
k fázi nepolární.
CHROMATOGRAM
Chromatogram je časový záznam odezvy detektoru chromatografu;
typicky je tvořen píky, které mají různou plochu a výšku. V ideálním případě
jsou symetrické a mají tvar Gaussovy křivky.
Ukázka chromatogramu. Každý pík (č. 1 ─ 6) odpovídá jedné složce
analyzované směsi. Vodorovná osa znázorňuje čas. Čas, který odpovídá
vrcholu píku, je tzv. retenční čas, který je na dané koloně a za daných
experimentálních podmínek pro každou látku charakteristický.
Pokud je zkoumaná směs ideálně rozdělena, pak každý pík na
chromatogramu odpovídá jedné ze složek směsi. Poloha píku na ose x
uváděná pomocí retenčního času (určeno podle polohy vrcholu=maxima)
30
kalibrační křivka kofeinu
247 nm
y = 13.807x
R2
= 0.9999
0
500
1000
1500
2000
2500
0 50 100 150 200
koncentrace [µg/ml]
plochapíku(247nm)
určuje, o jakou látku se jedná (kvalitativní analýza), plocha píku (nebo jeho
výška) určuje množství látky ve směsi (kvantitativní analýza).
Identifikace píků (látek) se nejčastěji provede tak, že se na stejné
separační koloně za stejných experimentálních podmínek provede nástřik
ověřovaného standardu. Pokud se retenční čas píku na chromatogramu
neznámé směsi shoduje s retenčním časem píku známého standardu, pak se
jedná velmi pravděpodobně o stejnou látku. Pokud náš detektor je schopen
spektra snímat (diode-array detector, DAD), další identifikační možností je
srovnání spektra píku, který prochází detektorem, se spektrem standardu.
Používáme-li MS detektor, lze identifikovat látku podle MS spektra, aniž
bychom disponovali čistým standardem analytu.
Koncentrace látek ve směsi se určuje z ploch píků metodou
kalibrační křivky (viz str. 14).
Vyhodnocení chromatogramu
Jak bylo řečeno, kvalitativní charakteristikou látky je retenční čas
píku tr. Pokud jsou navíc píky symetrické, jako kvantitativní ukazatel obvykle
používáme plochu píku. Pro zjištění plochy nejjednodušeji postupujeme tak,
že pík aproximujeme
trojúhelníkem (viz
obrázek), protože pak
pro odhad plochy lze
použít vztah plocha =
0,5*h*w, kde w je
příslušná délka
základny trojúhelníka.
t1
t2
w2
t0
w1
h
0
w0.5
31
Moderní software (Chemstation, Clarity, Chromeleon…) dokáží provést
numerickou integraci v graficky přívětivém prostředí; v zásadě však vždy
musíme definovat začátek a konec píku.
Namísto w je ale většinou jednodušší z chromatogramu odečítat
šířku píku v polovině výšky w0.5 (pozor! tr a w musí být vyjadřovány ve
stejných jednotkách např. minutách, příp. v milimetrech!!!).
Retenční chování (=míra afinity ke stacionární fázi) daného analytu
se v chromatografii charakterizuje kapacitním poměrem (faktorem)
0
0
´
t
tt
k
−
=
kde t0 je čas analytu nezadržovaného kolonou (mrtvý čas), t je retenční čas
analytu. Při vyhodnocování chromatogramu dále obvykle počítáme počet
teoretických pater N a rozlišení Rs.
Počet teoretických pater N neboli účinnost kolony ukazuje
kinetickou kvalitu separačního systému:
Pro srovnání účinnosti různě dlouhých kolon (běžné délky L jsou 5 ─ 25 cm)
se zavádí výškový ekvivalent teoretického patra H. Je to délka kolony,
na které dojde k jednomu rozdělení analytu mezi stacionární a mobilní fázi:
Rozlišení RS je mírou separace dvou píků:
Např. hodnota RS = 1,00 udává, že dva sousední píky vykazují jen 2%-ní
překryv, při RS = 1,50 považujeme píky za kvantitativně oddělené
(odseparované), hodnoty >2,0 se již nesnažíme úpravou podmínek zvyšovat.
