KAPILÁRNÍ ZÓNOVÁ ELEKTROFORÉZA LÉČIV 
  
Stanovení kyseliny acetylsalicylové v léčivu 
Kapilární elektroforéza (Capillary electrophoresis, CE) je moderní vysoce účinná analytická separační 
metoda. Principem je pohyb analytů v kapalině mezi dvěma elektrodami vysokého napětí, obvykle 
realizovaný v kapiláře o průměru 25 ‐ 75 μm s on‐column detekcí. 
I. TEORIE 
Elektricky nabitá částice (iont) se v elektrickém poli pohybuje ve směru daném znaménkem 
náboje a orientací el. pole (kladně nabitá částice k zápornému pólu a naopak). V kapalině je rychlost 
tohoto  pohybu  přímo  úměrná  náboji  částice  (F  =  q  ∙  E)  a  nepřímo  úměrná  hydrodynamické 
(Stokesově) velikosti částice d (síla odporu prostředí F = ‐ 3.η.π.d.v, kde η je viskozita kapaliny). Tyto 
dvě  síly  se  prakticky  okamžitě  po  aplikaci  elektrického  pole  vyrovnají  a  částice  se  dále  pohybuje 
konstantní  rychlostí  v.  TO  ZNAMENÁ  =  pokud  se  ionty  vzorku  liší  alespoň  v efektivním  náboji  q  či 
hydrodynamické velikosti d, budou se pohybovat rozdílnými rychlostmi, což je nutnou podmínkou 
separace. 
Při  použití  kapiláry  (typicky  křemenné,  fused  silica)  coby  separační  kolony  je  prostá 
elektromigrace  nezanedbatelně  snižována/zvyšována  tokem  nezávislým  na  náboji  analytu 
(elektroosmotický tok, electroosmotic flow = EOF). 
 
Elektroosmotický tok: 
Stěny křemenné  kapiláry obsahují silanolové skupiny, které se v kontaktu s roztoky o vyšším 
pH disociují. Disociací se pak vytvoří záporný náboj stěny. 
Si OH
R
R
R Si O
-
R
R
R + H
+
 
 
 
 
 
Vysvětlení  elektroosmotického  toku 
v nemodifikované  křemenné  kapiláře:   
povrch  kapiláry  nese  nepohyblivý  negativní 
náboj  (silanolové  skupiny).  V důsledku 
zachování  elektroneutrality  se  proto  u  stěn 
nachází přebytek pozitivních iontů z roztoku, 
které pak i svoje okolí (celou kapalinu) unáší 
ke katodě. 
Kapilární zónová elektroforéza (Capillary zone electrophoresis, CZE)  
a vyhodnocení elektroforeogramu: 
  Jedním  z  módů  CE  je  kapilární  zónová  elektroforéza,  pro  níž  je  charakteristické 
použití  jednoho  pracovního  elektrolytu  (background  electrolyte,  BGE).  V  důsledku  toho  je  v  celé 
separační  kapiláře  konstantní  elektrické  pole.  Jednotlivé  zóny  putují  konstantními,  ale  různými 
rychlostmi, jsou oddělené BGE a odezva detektoru na konci kapiláry (typicky UV‐VIS detektor) má 
gaussovský profil (= pík). Obdobně jako u chromatografie, retenční čas píku tr charakterizuje analyt 
kvalitativně,  kvantitativní  charakteristikou  elektroforeogramu  je  výška  píku  v  (nebo  plocha  ‐  při 
nahrazení píku trojúhelníkem o výšce h a základně w platí P = h ∙ w/2). 
Počet teoretických pater N  je mírou účinnosti kolony 
 
 
kde μ  je  mobilita,  U  napětí,  D  difúzní  koeficient.  (pozn.  tr  a  w  musí  být  vyjadřovány  ve  stejných 
jednotkách  např.  sec  nebo  mm  !!!).  N  je  vysoké  pro  „úzké“  (základna  píku  w    0)  a  zadržované 
(tr ∞) píky. Nejjednodušší odečtení w je nahrazení píku trojúhelníkem (viz obrázek ↓). 
Rozlišení Rs je mírou separace dvou píků, např. hodnota Rs = 1,00 udává, že dva stejné píky 
vykazují jen 2 %‐ní překryv, při Rs = 1,50 považujeme píky za kvantitativně oddělené.  
 
