1 
 
Vysokoúčinná kapalinová chromatografie  
(High performance liquid chromatography, HPLC) 
Stanovení kofeinu v léčivu Acifein 
Obecný popis: Skripta ‐ Jampílek et al., str. 60‐63 
old.lf3.cuni.cz/chemie/cesky/materialy_B/chromatografie.doc 
http://biochemie.sweb.cz/index.htm 
http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html 
http://www.hplc.cz 
 
I. TEORIE HPLC 
Je separační metoda založená na dynamickém (v toku) rozdělování analytu mezi dvě (nesmísitelné) 
fáze – fázi mobilní (kapalina) a fázi stacionární (zakotvená kapalina nebo tuhá fáze). Analyt, který 
v tomto systému vykazuje větší afinitu ke stacionární fázi je v koloně více zadržován a proto přichází 
na  detektor  později  než  analyt  jiný,  který  naopak  strávil  více  času  ve  fázi  mobilní  –  takto  dochází 
k jejich oddělení, separaci. 
 
1 Kapalinová chromatografie - HPLC
 
Mezi metodami kapalinové chromatografie zaujímá významné místo technika HPLC.  Mobilní fází je 
v tomto případě kapalina. Stacionární fází je buď film příslušné látky zakotvený na povrchu nosiče 
anebo pevný adsorbent. Přístroj, na kterém se provádí HPLC analýzy se nazývá kapalinový 
chromatograf.  
 
 
Schematický nákres kapalinového chromatografu 
2 
 
Kapalinový  chromatograf  tvoří  tyto  hlavní  části:  zásobníky  s mobilní  fází,  vysokotlaká  pumpa, 
dávkovač, kolona a detektor. 
Stacionární fáze 
Stacionární fáze je tvořena mikročásticemi silikagelu (3‐10 um), na kterých je navázána vlastní 
stacionární fáze. Vlastní stacionární fáze může být tvořena například nepolárními uhlovodíky (C8 – 
silyl+oktyl, C18 = silyl+oktadecyl), nebo polárnějšími uhlovodíky s funkční skupinou ( např. ‐CN a 
pod).  
Mobilní fáze 
Mobilní fází v RP HPLC může být např. voda, methanol, acetonitril a jejich směsi v různých 
vzájemných poměrech, pufry a další. Na rozdíl od plynové chromatografie, zde mobilní fáze vstupuje 
do interakce se složkami analyzované směsi a konkrétní složení mobilní fáze může významným 
způsobem ovlivňovat celou analýzu (kvalitu separace) – viz dále. 
Klíčovým pojmem pro výběr vhodných podmínek separace (směsi analytů), je eluční síla mobilní fáze. 
Tato  síla  je  vždy  vztažena  na  konkrétní  systém  (konkrétní  stacionární  fázi),  a  ukazuje  schopnost 
eluovat  analyt  ze  stacionární  fáze  („soupeřit“  se stacionární  fází  o  analyt)  v procesu  kontinuálního 
transportu mobilní fáze kolonou.  
Dobrým  odhadem  eluční  síly  je  (v případě  neionizovaných  analytů,  tzn.  když  můžeme  zanedbat 
iontové  interakce)  polárnost  ‐  jak  analytu,  tak  obou  fází.  Podle  distribuce  parciálních  nábojů  (z 
posouzení  elektronegativity  přítomných  atomů)  dané  molekuly  můžeme  pak  usuzovat  na  jejich 
vzájemnou  afinitu:  polární  analyt  bude  mít  vysokou  afinitu  k polární  fázi  a  nepolární  analyt  k 
fázi nepolární. V našem případě nepolární stacionární fáze (C18), tedy můžeme předpokládat a) že 
tato fáze bude více zadržovat méně polární analyty, resp. b)  že eluční síla  mobilní fáze  bude růst 
s rostoucím obsahem její méně polární složky (acetonitrilu). 
 
Chromatogram 
Chromatogram je časový záznam odezvy detektoru; typicky je tvořen soustavou píků, které mají 
různou plochu a výšku, mají od sebe různou vzdálenost a v ideálním případě jsou symetrické a mají 
tvar Gaussovy křivky. 
 
Ukázka  chromatogramu.  Každý  pík  (č.  1  ‐  6)  odpovídá  jedné  složce  analyzované  směsi. 
Vodorovná osa znázorňuje čas. Čas, který odpovídá vrcholu píku, je tzv. retenční čas, který je 
na dané koloně a za daných experimentálních podmínek pro každou látku charakteristický. 
 