( ) 2/12
12
ww
tt
RS
+
−
=
( )1,5.02,5.0
12
*17,1
ww
tt
RS
+
−
=
2
5.0
2
545,5
w
t
N =2
2
16
w
t
N =
N
L
H =
32
STANOVENÍ KOFEINU V ACIFEINU
Kyselina acetylsalicylová (acetylsalicylic acid, Aspirin™,
Acylpyrin™) je široce používané léčivo s např.
antipyretickými účinky.
Kofein (caffeine) (podle rostliny Coffea arabica, česky
kávovník) je alkaloid, který příznivě stimuluje centrální
nervovou soustavu a srdeční činnost. Kofein patří do
skupiny purinových bazí, methylových derivátů
xanthinu, která zahrnuje theobromin (kakao) a theofylin
(bronchodilatans). V této práci bude stanovován obsahu kofeinu v komerčně
vyráběném léčivu ACIFEIN (HERBACOS-BOFARMA, s.r.o).
Paracetamol je léčivo, jež působí proti bolestem
a zvýšené tělesné teplotě, není však
protizánětlivé. Patří do indikačních skupin
analgetikum a antipyretikum.
http://www.farmaceutika.info/acifein#spc
33
Pracovní postup
Chemikálie: voda pro HPLC, octan amonný,
kyselina octová, standard kofeinu
Stacionární fáze (SF): reverzní, amid-C18
(Supelcosil ABZ+plus, 150 x 4,6 mm), částice
3 µm
Mobilní fáze (MF): 70% octan amonný 50mM (pH=4), 30% methanol;
izokratická eluce; průtok 1 ml/min, t = 40 °C
Příprava vzorku
Zvažte 10 tablet a spočítejte průměrnou hmotnost jedné tablety. Vyberte
jednu tabletu, zvažte ji, dokonale rozetřete na prášek a 300 mg spláchněte
vodou do 250ml odměrné baňky a doplňte po rysku. Asi na 1 minutu dejte
odměrnou baňku do ultrazvukové lázně. Přítomnost aditiv znemožňuje
dokonalé rozpuštění tablety. Avšak kofein je dobře rozpustný a kvantitativně
se rozpustí. Do vialky přefiltrujte přes násadkový filtr.
Kalibrační roztoky
Kalibrační roztoky je nutno připravit pečlivě! Pipetovat by měla jediná osoba
a používat při tom stejnou (skleněnou) pipetu! Zásobní roztok standardu
(kofein) připravte do 100ml odměrné baňky, přibližná koncentrace c ≈
1,6 mg/ml, ve vodě. Z tohoto roztoku nařeďte kalibrační roztoky (do 10ml
odměrné baňky) o následujících koncentracích:
40, 80, 120, 160 µg/ml
Proveďte opakovaný nástřik každého standardu i vzorku (3 x)
Vyhodnocení
• Identifikujte podle spekter jednotlivé píky v chromatogramu vzorku
(knihovna spekter nebo obrázek spekter standardů na str. 34)!
• Ze získaných dat zkonstruujte lineární kalibrační křivku (lineární
regresí) a vypočtěte hmotnost kofeinu v průměrné tabletě (mg).
Srovnejte tuto hodnotu s deklarovaným obsahem 50 mg/tabletu.
• Spočítejte kapacitní faktor kofeinu k´, počet teoretických pater N
pro pík kofeinu a rozlišení Rs paracetamol - kofein.
Pozn.: lze použít i ELS detektor, v tom případě se musí změnit hodnoty
v rámečcích - Příprava vzorku: celou tabletu do 100mL baňky; Kalibrační
roztoky: zásobní roztok c ≈ 8,0 mg/ml, ředění na 200, 400, 600, 800 µg/ml.
V tomto případě nelze identifikovat píky podle spekter, jedině podle
retenčních časů standardů.
34
Spektra standardů, c = 200 mg/L
kys.acetylsalicylová 231/296 nm
kofein (206) 274 nm
paracetamol 246 nm
35
A. PŘÍSTROJ HPLC YL9100
YL9100 Young Lin
Instrument Co., Ltd.,
Soul, Jižní Korea je
plně ovládán
softwarem Clarity
(DataApex, CZ).