 
   
N
t
w
pro elektrofor
U
D
r
= =
⎛
⎝
⎜
⎜
⎞
⎠
⎟
⎟16
2
2
2 ézu také
μ
 
( )
R
t t
w w
s =
−
+
2 1
2 1 2/
 
t 1
t 2
w 2w 1s t a r t
v
h
 
II. INSTRUMENTACE 
PrinCE  500  (Prince  Technologies,  Emmen,  Netherlands)  vybavený  HPLC  spektrofotometrickým 
detektorem Lambda 1010 (Bischoff, Leonberg, Germany): 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Schéma přístroje CE 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Experimentální  uspořádání  v  CZE  je  prakticky  stále  stejné,  liší  se  jen  v  jednotlivostech. 
Zařízení vždy obsahuje nejméně:  
• separační kapiláru 
• zdroj napětí,  
• (dávkovač vzorku) 
• detektor  
• zařízení pro záznam analytického signálu (viz obrázek ↑).  
Typické napětí je 5 ‐ 30 kV, elektrolyt o koncentraci 5 ‐ 200 mM. Analýza se obvykle provádí v 
křemenných  kapilárách,  zřídka  v  kapilárách  teflonových  nebo  skleněných.  Běžné  křemenné  jsou  z 
vnější  strany  chráněny  tenkou  vrstvou  polyimidu,  čímž  se  omezí  jejich  křehkost.  Typický  vnitřní 
průměr kapiláry je 25 ‐ 75 μm, délka 30 ‐ 80 cm, v případě PrinCE je minimální délka kapiláry 82 cm 
(objem  kapiláry  je  tedy  1,6  μl),  přičemž  vzdálenost  k okénku  z kratší  strany  je  32  cm.  Detekce  se 
nejčastěji  provádí  UV‐VIS  detektorem,  konduktometricky,  fluorescenčně  (laserem  indukovaná 
fluorescence),  amperometricky,  hmotnostním  spektrometrem  (absolutní).  Dávkování  (řádově 
nanolitry)  se  provádí  buď  hydrodynamicky  (přetlakem  na  začátku  či  podtlakem  na  konci  kapiláry) 
nebo elektromigračně (po stanovenou dobu se aplikuje dávkovací napětí).   
   
III. ÚKOL 
Kyselina  acetylsalicylová  (acetylsalicylic  acid,  Aspirin™,  Acylpyrin™)  je  široce 
používané léčivo s např. antipyretickými účinky. V této práci bude stanovován její 
obsah  v  komerčně  vyráběném  léčivu  ACIFEIN  (HERBACOS‐BOFARMA,  s.r.o) 
metodou CZE. 
 
Kofein (caffeine) (podle rostliny Coffea arabica, česky kávovník) je alkaloid, který 
příznivě  stimuluje  centrální  nervovou  soustavu  a  srdeční  činnost.  Kofein  je 
pravděpodobně  nejrozšířenější  stimulant  na  světě  nacházející  se  v  mnoha 
nápojích, např. kávě, který se užíváním ve větším množství stává drogou. Kofein 
patří  do  skupiny  purinových  derivátů  xanthinu,  která  zahrnuje  theobromin 
(kakao) a theofylin (bronchodilatans, látka uvolňující průduškové svalstvo). 
 
Paracetamol je léčivo, jež působí proti bolestem a zvýšené tělesné teplotě, 
není  však  protizánětlivé.  Patří  do  indikačních  skupin  analgetikum  a 
antipyretikum. 
 
Popis výrobku ACIFEIN 10 Tablety 
Co obsahuje váš lék? 
Acidum acetylsalicylicum 250 mg, Paracetamolum 200 mg, Coffeinum 50 mg v 1 tabletě 
Další látky obsažené v léku 
Glycin, kukuřičný škrob, hyprolóza. 
http://www.farmaceutika.info/acifein#spc 
 
 
   
Popis systému 
PrinCE 500 (Prince Technologies, Emmen, Nizozemí) 
křemenná kapilára (vnitřní průměr 75 μm, L = 82 cm, efektivní délka = 32 cm) 
borátový pufr (25 mM tetraboritan sodný), pH = 9,25 
napětí: + 30 kV  
ě í
30000 V
82 cm
366 V/cm 
dávkování: 50 mbar/0.1 min 
teplota: 25 ˚C 
detekce UV při 190 nm 
Chemikálie 
tetraboritan disodný dekahydrát (Na2B4O7 ∙ 10 H2O), kyselina acetylsalicylová, kofein, paracetamol, 
methanol, destilovaná voda 
 