Pokud  je  zkoumaná  směs  dobře  rozdělena,  pak  každý  pík  na  chromatogramu  odpovídá  jedné  ze 
složek směsi. Poloha píku na ose x uváděná pomocí retenčního času (určeno podle polohy vrcholu) 
3 
 
určuje,  o  jakou  látku  se  jedná  (kvalitativní  analýza),  plocha  píku  (nebo  jeho  výška  v případě 
symetrických píků) určuje koncentraci látky ve směsi (kvantitativní analýza).  
Identifikace  píků  (látek)  se  provede  tak,  že  se  na  stejné  separační  koloně  za  stejných 
experimentálních  podmínek  provede  nástřik  ověřovaného  standardu  (nebo  připravené  směsi  o 
známém  kvalitativním  složení).  Pokud  se  retenční  čas  píku  na  chromatogramu  neznámé  směsi 
shoduje s retenčním časem píku známého standardu, pak se jedná velmi pravděpodobně o stejnou 
látku.  
Koncentrace látek ve směsi se určuje z ploch nebo výšek píků metodou kalibrace.  
 
Vyhodnocení chromatogramu  
Jak bylo řečeno, kvalitativní charakteristikou látky je retenční čas tr píku. Pokud jsou navíc 
píky  symetrické,  jako  kvantitativní  ukazatel  obvykle  používáme  výšku  v maximu  píku  (hmax).  Pokud 
chceme  pracovat  přesněji,  měříme  plochu  píku  A.  Pro  zjištění  plochy  nejjednodušeji  postupujeme 
tak,  že  pík  aproximujeme  trojúhelníkem  (viz  obrázek),  protože  pak  pro  výpočet  plochy  lze  použít 
vztah  A=1/2*h*w,  kde  h  je  výška  trojúhelníka  a  w  příslušná  délka  základny  trojúhelníka.  Moderní 
software  (Chemastation,  Clarity,  Chromeleon…)  dokáže  provést  numerickou  integraci  v graficky 
přívětivém prostředí; v zásadě však musíme nějak definovat začátek a konec píku.  
t 1
t 2
w 2
t 0
w 1
h
 
Při vyhodnocování chromatogramu dále obvykle počítáme hodnoty N nebo Nef a Rs. Počet 
efektivních  teoretických  pater  Nef  je  mírou  účinnosti  kolony,  je  vysoký  pro  „úzké“  (základna  píku 
w 0) a zadržované (tr ∞) píky.  
 
 
   
Kde t0 je čas analytu nezadržovaného kolonou (mrtvý čas). Pro srovnání účinnosti různě dlouhých 
kolon se zavádí výškový ekvivalent teoretického patra H (L je délka kolony) 
 
   
( )
2
2
0
16
t
r
ef
w
tt
N
−
=2
2
16
t
r
w
t
N =
L
N
H =
4 
 
ROZLIŠENÍ 
tr‐t0 (retenční minus mrtvý čas) se nazývá redukovaný retenční čas (pozn. tr a w musí být vyjadřovány 
ve  stejných  jednotkách  např.  mm  !!!).  Rozlišení  RS  je  mírou  separace  dvou  píků.  Např.  hodnota 
RS=1,00  udává,  že  dva  stejné  píky  vykazují  jen  2  %‐ní  překryv,  při  RS=  1,50  považujeme  píky  za 
kvantitativně oddělené (odseparované).  
 
 
 
Retenční chování daného solutu A se v chromatografii charakterizuje  
 
kapacitním poměrem (faktorem) 
0
0)(
t
tAtr
k
−
=  (=míra afinity ke SF) nebo 
retenčním (retardačním) faktorem  Rf
u A
u k
= =
+
( ) 1
1
 (=zlomek ret. času, který A stráví v MF), kde 
u(A) = průměrná rychlost složky A, u = průměrná rychlost MF.  
 
 
 
 
Schéma dávkovacího zařízení YL 9100 
( ) 2/12
12
ww
tt
RS
+
−
=
5 
 
II. INSTRUMENTACE 
 
Budeme používat systém YL9100 Young Lin 
Instrument Co., Ltd., Soul, Jižní Korea, který 
je plně ovládán softwarem Clarity. 
 
 
 
SOFTWARE CLARITY 
Pořadí zapínání: autosampler, degasser, pumpa, termostat,   poslední PDA, pak spouštím software 
Clarity: 
ikonka je na Ploše 
 
   
 All possible instruments? OK 
 
LOGIN:  project  ACIFEIN 
V PŘÍPADĚ POTŘEBY provádíme jednorázové operace pro zprovoznění systému: 
6 
 
1/ Příprava pumpy 
Přímé ovládání: 
 
Promývání kanálů (PURGE) se provádí pouze v případě výměny zásobních lahví. V našem případě se 
používá isokratikcá eluc epředmíchanou směsí z kanálu C. Před započetím analýz je nutné kolonu 
kondicionovat alespoň 15 min promývaním (Purge 100%C nebo Method send). 
2/ Příprava autosampleru 
 
 
3/ Kontrola termostatu 
 
zkontroluj, zda na modulech nesvítí chybová LED (červená) – nejčastěji na PDA modulu. V tom 
případě na Device Monitor, PDA Detector striskni „Fault Reset“ 
7 
 
 3/ PROVEDENÍ EXPERIMENTU 
Na rozdíl od softwaru Chemstation, použití autosampleru vylučuje mód Single run (ten je jen pro 
manuální nástřik). I v případě spuštění jediného experimentu s autosamplerem se tedy používá mód 
sekvenční – např. s jediným aktivním řádkem. 
 