SOFTWARE CLARITY
Pořadí zapínání: autosampler, degaser, pumpa, termostat, poslední detektor
(PDA), pak software Clarity:
ikonka je na Ploše
vybíráme „Project Acifein“
Přímé ovládání systému vyvolá ovládací panely systému:
36
PROVEDENÍ EXPERIMENTU
I v případě spuštění jediného experimentu se používá tzv. mód sekvenční –
např. s jediným aktivním řádkem. Označení v kolonce Run tento řádek
aktivuje:
Nejdůležitější při zadání experimentu je definice „metody“, tj. souboru
parametrů, podle kterých pracuje celý systém při realizaci experimentu.
Příprava metody:
V jednotlivých kartách je nutno definovat parametry alespoň pro pumpu (LC
Gradient), kolonu (LC, Measurement) a detektor (Acquisition).
37
Panel vysokotlaké pumpy
Okno detektoru. Detektor sbírá informace o signálu i vlnových délkách
v reálném čase, takže lze zobrazit izoplot (vlnová délka vs. čas), spektrum
(signál vs. vlnová délka), chromatogram (signál vs. čas) i 3D chromatogram
(signál vs. čas a vlnová délka)
38
B. PŘÍSTROJ HPLC AGILENT, SYSTEM 1200
HPLC Agilent, System 1200 (Waldbron, Německo) je plně
ovládán softwarem CHEMSTATION for LC, rev. B.03.02.
SOFTWARE CHEMSTATION
Pořadí zapínání systému HPLC (shora dolů): degaser, pumpa,
autosampler, termostat, jako poslední detektor, pak spouštíme
software CHEMSTATION:
ikonka je na Ploše
Po inicializaci se otevře grafické rozhraní,
kde lze ovládat znázorněné prvky, včetně
blokového diagramu: autosampler,
pumpu (bílá šipka), termostat kolony,
detektor (DAD ─ červená šipka).
Kondicionace kolony - zapnutí
gradientové pumpy
39
PROVEDENÍ EXPERIMENTU
zvolíme mód Single run. Číslo jednotlivé vialky, ze které
bude prováděno dávkování, bude zobrazeno pod tlačítkem
START. Jméno souboru, který bude vytvořen, spolu s
příslušnou cestou na pevném disku, je zobrazeno pod ní
(koncovka .D)
Nejdůležitějším pro zadání experimentu je definice metody,
tj. souboru parametrů, podle kterých pracuje celý systém
při realizaci experimentu (koncovka .M):
Metoda KOFEIN.M:
u metody nastavujeme pumpu:
objem, který se bude dávkovat autosamplerem:
teplotu termostatu kolony:
40
U detektoru vybereme vlnové délky, které se budou ukládat:
Absorbance v měřící cele je nepřetržitě monitorována. Protože je používán
diode-array detektor, lze v reálném čase snímat i spektra a ty použít k
identifikaci:
Identifikace kofeinu podle spektra
41
Vysvětlení elektroosmotického
toku v
nemodifikované křemenné
kapiláře: povrch kapiláry
nese nepohyblivý negativní
náboj (silanolové skupiny).
V důsledku zachování
elektroneutrality se proto u
stěn nachází přebytek
(pohyblivých) pozitivních
iontů z roztoku, které po
aplikaci napětí unáší celou
kapalinu ke katodě.
LABORATORNÍ CVIČENÍ 7 – KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA
ÚVOD - KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZA (CE)
Kapilární elektroforéza je moderní vysoce účinná analytická separační
metoda. Principem je pohyb analytů v elektrolytu mezi dvěmi elektrodami
vysokého napětí, obvykle realizovaný v kapiláře průměru 25 ─ 75 µm s oncolumn
detekcí.