Pracovní postup 
Příprava roztoků 
roztok pufrujícího elektrolytu (BGE): 
 100 ml,  25 mM tetraboritan sodný, pH= 9,25 
příprava vzorku: 
Zvaž 10 tablet  a spočítej průměrnou hmotnost jedné tablety. Vyber jednu tabletu, zvaž ji, dokonale 
rozetři na prášek a 25 mg rozpusť v 5 ml methanolu a doplň na 50,00 ml vodou. Přítomnost aditiv 
znemožňuje  úplné  rozpuštění  tablety.  Všechny  stanovované  komponenty  (analyty)  se  však 
kvantitativně rozpustí do 10 minut. Do ampulky filtruj!       
Zásobní  roztok  standardu  (kyselina  acetylsalicylová  =  ASA)  připravíme  do  25  ml  odměrky, 
koncentrace  c≈2.4 mg/ml,  v  10%  methanolu.  Z tohoto  roztoku  nařeď  do  vody  kalibrační  roztoky 
(10,00 ml) o následujících koncentracích ASA:  24, 120, 180, 240 μg/ml 
• napiš do pracovního sešitu tabulku, jak umístíš jednotlivé roztoky do karuselu, dodrž 
alespoň následující pozice:  
        101 ‐ odpad 
        102 ‐ NaOH 
        111 ‐ borax inlet 
        112 ‐ borax outlet 
        133 ‐ voda 
• naplň vialky až po hrdlo (např. 014 ‐ ASA, 016 ‐ sample, „s“) 
• oznam vedoucímu cvičení připravenost k analýze   
Práce s přístrojem PrinCE 500 
 
Vedoucí cvičení vysvětlí obsluhu přístroje určenému zodpovědnému studentovi.  
‐ jako první je třeba zapnout lampu na detektoru  Lambda 1010, po výboji se musí počkat 
alespoň 15 min, než se hodnota absorbance ustalí na nule 
‐ spusť program DAx umístěný na ploše (bez hesla) 
 
   
 
 
 
‐ parametry softwaru, tvorba metody: 
 
  
   
‐ 
objeví se kontrolní panel: 
   
pojmenování 
vialek  
(„Fluid table“) 
nastavení 
tlaku a teploty 
vynulování 
detektoru
nastavení 
metody (3) 
   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
   
 
(1) „load“ vialek („rotate“ protočení karuselu) > „continue“ (vrátí se do původního stavu, ze 
  kterého jsem ho zavolal), bez „continue“ nerozjedu metodu! 
  (2) „Run“ > „Run Table“ nastavím, co bude „sample“ a po každé změně nesmím zapomenout 
  odeslat změnu z PC do Prince („close“) 
   
 
 
 
 
 
 
 
 
 
  (3) „Method“  > objeví  se okno s metodami a vyberu tu, která má parametry pro 
  měření v této úloze (metoda „gons5“) a tyto paramtery zkontroluji: 
 
   
aktivní 
metoda 
zde  můžu  jednotlivé 
kroky v metodě upravit 
vynulování  detektoru  v průběhu 
metody  (jelikož  v prvním  kroku 
bychom  měřili  nepotřebnou 
absorbanci boraxu) 
Parametry pro tuto úlohu tedy jsou: 
    a)  V prvním  kroku  metody  je  na  inletové  vialce  (č.  111)  roztok  25nM  boraxu  a  na 
    outletové (č. 101) je odpad, nástřik boraxu při tlaku 2000 mbar; 
    b) V druhém kroku dochází k nástřiku vzorku („sample“) z inletové vialky do odpadu 
    při tlaku 50 mbar; 
    c) Měření při U = +25 kV; 
    d) Proplach vodou z vialky č. 133 do odpadu (č. 101). 
  (4) po zadání správných parametrů > „close“ a znovu odeslat   z PC do Prince; 
  (5) měření spustím v „File“ > „New“ v DAx hlavním menu > 
objeví se sekvenční tabulka: 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
   
zastavení 
sběru dat 
po  zvolení  místa 
uložení  opět 
přeposlat  z PC 
do Prince 
(6) při modrém zbarvení se tímto tlačítkem spustí sekvence všech kroků ve zvolené metodě 
 
 
 
 
 
 
Typický elektroforeogram