 
 
Nejdůležitějším v zadáním experimentu je přiřadení metody, tj. souboru parametrů, podle kterých 
pracuje každý z modulů: zde je připravena metoda ACIFEIN_6.MET 
 
4/ Příprava metody: 
 
 
 
8 
 
 
 
 
 
 
9 
 
 
 
                
 
Nejdůležitější karty metody jsou:   AS  |LCgradient |Acquisition|Thermostat|   | | | 
10 
 
Okno detektoru 
 
Spektrální okno PDA detektoru 
 
11 
 
III. ÚKOL 
 
Kyselina acetylosalicylová (acetylsalicylic acid, Aspirin™, Acylpyrin™) je široce 
používané léčivo s antipyretickými a analgetickými účinky.  
 
 
 
Kofein (caffeine) (podle rostliny Coffea arabica, česky kávovník) je 
alkaloid, který příznivě stimuluje centrální nervovou soustavu a srdeční 
činnost. Kofein je pravděpodobně nejrozšířenější stimulant na světě 
nacházející se v mnoha nápojích, např. kávě, který se užíváním ve větším 
množství stává drogou. Kofein patří do skupiny purinových, 
methylových derivátů xanthinu, která zahrnuje theobromin (kakao) a 
theofylin (bronchodilatans, látka uvolňující průduškové svalstvo).  
 
 
Paracetamol je léčivo, jež působí proti bolestem a zvýšené tělesné 
teplotě, není však protizánětlivé. Patří do indikačních skupin analgetikum 
a antipyretikum. 
 
 
V této práci bude stanovován obsah kofeinu v komerčně 
vyráběném léčivu ACIFEIN (HERBACOS‐BOFARMA, s.r.o). 
 
 
http://www.farmaceutika.info/acifein#spc 
 
 
 
12 
 
 
Pracovní postup: 
 
Stacionární fáze: C18 (Supelcosil ABZ+plus, 150x4,6 mm), 3 um částice 
Mobilní fáze (MF): 11% acetonitril: 89%voda, isokratická eluce,  
Bude používána metoda ACIFEIN_6.MET, kanál C (předmíchaná fáze),  
dávkování = pickup 2‐10 uL, konkrétní objem určí vedoucí cvičení 
 
 
Příprava vzorku: 
Zvaž 10 tablet  a spočítej průměrnou hmotnost jedné tablety. Vyber jednu tabletu, zvaž ji, dokonale 
rozetři na prášek a 25 mg rozpusť v methanolu a doplň na 50,00 ml. Přítomnost aditiv znemožňuje 
úplné rozpuštění tablety. Všechny stanovované komponenty (analyty) se ale kvantitativně rozpustí 
do 10 minut. Do vialky filtruj!                  (15 minut) 
 
Zásobní roztok standardu (kofein) připravíme do 100 ml odměrky, přibližná koncentrace 
c≈0.5 mg/ml, v 100% methanolu. Z tohoto roztoku nařeď kalibrační roztoky (10,00 ml/25,00 ml) o 
následujících koncentracích: 
     5, 25, 40, 50 μg/ml               (30 minut) 
Proveď opakovaný nástřik každého standardu i vzorku (3x)      (90 minut) 
 
Vyhodnocení 
1/ Ze získaných dat zkounstruuj lineární kalibrační křivku (lineární regresí) a vypočti množství kofeinu 
v průměrné tabletě. Srovnej tuto hodnotu s deklarovanou (50 mg/tabletu). 
2/ Identifikuj podle spekter jednotlivé píky v chromatogramu vzorku (použijte knihovnu spekter nebo 
obrázek spekter standardů)! 
3/ Spočítej rozlišení píků paracetamolu a kofeinu (Rs) a účinost kolony N pro a) paracetamol, b)  
kofein! 
 
 
13 
 
        Standardy, cca 200 ppm ‐ spektra 
 
 
      
      ASA  231 / 296 nm 
 
   
      SA 231 / 297 nm 
 
 
 
    
       kofein (206) 274 nm 
 
    
        APAP 246 nm