Teorie
Elektricky nabitá částice se v elektrickém
poli pohybuje ve směru daném
znaménkem náboje částice a orientací
pole (kladně nabitá částice k zápornému
pólu a naopak). V kapalině je rychlost tohoto pohybu přímo úměrná náboji
částice q (F = q * E) a nepřímo úměrná hydrodynamické (Stokesově)
velikosti částice d (síla odporu prostředí F = - 3πηdv, kde η je viskozita
kapaliny). Tyto dvě síly se rychle po aplikaci elektrického pole vyrovnají a
částice se dále pohybuje konstantní rychlostí
v = q * E / 3 π η d µ = q / 3 π η d
kde µ=v/E elektroforetická mobilita. Pokud se tedy částice vzorku liší alespoň
v efektivním náboji q či hydrodynamické velikosti d, mohou se pohybovat
rozdílnými rychlostmi, což je nutnou podmínkou separace. Při použití
kapiláry (typicky křemenné, fused silica) jako separačního prostoru je prostá
elektromigrace nezanedbatelně snižována/zvyšována tokem nezávislým na
náboji analytu (elektroosmotický tok, electroosmotic flow = EOF), který
může zcela obrátit směr pohybu očekávaný podle nábojů analytů.
42
KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA (CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS,
CZE)
Vyhodnocení elektroforeogramu
Jedním z módů CE je kapilární zónová elektroforéza, pro kterou je
charakteristické použití jednoho pracovního elektrolytu (background
electrolyte, BGE). V důsledku toho je v celé separační kapiláře konstantní
elektrické pole. Jednotlivé zóny putují různými konstantními rychlostmi, jsou
oddělené BGE a odezva detektoru na konci kapiláry (typicky UV-Vis
detektor) má Gaussovský profil (tj. pík). Obdobně jako u chromatografie,
migrační čas píku tm charakterizuje analyt kvalitativně, kvantitativní
charakteristikou elektroforeogramu je plocha píku.
Počet teoretických pater N je mírou účinnosti podobně jako u HPLC








==
D
U
elektroforpro
w
t
N m
2
16 2
2
µ
takéézu
µ je mobilita, U napětí, D difúzní koeficient. (pozn. tm a w nebo w0.5 musí být
vyjadřovány ve stejných jednotkách např. sekundách nebo milimetrech !!!).
N je vysoké pro „úzké“ (základna píku w  0) a zadržované (tm  ∞) píky.
Nejjednodušší odečtení w je nahrazení píku trojúhelníkem (viz obrázek ↓)
Rozlišení Rs je mírou separace dvou píků. Např. hodnota Rs = 1,0 udává, že
dva píky vykazují jen 2 %-ní překryv, při Rs = 1,5 považujeme píky
za kvantitativně oddělené, hodnoty >2,0 se již nesnažíme úpravou podmínek
zvyšovat.
( )
R
t t
w w
s =
−
+
2 1
2 1 2/ ( )1,5.02,5.0
12
17,1
ww
tt
RS
+
−
=
t1
t2
w2
t0
w1
h
0
w0.5
2
5.0
2
545,5
w
t
N =
43
Instrumentace CE
Experimentální uspořádání u přístrojů CZE je prakticky vždy stejné, liší se jen
v jednotlivostech, vždy obsahuje nejméně:
separační kapiláru , zdroj napětí, (dávkovač vzorku), detektor, zařízení pro
záznam analytického signálu (viz obrázek).
Typické napětí je 5 – 30 kV, elektrolyt o koncentraci 5 – 200 mM.
Analýza se obvykle provádí v křemenných kapilárách, zřídka v
kapilárách teflonových nebo skleněných. Běžné křemenné kapiláry jsou z
vnější strany chráněny tenkou vrstvou polyimidu, čímž se omezí jejich
křehkost. Typický vnitřní průměr kapiláry je 25 – 75 μm, délka 30 – 80 cm,
objem 1 – 3 μl.
Detekce se nejčastěji provádí UV-Vis detektorem,
konduktometricky, fluorescenčně (laserem indukovaná fluorescence),
ampérometricky, hmotovým spektrometrem (absolutní).
Dávkování (řádově nanolitry) se provádí buď hydrodynamicky
(přetlakem na začátku či podtlakem na konci kapiláry) nebo elektromigračně
(po krátkou dobu se aplikuje dávkovací napětí).
Klíčové parametry separačních podmínek
Elektroforéza je určena především pro separaci slabých bází nebo slabých
kyselin, abychom při znalosti pKa a volbou pH (pufru) měnili
elektroforetickou rychlost jednotlivých analytů. Pravidlo pKa ± 2 říká, že
např. kyselina octová (pKa=4,75) je prakticky neionizovaná při pH<2,75
(nulová mobilita) a plně ionizovaná při pH >6,75 (maximální=tabulková
mobilita).
www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/CE_Main.html
44
STANOVENÍ KYSELINY ACETYLSALICYLOVÉ V ACIFEINU
Kyselina acetylosalicylová (ASA, acetylsalicylic acid,
Aspirin™, Acylpyrin™) je široce používané léčivo
s např. antipyretickými účinky. V této práci bude
stanovován její obsah v komerčně vyráběném léčivu
ACIFEIN (HERBACOS-RECORDATI, s.r.o) metodou CZE.
Kofein (caffeine) (podle rostliny Coffea arabica,
česky kávovník) je alkaloid, který příznivě stimuluje
centrální nervovou soustavu a srdeční činnost.
Kofein je pravděpodobně nejrozšířenější stimulant
na světě nacházející se v mnoha nápojích, např.
kávě, který se užíváním ve větším množství stává
drogou. Kofein patří do skupiny purinových bazí, methylových derivátů
xanthinu, která zahrnuje theobromin (kakao) a theofylin (bronchodilatans).
Paracetamol je léčivo, jež působí proti bolestem
a zvýšené tělesné teplotě, není však
protizánětlivé. Patří do indikačních skupin
analgetikum a antipyretikum.
pKa1=3,5 pKa1=9,9 pKa1=3,0 pKa2= 8,3
http://www.farmaceutika.info/acifein#spc
45
Chemikálie
Tetraboritan disodný (dekahydrát), M = 381,37 g/mol, hydroxid sodný,
kyselina acetylsalicylová, kofein, methanol, voda pro HPLC.
Systém
• nemodifikovaná křemenná kapilára, vnitřní průměr 75/50 µm
• borátový pufr (tetraboritan sodný), pH = 9,25
• napětí = +16 /+30 kV, dávkování = 40 mbar * 3 s / 50 mbar * 0.5 min
• teplota = 25 °C, detekce UV 200 nm
Spektra analytů, c=200 mg/ml
kys.acetylsalicylová 231/296 nm
kys. salicylová 231/297 nm
46
paracetamol, 246 nm
kofein, max 274 nm
Vysvětlení pohybu analytů v kapiláře.
Délka šipek vyjadřuje velikost rychlostí.
47
Pracovní postup
Roztok pufrujícího elektrolytu (BGE): 100 ml 12,5 mM (Agilent) resp. 5 mM
(PrinCE) tetraboritanu sodného, pH = 9,25; ve vodě.
Zásobní roztok standardu (kyselina acetylsalicylová, ASA): navážku
spláchněte 5 ml methanolu do 100 ml odměrky, po dokonalém rozpuštění
doplňte vodou, koncentrace c ≈ 2,4 mg/ml.
METODA KALIBRAČNÍ KŘIVKY (EXTERNÍHO STANDARDU)
Příprava vzorku
Zvažte 10 tablet a spočítejte průměrnou hmotnost jedné tablety. Vyberte
jednu tabletu, zvažte ji, dokonale rozetřete na prášek a 100 mg spláchněte
10 mL methanolu a doplňte na 200,00 ml (vodou). Přítomnost aditiv
znemožňuje úplné rozpuštění tabletky. Všechny stanovované komponenty
(analyty) se však kvantitativně rozpustí do 2 minut. Do ampulky filtrujte!
Kalibrační roztoky
Ze zásobního roztoku standardu ASA nařeďte (do 10,00 ml, doplnit vodou)
kalibrační roztoky tak, že odpipetujete:
0,25 / 0,50 / 0,75 / 1,00 ml
METODA STANDARDNÍHO PŘÍDAVKU (PŘÍDAVKU STANDARDU)
Tato metoda je doporučována pro vzorky se složitou matricí
Příprava vzorku a vzorků s přídavkem standardu
Zvažte 10 tablet a spočítejte průměrnou hmotnost jedné tablety. Vyberte
jednu tabletu, zvažte ji, dokonale rozetřete na prášek a navážku 100 mg
spláchněte do 50 ml odměrné baňky a doplňte po značku. Přefiltrujte cca
10 ml do kádinky a do 4 odměrných baněk 10 ml odměřte vždy 1,00 ml
filtrátu. Do 2., 3. a 4. baňky ještě přidejte postupně ze zásobního roztoku
standardu ASA:
0,20 / 0,40 / 0,60 ml
• Všechny roztoky je nutno připravit pečlivě! Pipetovat by měla jediná
osoba a používat při tom stejnou pipetu! PIPETUJEME od značky 0 dolů!
Nemáme sérologické vyfukovací pipety!
48
• napište si do pracovního sešitu tabulku, jak umístíte jednotlivé roztoky
do karuselu (podle nastavení metody), naplňte ampulky a označte je
fixem
Vyhodnocení
• Spočítejte průměrné migrační časy tm, průměrný počet teoretických pater
N a průměrné rozlišení RS paracetamol – kyselina acetylsalicylová pro píky
ve vzorku (hodnoty tm a w odečtěte ze softwaru Chemstation/Clarity).
• Spočítejte elektroforetickou rychlost a mobility ASA
• vypočítejte průměrnou hmotnost [mg] ASA v tabletě, kterou jste
analyzovali. Spočítejte také hmotnost ASA [mg] v průměrné tabletě
METODA KALIBRAČNÍ KŘIVKY (M. EXTERNÍHO STANDARDU)
• Zkonstruujte lineární kalibrační graf: plocha vs. koncentrace standardu,
otestujete významnost úseku, vypočtěte korelační koeficient r.
Z průměrné plochy píků analytu ve vzorku odečtěte koncentraci ASA
(buď grafickou interpolací nebo použitím regresní kalibrační rovnice)
METODA STANDARDNÍHO PŘÍDAVKU (M. PŘÍDAVKU STANDARDU)
• Zkonstruujte lineární kalibrační graf: plocha vs. koncentrace/množství
přídavku standardu, vypočtěte korelační koeficient r. Z průměrné plochy
píků analytu ve vzorku odečtěte koncentraci ASA (buď grafickou
extrapolací pro Y=0 nebo použitím regresní kalibrační rovnice)
49
A. PŘÍSTROJ CE3D AGILENT
Kazeta (cartridge) = držák kapiláry s detekčním
okénkem, slouží i jako vzduchový chladič
Příslušenství přístroje CE3D AGILENT
skleněné vialky 1,8 ml víčka vialek PP vialky 0,9 ml a 0,25 ml
V případě přístroje Agilent CE3D je délka kapiláry 33 cm (objem kapiláry o
průměru 75 μm je tedy asi 1,5 μl), přičemž efektivní délka (k detekčnímu
okénku, viz obrázek na str. 43) je 23,5 cm. Maximální tlak na promývání je
1000 mbar.
Správné plnění vialek
50
Provedení experimentu
Vedoucí cvičení vysvětlí obsluhu přístroje
určenému zodpovědnému studentovi. Před
posláním jakéhokoli příkazu (software
Chemstation) zkontrolujte, zda nejsou ke kapiláře
zvednuté vialky a jejich pozice zároveň obsazeny
v karuselu!!!
 ikona na ploše:
 jako první je nutno spustit „SYSTEM INIT“ (viz obrázky dále)
 vložte do přístroje kazetu s kapilárou
 ověřte funkčnost systému střídavým promýváním do vialky
8 = odpad z 3 = voda / 2 = hydroxid. Zkontrolujte, zda po cca 6
sekundách dochází ke skokové změně absorbance. Pokud ne,
oznamte to neprodleně vedoucími cvičení; bez nápravy tohoto stavu
by bylo další měření zbytečné
 Zkontrolujte parametry softwaru (metoda ACIFEIN.M)
25 °C, preconditioning 1 min BGE
polarity positive 16 kV
postconditioning = 1 min hydroxid + 1 min voda
injection 3s * 40 mbar
stoptime 2,5 min
DAD: 200/231/246 nm
 proveďte analýzu kalibračních roztoků (3 x)
 za stejných podmínek 3x analyzujte vzorek
51
Software Chemstation:
schéma systému Agilent
První krok: systém INIT
52
Druhý krok: promývání (flush)
Nastavení metody:
53
diagram systému při měření:
typický elektroforeogram
54
B. PŘÍSTROJ PrinCE 500
PrinCE 500 (Prince Technologies, Emmen, Nizozemí) vybavený průtokovým
spektrofotometrickým detektorem Lambda 1010 (Bischoff, Leonberg,
Německo):
V případě PrinCE 500 je minimální délka kapiláry 82 cm (objem 50µm
kapiláry je tedy 1,6 μl), přičemž vzdálenost k okénku z kratší strany je 32 cm.
Protože kapilára je dosti dlouhá, prakticky vždy se používá maximální napětí
zdroje 30 kV a dávkování se provádí až desítky sekund (30 s * 50 mbar).
Pneumatický systém dokáže vyvinout tlak až 2200 mbar.
55
Provedení experimentu
Vedoucí cvičení vysvětlí obsluhu přístroje určenému zodpovědnému
studentovi.
 jako první je nutno zapínat detektor (Lambda 1010), až po té PrinCE,
nakonec řídící software
 ikona na ploše:
 ověřte funkčnost systému střídavým promýváním do vialky 101=
odpad z vialek 133=voda / 102=hydroxid. Zkontrolujte, zda po asi
15 sekundách dochází ke skokové změně absorbance (200 nm).
Pokud ne, oznamte to neprodleně vedoucími cvičení; bez nápravy
tohoto stavu by bylo další měření zbytečné
 Zkontrolujte parametry softwaru (metoda shortNaOH, viz obrázky)
oven 25 °C
prewash 2000 mbar 1 min NaOH, 0.5 min voda, 1 min BGE
voltage +30 kV
injection 0.5 min * 50 mbar
duration 4 min
postwash 1 min voda
wavelength 200 nm
 proveďte analýzu kalibračních roztoků (3 x)
 za stejných podmínek 3x analyzujte vzorek
Správné plnění vialek
56
Software DaX:
Spouštěcí ikonka na ploše:
Základní ovládací panel (šipky označují tlačítka ovládání)
metoda (sled příkazů při experimentu)
57
ovládací okno sběru dat (experimentu)
zadávání jednotlivého experimentu:
Typický elektroforeogram
58
LITERATURA A ZDROJE
Český Lékopis 2009
R. Opatřilová, J. Jampílek, I. Liška, Návody do cvičení z analytické chemie.
Kvantitativní analýza, VFU Brno, 2007
R. Karlíček a kol.: Analytická chemie pro farmaceuty, Praha, Karolinum 2005
J. Šenkýř, P. Lubal, Vybrané postupy pro základní cvičení z analytické chemie,
Kvalitativní a kvantitativní analýza, Masarykova Univerzita, Brno 2004
Multimediální učebnice PřF UPOL (procvičování výpočtů):
https://ach.upol.cz/multimedialni-ucebnice
L. Jančář, Odměrná analýza
http://is.muni.cz/do/rect/el/estud/pedf/js10/chemie/web/index.html
I. Nikolova, Chromatografické metody, ČHÚ
http://physics.ujep.cz/~mkormund/P219/chromatograficke_metody_2014.p
df
Příručka pro začínající vyučující předmětu Cvičení z analytické chemie,
https://docplayer.cz/20193876-Prirucka-pro-zacinajici-vyucujici-predmetu-
cviceni-z-analyticke-chemie.html
pracovní listy:
https://amos.vfu.cz/moodle
ISBN 978-80-7305-735-0
Autoři: Jiří Pazourek, Iva Kapustíková, Klára Odehnalová
Název: Cvičení z analytické chemie 2. Analytická chemie kvantitativní.
Ústav: Ústav chemických léčiv
Počet stran: 58
Vydání: 1. vydání
Vydavatel: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno