VETERINÁRNÍ A FARMACEUTICKÁ UNIVERZITA BRNO FARMACEUTICKÁ FAKULTA Ústav chemických léčiv Strukturní analýza organických sloučenin, přírodních látek, léčiv a jejich intermediátů pomocí hmotnostní spektrometrie. Michal Greguš, Kateřina Šenkeříková, Pavel Bobáľ   Tato výuková opora vznikla v rámci řešení projektu: 2018FaF/3150/78  BRNO 2018   1    Obsah   1.  Úvod do hmotnostní spektrometrie ................................................................................... 2  2.  Základní součásti hmotnostního spektrometru .................................................................. 4  3.  Ionizace a metody ionizace ................................................................................................. 6  3.1.  Elektronová ionizace (EI – Electron Ionisation) ........................................................... 8  3.2.  Chemická ionizace (CI – Chemical Ionisation) ........................................................... 10  3.3.  Ostřelování vzorků rychlými atomy (FAB – Fast Atom  Bombardement) ................. 12  3.4.  Ionizace elektrosprejem (ESI ‐ ElectroSpray Ionization) ............................................ 12  3.5.  Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI – Atmospheric  Pressure Chemical  Ionization) ............................................................................................................................. 15  3.6.  Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI – Atmospheric  Pressure  Photoionization) ................................................................................................................... 18  3.7.  Ionizace laserem za účasti matrice (MALDI ‐ Matrix Assisted Laser   Desorption/Ionization) ......................................................................................................... 19  4.  Hmotnostní analyzátory a detektory ................................................................................ 23  4.1.  Magnetický sektorový analyzátor s jednoduchou a dvojitou  fokusací iontů ........... 25  4.2.  Kvadrupólový analyzátor ........................................................................................... 29  4.3.  Iontová past ............................................................................................................... 31  4.4.  Průletový analyzátor (TOF – Time‐Of‐Flight) ............................................................. 32  4.5.  Tandemové uspořádání MS/MS ................................................................................ 34  4.6.  Detektory. .................................................................................................................. 35  5.  Hmotnostní spektrum ....................................................................................................... 36  5.1.  Izotopové ionty v hmotnostní spektrometrii ............................................................ 37  5.2.  Základní pravidla fragmentací při ionizaci EI ............................................................. 41  6.  Spojení hmotnostní spektrometrie a separačních technik ............................................... 46  7.  Obrazová příloha – příklady hmotnostních spekter ......................................................... 47  8.  Seznam použité a doporučené literatury ......................................................................... 84      2    1. Úvod do hmotnostní spektrometrie   Hmotnostní  spektrometrie  (MS)  je  fyzikálně‐chemická  metoda,  pomocí které můžeme určit hmotnost atomů, molekul a jejich částí  po jejich převedení na kladné nebo záporné ionty. Díky této metodě  můžeme  určit  strukturu  analyzovaných  látek  anorganického  a  zejména organického původu.   Hmotnostní spektrometrie se od ostatních běžně používaných metod  organické  spektrální  analýzy  liší  tím,  že  vzorek  neabsorbuje  infračervené  ani  ultrafialové  záření  a  ani  rádiové  vlny  z  elektromagnetického  spektra.  Na  rozdíl  od  infračervené  spektroskopie (IR) nebo nukleární magnetické rezonance (NMR), kde  obě  metody  identifikují  sloučeniny  se  specificitou  srovnatelnou  s  hmotnostní  spektrometrií,  MS  je  destruktivní  metoda  analýzy  což  znamená, že po MS analýze nelze již vzorek získat zpět. Na druhou  stranu  je  MS  mimořádně  citlivá  metoda  a  na  získání  relevantních  informací  o  struktuře  analytu  vyžaduje  méně  vzorku  než  IR  nebo  NMR.  Historie  hmotnostní  spektrometrie  sahá  ke  konci  19.  století,  kdy  Eugen  Goldstein  pozoroval  záření,  při  elektrickém  výboji  v plynu  za  sníženého tlaku, putující z anody ke katodě, opačně jako tomu je při  negativně  nabitém  katodovém  záření.  Pozorované  pozitivně  nabité  záření  pojmenoval  jako  anodové  nebo‐li  kanálové  záření.  Německý  vědec Wilhelm Wien objevil, že silné magnetické resp. elektrické pole  dokáže toto záření vychýlit a v roce 1899 sestrojil zařízení s kolmým  elektrickým a magnetickým polem. Takové pole bylo schopné rozdělit  pozitivně nabité částice na základě jejich poměru náboje k hmotnosti  (Q/m).  Wien  také  zjistil,  že  poměr  závisí  na  povaze  plynu  vystavenému  elektrickému  výboji.  Následné  zdokonalení  Wienovi  práce  snížením  tlaku  vedlo  ke  vzniku  prvních  hmotnostních  spektrografů.   Zprvu se hmotnostní spektrometrie využívala jako metoda umožňující  měření  izotopového  zastoupení  různých  prvků.  V roce  1922  získal  Nobelovu  cenu  za  chemii  Francis  William  Aston,  poté  co  objevil  a  popsal  stabilní  izotopy  velkého  množství  neradioaktivních  prvků.  Pomocí hmotnostního spektrometru také zjistil a publikoval hmotnost  izotopu  12 C.  Tato  hodnota  se  později  stala  referenční  pro  měření  atomové  hmotnosti  a  nahradila  předešlý  standart  izotopu  16 O.  Díky  dalšímu zlepšení rozlišovací schopnosti u hmotnostní  spektrometrie,  3    bylo  možné  již  ve  40.  letech  plně  využít  tuto  metodu  v analytické  chemii  při  kvalitativní  analýze  benzinů  a  později  i  k typové  analýze  různě složitých směsí a ropných frakcí. V 50. a  60.  letech  byla  vyvinuta  nová  technika  pro  hmotnostní spektrometrii tzv. technika iontové  pasti,  za  kterou  získali  Nobelovu  cenu  v roce  1989  Hans  Georg  Dehmelt  a  Wolfgang  Paul.  Další Nobelova cena byla udělena v roce 2002  Johnovi  Bennettovi  Fennovi  za  vývoj  ionizace  elektrosprejem (ESI) a Koichi Tanakovi za vývoj jemné laserové desorpce a MALDI techniky  (tyto techniky budou popsány později v kapitole metody ionizace).        4    2. Základní součásti hmotnostního spektrometru   Dnes  používané  hmotnostní  spektrometry  obsahují  5  základních  částí:  Místo  pro  vstup  vzorku, iontový zdroj, analyzátor hmotnosti, detektor a počítač. (Obr. 7)     Obr. 7. Blokový nákres hmotnostního spektrometru   Nedílnou součástí každého takového přístroje je vakuový systém (soustava vakuových pump)  a  iontová  optika  sloužící  k fokusaci  a  urychlení  vzniklých  iontů.  Aby  mohl  být  vzorek  analyzován,  je  nutné  ho  v místě  vstupu  převést  do  plynného  skupenství.  Tato  podmínka  dříve značně omezovala analýzu, neboť sloučenina musela být termicky dostatečně stabilní,  avšak  vývoj  modernějších  přístrojů  umožnil  měřit  i  látky  termicky  labilní  nebo  částečně  těkavé.  Dále  také  lze  propojit  vstupní  zařízení  s  výstupem  kolony  plynového  nebo  kapalinového chromatografu, nebo také s výstupem z kapilární elektroforézy, což umožňuje  analyzovat  separované  složky  soustavy.  Následuje  ionizace  vzniklého  plynu,  během  které  získávají  molekuly,  respektive  jejich  příslušné  ionty  dostatečné  množství  energie,  díky  níž  může dojít k jejich fragmentaci za vzniku jednodušších iontů, neutrálních molekul a radikálů.  Během  ionizace  dochází  i  k urychlení  iontů  vstupujících  do  hmotnostního  analyzátoru.  Hmotnostní  analyzátor  je  v podstatě  zařízení  využívající  silné  magnetické  nebo  elektrické  pole, které je schopné změnami trajektorií rozdělit směs iontů na základě poměru hmotnosti  (relativní atomová hmotnost) k počtu elementárních nábojů iontů m/z. Jednotlivé ionty dále  dopadají na detektor, za vzniku analogového signálu. Ten se následně digitalizuje a převádí  do  počítače,  kde  se  pomocí  programového  vybavení  zpracuje  do  podoby  hmotnostního  spektra.  Hmotnostním  spektrem  označujeme  zápis  relativního  zastoupení  rozdělených  iontů  charakteristickým  poměrem  hmotnosti  k náboji.  Vzhledem  k tomu,  že  během  ionizace  vznikají  majoritně  jednonásobně  nabité  ionty  s nábojem  rovnajícím  se  z  =  1,  poměr  hmotnosti a náboje vyjadřuje hmotnost příslušného iontu. Každý hmotnostní spektrometr  musí  být  také  vybaven  vakuovou  aparaturou,  díky  níž  je  možné  v analyzátoru,  popřípadě  v iontovém zdroji dosáhnout velmi nízkého tlaku v rozmezí 10‐3  až 10‐6  Pa (10‐5  až 10‐8  Torr).  5    Tento nízký tlak je esenciální, neboť brání nežádoucím srážkám iontů a neutrálních molekul  v době mezi ionizací a detekcí iontů.   Nutno  podotknout,  že  se  hmotnostní  spektrometrie  značně  liší  od  ostatních  spektrálních  metod,  které  měří  absorpci  nebo  emisi  elektromagnetického  záření  v závislosti  na  jeho  energii. Tvar hmotnostních spekter není možné předpovědět kvantově‐chemickými výpočty  a jejich interpretace se řídí hlavně empirickými zkušenostmi. Vzhled – kvalita hmotnostního  spektra  zde  závisí  mnohem  více  na  parametrech  přístroje,  než  při  jiných  spektrálních  metodách. Spektra té samé látky mohou být značně odlišná v závislosti na ionizační technice,  uspořádání  jednotlivých  částí  přístroje  či  využití  různých  technik  podporující  fragmentaci  iontů.  V hmotnostní  spektrometrii  probíhají  všechny  děje  v silně  zředěném  plynu  (danou  látku  lze  analyzovat  a  identifikovat  již  při  hmotnostech  menších  než  10‐12 g)  a  vzniklé  spektrum je výsledkem mnoha konkurenčních po sobě jdoucích monomolekulárních reakcí.  Můžeme  tedy  říct,  že  hmotnostní  spektrometrie  závisí  na  chemické  reaktivitě.  Vzhledem  k tomuto  faktu  a  k informacím  výše  uvedeným  se  hmotnostní  spektrometrie  nezařazuje  mezi  spektrální  metody.  Na  druhou  stranu  díky  získaným  informacím  při  studiu  různých  struktur látek, možnosti jejich identifikace a separace se hmotnostní spektrometrie běžně  interpretuje společně se spektrálními metodami.         6    3. Ionizace a metody ionizace   Jak  již  bylo  řečeno,  molekuly  analyzované  látky  musí  být  převedeny  na  příslušné  ionty,  k tomuto  účelu  slouží  iontový  zdroj.  Pro  ionizaci  dané  látky  je  potřeba  překonat  její  tzv.  ionizační  energii,  ta  se  pro  organické  látky  pohybuje  v rozmezí  7  –  16  eV.  Dále  je  nutné  zaručit, aby při daném způsobu ionizace bylo možné reprodukovat zastoupení jednotlivých  iontů vstupujících do analyzátoru hmotnosti.  Účinnost ionizace je extrémně nízká ‐ pouze  0,01  %  molekul  vstupujících  do  iontového  zdroje  je  převedeno  do  iontového  stavu.   V současné  době  existuje  velké  množství  způsobů,  jak  lze  analyzovanou  látku  ionizovat.  I  přesto  neexistuje  univerzální  ionizační  technika  pro  všechny  látky.  Samotný  výběr  konkrétního  typu  ionizace  závisí  na  typu  látky  a  na  požadavcích  kladených  na  analýzu.  Jednotlivé  způsoby  ionizace  lze  rozlišit  na  základě  skupenství,  v němž  ionizace  probíhá,  a  množství  energie  dodávané  iontovým  zdrojem  do  procesu.  Nejběžnější  je  ionizace  látek  v plynném  skupenství.  Termolabilní  nebo  netěkavé  látky  lze  ionizovat  buď  v pevném  skupenství (vznikne plazma iontů) nebo jako kapalné látky v médiu, ale také v podobě eluátu  z kapalinové chromatografie. Podle množství dodané energie rozdělujeme ionizační techniky  na měkké a tvrdé.   U měkké techniky je přebytek dodané vstupní energie malý a vzniklý ion se fragmentuje jen  s malou  pravděpodobností.  U  tvrdé  techniky  je  použito  velké  množství  energie,  která  výrazně  převyšuje  ionizační  energii  molekuly  a  tento  energetický  přebytek  (rotačně  –  vibrační energie) se eliminuje fragmentací primárního iontu.   Vzhledem  k velkému  množství  druhů  ionizace se  budeme věnovat  pouze  některým  –  těm  nejčastěji  využívaným:  Elektronová  (EI)  a  chemická  ionizace  (CI),  Chemická  ionizace  za  atmosférického  tlaku  (APCI),  Fotoionizace  za  atmosférického  tlaku  (APPI),  Ostřelování  vzorků  rychlými  atomy  (FAB),  Ionizace  laserem  za  účasti  matrice  (MALDI)  a  Ionizace  elektrosprejem  (ESI).  Přehled  těchto  nejčastěji  používaných  metod  ionizace  je  uveden  v  tabulce č. 1  Orientační pravidlo určující míru tvrdosti ionizační techniky:    Volba ionizační techniky se řídí fyzikálně‐chemickými vlastnostmi analytu jako jsou: těkavost  látky což souvisí s její polaritou, tepelná stabilita látky, velikost molekuly (mol. hmotnost).  Pro  analýzu  těkavých,  termicky  stabilních  látek  s molekulovou  hmotností  do  1 000  g.mol‐1   jsou  vhodné  tvrdé  techniky  (EI,  CI).  Výhodou  těchto  technik  je  jejich  vysoká  citlivost  a  existence rozsáhlých knihoven spekter. V případě termolabilních nebo netěkavých sloučenin,  7    nebo sloučenin s vysokou molekulovou hmotností je vhodné použít měkké techniky. Kritéria  použití jednotlivých ionizačních technik vyjadřuje ve zjednodušené formě obrázek 8.   Tabulka č. 1. Nejznámější ionizační techniky v hmotnostní spektrometrii  Ionizační  metoda  Ionizační  činidlo  Tlak  v iontovém  zdroji  Citlivost   Použití  EI  elektrony   50 – 70 eV  10‐4  – 10‐6  torr  ng – pg   analýza hlavně termostabilních  těkavých, nízkomolekulových a  nepolárních látek, v kombinaci GC/MS  CI  reakční plyn  a elektrony  ~ 1 torr  ng – pg  analýza hlavně termostabilních  těkavých, nízkomolekulových a  nepolárních látek, v kombinaci GC/MS  FAB  atomy Xe,  Ar  10‐3  – 10‐4  torr  µg – ng  analýza hlavně termolabilních,  polárních a vysokomolekulových látek  ESI  elektrické  pole  atmosférický  ng – pg  analýza hlavně termolabilních,  netěkavých a polárních látek, často  v kombinaci HPLC/MS a CE/MS  APCI  koronový  výboj  atmosférický  ng – pg  analýza relativně termolabilních,  netěkavých a středně polárních látek,  často v kombinaci HPLC/MS a CE/MS  APPI  fotony (UV)  10,6 eV  atmosférický  ng – pg  analýza relativně termolabilních,  nepolárních až středně polárních  látek, často v kombinaci HPLC/MS a  CE/MS  MALDI  fotony z  laseru  10‐6  – 10‐7  torr  µg – ng  analýza hlavně termolabilních,  polárních a vysokomolekulových látek        Obr. 8. Rozsah použití různých metod ionizačních technik.   8    Dalším důležitým faktorem je volba polarity ionizace. To platí zejména pro měkké techniky.  Nejčastěji používanou je ionizace v pozitivním modu, při které vznikají kvazimolekulové ionty  [M+H]+ . Ionizace v negativním modu je využívaná u látek podléhajících snadné deprotonaci  (karboxylové  a  sulfonové  kyseliny,  polyhydroxy  sloučeniny,  nitrosloučeniny,  apod.).  Pro  studium  nekovalentních  interakcí  je  asi  jedinou  vhodnou  metodou  ESI.  V případě,  že  analytem  je  směs  látek,  je  téměř  nutné  použít  metodu  kompatibilní  se  separačními  technikami, jako jsou GC, HPLC, CE nebo SFC.     3.1. Elektronová ionizace (EI – Electron Ionisation) Elektronová  ionizace  patří  mezi  jednu  z nejstarších,  nejpropracovanějších  a  v současnosti  stále  používanou  metodu.  Řadíme  ji  mezi  tvrdé  ionizační  techniky,  při  nichž  interaguje  vysokoenergetický  proud  elektronů  s analyzovanou  látkou  v plynném  skupenství.  Proud  elektronů  získáme  zahřátím  resp.  rozžhavením  wolframového  nebo  rheniového  vlákna  (katody), ten následně dopadá na anodu. Mluvíme tedy o katodovém záření a jeho kinetická  energie se dá plynule regulovat napětím přiváděným na katodu v rozmezí od 5 do 100 eV.  (Obr.  9)  Elektrony  s energií  přesahující  ionizační  energii  molekul  (7‐16  eV)  jsou  schopné  vyrazit (pozn.: tento termín není přesný, protože ke skutečnému střetu elektronů nedochází)  elektrony z molekuly, zejména elektrony z nevazebných elektronových párů. Vzniká kation  s lichým počtem elektronů – kationradikál M+•  neboli molekulový ion.  Schéma vzniku molekulového ionu:     Přednostně dochází ke ztrátě nejméně vázaného elektronu v molekule tj. jednoho elektronu  s nejvýše  obsazeného  molekulového  orbitalu  (HOMO).  Obecně  pořadí  jak  se  elektrony  vlivem EI uvolňují je:    Jestliže energie dodaná elektrony přesáhne energii nejslabší vazby v molekule, může dojít  k roztržení  vazby  a  nastává  fragmentace.  Jako  její  výsledek  vzniká  menší  nabitá  částice  (fragmentový  ion,  např.  kation  B+   nebo  kationradikal  C+• ),  neutrální  částice  Y,  popřípadě  radikály X• . S fragmentací také souvisí riziko, kdy může dojít k úplnému rozpadu primárního  molekulového iontu, ten poté není možné pozorovat ve výsledném hmotnostním spektru.  V takovém případě někdy postačí snížit energii ionizujících elektronů, čímž se docílí zvýšení  intenzity molekulového iontu.       9    Základní schéma fragmentace:     Čím vyšší bude energie elektronů než disociační energie, tím vyšší bude pravděpodobnost, že  dojde  v molekule  k fragmentaci.  Protože  chceme  docílit,  aby  proces  fragmentace  probíhal  jako monomolekulová reakce, je nezbytné pracovat pod velkým vakuem řádově 10‐5  až 10‐6   torru. Tím zamezíme vzájemným srážkám iontů a molekul.   Při EI se standartně používá energie elektronů 70eV. Takové množství energie nám zajistí  vznik maximálního počtu iontů a také zabezpečí rozsáhlou fragmentaci.  Alternativou  vyrážení  elektronů  z cílové  molekuly  je  jejich  zachycení.  V takovém  případě  vzniká molekulový ion s lichým počtem elektronů a záporným nábojem – anionradikál M‾• .  Pravděpodobnost  zachycení  elektronu  je  však  příliš  malá  a  tento  jev  nastane  pouze  v případě,  že  se  v analyzované  molekule  nachází  elektronegativní  funkční  skupina  (např.  halogeny). Energie ionizujících elektronů je řádově nižší než při standartním EI a nepřesahuje  hodnotu  15  eV.  Dále  se  do  ionizačního  zdroje  zavádí  tzv.  brzdný  plyn,  který  zpomaluje  dopadající elektrony a tím zvyšuje pravděpodobnost jejich zachycení.    Schéma vzniku anionradikálu:            Obr. 9. Schéma přístroje s elektronovou ionizací.  10    Metoda  elektronové  ionizace  (EI)  se  dneska  využívá  při  analýze  těkavých,  nepolárních  a  nízkomolekulových látek hlavně ve spojení s plynovou chromatografií (GC).     3.2. Chemická ionizace (CI – Chemical Ionisation) Chemickou  ionizaci  řadíme  mezi  měkké  metody  ionizace  a  částečně  představuje  analogii  ionizace  elektronovým  impaktem.  Konstrukce  iontového  zdroje  chemické  ionizace  je  prakticky totožná s EI, díky čemuž dnes velmi často dochází ke kombinaci a využití těchto  dvou  metod  podle  potřeby.  (Obr.  10)  Stejně  jako  u  elektronové  ionizace  dochází  i  zde  k ionizaci díky elektronům z rozžhavené katody, avšak energie těchto elektronů je mnohem  větší a může dosahovat 300 či více eV. Tyto energeticky bohaté elektrony však nepůsobí na  analyzovanou  látku  přímo.  Primárně  atakují  reakční  plyn,  který  je  přiváděn  do  ionizační  komory společně s analytem. Abychom předešli nežádoucím srážkám ionizujících elektronů a  vzorku,  je  nutné  zajistit,  aby  koncentrace  vzorku  vůči  reakčnímu  plynu  byla  výrazně  nižší  (zpravidla nepřesáhne více než 0,01 %). Tlak při tomto způsobu ionizace je oproti EI relativně  vysoký, v rozmezí 50 – 150 Pa (0,5 – 1 torr).         Obr. 10. Schéma přístroje s chemickou ionizací.   Jak už bylo řečeno, samotná ionizace probíhá díky reakčnímu plynu v přístroji, jehož výběr  závisí na typu analyzované látky. Nejčastější volbou bývá metan, isobutan nebo amoniak,  můžeme  ale  použít  i  propan,  vodík,  dusík,  páry  vody  nebo  metanolu  nebo  některý  ze  vzácných plynů.  Při nárazu ionizujícího  elektronu na molekulu reakčního plynu (např. metanu), dochází ke  vzniku  kationradikálu  CH4 +• ,  který  díky  vyššímu  tlaku  interaguje  s dalšími  molekulami  za  vzniku stálých kationtů CH5 +  a C2H5 + .   11        Analogicky vznikají kationty i dalších reakčních plynů.           Tyto kationty se poté chovají jako silné Brönstedovy kyseliny a při kontaktu s molekulami  analyzované  látky  odevzdají  svůj  proton  za  vzniku  kationtu  [M+H]+   a  neutrální  molekuly.  Tuto  schopnost  reakčního  plynu  odevzdat  proton,  můžeme  charakterizovat  jako  tzv.  protonovou  afinitu  EPA.  Ta  je  definována,  jako  záporná  hodnota  změny  enthalpie  u  všeobecné  protonační  reakce.  Volně  přeloženo,  jedná  se  o  energii  uvolňující  se  při  adici  protonu na cílovou molekulu.         Protonové afinity různých reakčních plynů jsou uvedeny v tabulce č. 2.   Tabulka č. 2. Vybrané termo‐chemické údaje o iontech vybraných molekul v plynné fázi.  Reakční plyn  IE (eV)a   EPA (kJ.mol‐1 )a Reakční plyn IE (eV)a EPA (kJ.mol‐1 )a   methan  12,6  543  dusík  15,6  494  propan  10,9  625  amoniak  10,0  854  isobutan  10,7  677  voda  12,6  691  vodík  15,4  422  methanol  10,8  754    a ‐ hodnoty převzaté z literatury1   12    Jestliže  má  ionizující  plyn  vysokou  hodnotu  EPA  (amoniak,  aminy),  nedochází  přednostně  k protonaci ale k adiční reakci plynu na molekulu analytu. Vznikne adukt molekulového iontu  např. [M+NH4]+ , ten se štěpí na ion [M+H]+  a neutrální molekulu reakčního plynu (NH3).  Kationtový komplex [M+H]+  představuje charakteristický molekulový ion ve spektru positivní  chemické  ionizace  (PICI).  Takové  ionty  mají  mnohem  nižší  přebytek  vnitřní  energie  a  nedochází u nich k další fragmentaci. Díky tomu je možné chemickou ionizaci využít u látek,  které  při  klasické  elektronové  ionizaci  neposkytují  molekulový  pík.  Relativní  hmotnost  kationtu  [M+H]+   je  o  jednotku  vyšší  než  molekulová  hmotnost  výchozí  analyzované  látky  před ionizací a označuje se jako kvazimolekulový ion.   Chemická  ionizace  umožňuje  tvorbu  kladně  i  záporně  nabitých  iontů.  Negativní  chemická  ionizace (NICI) se uplatňuje především u sloučenin obsahujících kyselé funkční skupiny nebo  elektronegativní prvky např. halogeny.     3.3. Ostřelování vzorků rychlými atomy (FAB – Fast Atom Bombardement) Ostřelování vzorků rychlými atomy (FAB) jak to už naznačuje název, zahrnuje bombardování  roztoku  analytu  v  matrici  za  vakua  paprskem  rychle  se  pohybujících  atomů,  nejčastěji  xenonových nebo argonových atomů s energií v rozmezí 4 – 10 keV. Toto ostřelování má za  následek přenos energie z atomů Xe (Ar) do matrici, což vede k přerušení intermolekulárních  vazeb a k desorpci analytu do plynné fáze a jeho ionizaci. Technika FAB je nízko fragmentační  (měkká) ionizační technika a byla široce využívána pro ionizaci velkých polárních molekul.  Obecně dává píky primárně intaktních protonovaných molekul [M+H]+  s malou fragmentací.  FAB lze také použít ke generování negativně nabitých iontů [M–H]‾. Nejčastěji používanými  matricemi jsou alkoholy zejména: glycerol, 4‐nitrobenzylalkohol nebo triethanolamin.     3.4. Ionizace elektrosprejem (ESI ‐ ElectroSpray Ionization) Tato  metoda,  řazená  mezi  měkké  techniky,  umožňuje  práci  s kapalnou  fází  za  atmosférického tlaku, díky čemuž je možné ji spojit s kapalinovou chromatografií. Je určená  pro středně polární až iontové látky, u nepolárních sloučenin ji nelze aplikovat. ESI zaručuje  velmi  šetrný  způsob  ionizace,  při které  můžeme  analyzovat  látky  labilních  sloučenin  nebo  také biomolekuly. Za vývoj metody ESI a následnou analýzu biomakromolekul získal v roce  2002 John B. Fenn Nobelovu cenu za chemii.  13        Obr. 11. Obrázek elektrospreje z křemenné kapiláry – převzaté z literatury.2   Analyzovaná látka rozpuštěná v mobilní fázi se kontinuálně přivádí do přístroje přes úzkou  kapiláru s vnitřním průměrem přibližně 0,1 mm. Optimální průtok kapilárou je v mezích 1 –  100 µL/min. U ústí kapiláry detekujeme napětí v rozmezí 3 – 5 kV, to vytváří elektrostatické  pole a způsobuje, že je mobilní fáze rozprášena (nebulizována) za vzniku aerosolu nabitých  kapek roztoku analytu. (Obr. 11) Nebulizaci také pomáhá tzv. zmlžující plyn, nejčastěji dusík.  Po  rozprášení  jsou  nabité  kapičky  vystaveny  sušícímu  plynu  –  zahřátému  dusíku,  jenž  pomáhá odpaření rozpouštědla. Tím dochází ke zmenšení rozměru kapek, přičemž hustota  náboje  se  zvyšuje  až  do  kritické  velikosti.  Jestliže  se  vyrovnají  odpudivé  síly  mezi  stejně  nabitými částicemi a silami zodpovídající za povrchové napětí, nastává dosažení Rayleigho  limitu  stability,  což  má  za  následek  tzv.  coulombickou  explozi.  (Obr.  12)  Původní  kapka  „exploduje“,  přičemž  vzniká  množství  menších  identických  kapek.  Tento  děj  se  neustále  opakuje až do doby, kdy se z vysoce nabitých kapek neuvolní samotné ionty do plynné fáze.  Uvolněné  ionty  jsou  následně  vtaženy  do  kapiláry,  odkud  vstupují  do  hmotnostního  analyzátoru.   odpařování rozpouštědla zmenšování kapek Rayleighův limit stability Coulombické štěpení uvolňení iontů analytu sprejovací kapilára zdroj vysokého napětí analyt kapky s nadbytkem naboje na povrchu [M+H]   Obr. 12. Ilustrace zobrazující tvorbu mikroskopických kapiček obsahujících analyt a tvorbu  iontů analytu.  Vlastní  konstrukce  iontových  zdrojů  (ESI)  se  značně  liší,  ale  všechny  fungují  na  stejných  zásadách. Příklad konstrukce ESI iontového zdroje uvádí obrázek 13.  Elektrosprej není ionizační metodou sám o sobě a popisuje proces, při kterém ionty přechází  z kapalného skupenství do plynného. Skutečná ionizace je děj acido‐bazický a nabité částice  analyzované  látky  musí  být  přítomny  už  v rozpouštědle.  Ionizace  tedy  nastává  buď  protonizací anebo deprotonizací analytu.  14    zmlžující plyn (nebulizace) ohřátý sušící plyn (dusík) rozprášení rozpouštědla s analytem, tvorba aerosolu možnost ohřevu vstup do analyzátoru vakuum zdroj vysokého napětí kapilára sprejovací kapilára skimmer [M+H] atmosferický tlak     Obr. 13. Blokový nákres ortogonální konstrukce iontového zdroje ESI.  V pozitivním módu, který se využívá nejčastěji, se do mobilní fáze přivádí menší množství  kyseliny mravenčí, octové nebo trifluoroctové, sloužící jako zdroj protonů. Tyto protony se  váží  na  nukleofilní  místo  v analyzované  molekule  a  vzniká  nabitý  komplex  [M+H]+ ,  ten  je  charakteristický  pro  menší  molekuly  do  hmotnosti  1000  Da.  Větší  molekuly  jsou  často  schopné  přijmout  více  jako  jeden  proton  a  vznikají  vícenásobně  nabité  ionty  [M+H2]2+ ,  [M+H3]3+  (obecně [M+Hn]n+ ). Tato skutečnost umožňuje detekci látek s vysokou molekulovou  hmotností  například  polypeptidů  a  bílkovin,  a  to  až  do  hmotnosti  100 000  Da.  Kromě  protonu  může  analyt  vytvářet  aduty  také  s  alkalickými  kovy  (lithium,  sodík,  draslík),  popřípadě s amonným kationtem. V negativním módu analyzovaná látka ztrácí vlastní proton  z molekuly a vzniká iontový komplex [M–H]‾. Stručný přehled typických iontů vytvářených  v  iontovém zdroji ESI udává tabulka č. 3.  Ve  spektru  se  zpravidla  nenacházejí  (popřípadě  jen  velmi  zřídka)  píky  fragmentovaných  iontů.  Jestliže  bychom  chtěli  dosáhnout  spektra  s větším  zastoupením  fragmentovaných  iontů, je nutné zvýšit napětí v iontovém zdroji. Fragmentace můžeme také docílit interakcí  nabitých  částic  s reakčním  plynem  (např.  argonem)  při  tandemovém  uspořádání  hmotnostních analyzátorů. Rozpouštědla použitá v ESI jsou obvykle roztoky vody s těkavými  organickými  rozpouštědly,  nejčastěji  metanolem  nebo  acetonitrilem.  Jak  již  bylo  vzpomenuto, do této směsi se přidává také menší množství kyseliny, která slouží jako zdroj  ionizujících protonů, kromě toho také zvyšuje vodivost mobilní fáze.       15    Tabulka č. 3. Typické ionty vytvářené v ESI iontovém zdroji.  Pozitivní ionty  Negativní ionty  [M+H]+ , [M+Na]+ , [M+NH4]+ , [M+Alk]+ ,   [M–H]‾, [M+HCO2]‾, [M+CH3CO2]‾,   [M–Hn+Alkn+1]+ , [2M+H]+ , [2M+Alk]+   [M+Cl]‾, [M+A]‾, [M–Hn+Alkn‐1]‾,   [M+rozp+H]+ , [M+rozp+Alk]+   [2M–H]‾, [M+rozp–H]‾,  Kat+ , [Katn+An‐1]+   A‾, [Katn‐1+An]‾  Kat = kation, A = anion, rozp = rozpouštědlo, Alk = alkalický kov  Práci  při  atmosférickém  tlaku  v  průběhu  ionizace  provází  problém  dosažení  vakua  v hmotnostním  analyzátoru.  Toho  lze  docílit  použitím  jedné  či  více  vakuových  vývěv  v různých částech hmotnostního spektrometru. Jednotlivé části jsou od sebe oddělené tzv.  skimmery.    3.5. Chemická ionizace za atmosférického tlaku (APCI – Atmospheric Pressure Chemical Ionization) Chemická  ionizace  za  atmosférického  tlaku  patří  mezi  měkké  metody  ionizace  a  lze  ji  považovat  za  přechod  mezi  chemickou  ionizací  a  ionizací  pomocí  elektrospreje.  Způsob  ionizace je analogický, avšak šetrnější než u CI, uspořádání iontového zdroje je obdobné jako  u ESI. (Obr. 14)      Obr. 14. Ortogonální konstrukce APCI iontového zdroje.  16    Analyzovaná látka v rozpouštědle se přivádí prostřednictvím úzké kapiláry s průtokem od 0,2  do 2 ml/min. Ústí kapiláry končí v iontovém zdroji, teplota uvnitř zdroje může dosahovat 300  – 600 o C. Vzniká aerosol a při tak vysoké teplotě se mobilní fáze bleskově odpaří. K tvorbě  aerosolu  dopomáhá  také  zmlžující  plyn  a  k   odpaření  rozpouštědla  přispívá  sušící  plyn,  v  obou případech to je dusík stejně jako u ESI. Hlavním rozdílem oproti ESI je však fakt, že  k ionizaci  nedochází  použitím  vysokého  napětí  (v  kapiláře).  Odpařený  analyt  spolu  s rozpouštědlem je následně vystavený koronovému výboji z jehlové (výbojové) elektrody  s napětím cca 2 – 8 kV. (Obr. 15)   koronový výboj sprejovací kapilára analyt [M+H] ohřev ohřev výbojová elektroda (jehla) napětí: 2 - 8 kV atmosferický tlak     Obr. 15. Detail oblasti koronového výboje v APCI iontovém zdroji.   Koronový výboj je schopen ionizovat molekuly rozpouštědla, ale i běžných plynů přítomných  ve vzduchu, protože celý proces probíhá za atmosférického tlaku. Vznikají při něm primární  ionty odvozené od dusíku, vody, molekul rozpouštědla (Obr. 16), ale i různých jiných molekul  vyskytujících  se  v mobilní  fázi.  Mechanismus  ionizace  samotného  analytu  se  podobá  chemické ionizaci a je založen na protonové afinitě. Molekuly vody nebo rozpouštědla (např.  metanol,  acetonitril)  mají  relativně  vysoké  a  současně  blízké  hodnoty  protonové  afinity,  proto  jsou  schopné  zachytit  jakýkoliv  volný  proton  přítomný  v plynu.  Jestliže  se  následně  takto vzniklá protonizovaná molekula dostane do kontaktu s molekulou analyzované látky,  která má větší protonovou afinitu (resp. je více bazická), dojde k transferu protonu za vzniku  charakteristického kvazimolekulového iontu [M+H]+ .  Ionizace  za  normálního  tlaku  (101kPa;  758  Torr),  zabezpečuje  vysokou  míru  srážek  jednotlivých  částic,  jinak  řečeno  vysokou  efektivitu  ionizačního  procesu.  Atmosférický  tlak  má však i několik nevýhod. První je samotný iontový zdroj – výbojová elektroda je u APCI  esenciální,  neboť  běžný  způsob  tvorby  ionizujících  elektronů  pomocí  žhaveného  wolframového nebo reniového vlákna by vedl k jeho přepálení. Druhou překážkou je teplota,  které  je  vystavena  analyzovaná  látka.  Organické  látky  jsou  častokrát  termolabilní  a  při  vysokých  teplotách  sloužících  na  odpařování  mobilní  fáze  může  docházet  k rozkladu  17    analyzované  molekuly.  V neposlední  řadě  je  to  rozdíl  tlaků  mezi  ionizačním  zdrojem  a  hmotnostním analyzátorem. Stejně jako u ESI se i zde využívají vakuové vývěvy v oddělených  segmentech a skimmery oddělující tyto sektory.      Obr. 16. Chemické proměny v koronovém výboji  Při  APCI  je  fragmentace  vzniklého  tzv.  kvazimolekulového  iontu  [M+H]+   méně  pravděpodobná ze stejných důvodů, jako je tomu při chemické ionizaci. Fragmentaci však lze  uměle indukovat vyšším napětím na elektrodě. Termickým rozpadem molekuly dochází také  k fragmentaci původní molekuly a i když se může tento rozpad jevit jako škodlivý prvek, je  možné ho v některých případech využít pro jeho reprodukovatelnost při kvantitativní analýze  látek.  Spektra lze změřit v pozitivním i negativním módu s molekulovým iontem [M+H]+  anebo [M– H]‾. V negativním módu je také možný vznik aduktu [M+X]‾. V praxi je tato metoda ionizace  při  atmosférického  tlaku  vysoce  kompatibilní  s vysokoúčinnou kapalinovou  chromatografii  (HPLC). Analyzovat látky lze do hmotnosti 2 000 Da a to už v množství femtogramů (10‐15 g).    18    3.6. Fotoionizace za atmosférického tlaku (APPI – Atmospheric Pressure Photoionization) Fotoionizace  za  atmosférického  tlaku  představuje  další  z měkkých  ionizačních  technik.  Nalezneme  u ní  podobné  uspořádání  iontového  zdroje  jako  u  chemické  ionizace  za  atmosférického  tlaku.  (Obr.  17)  Mobilní  fáze  spolu  s rozpuštěným  analytem  je  přiváděna  kapilárou, na jejímž ústí se nachází výhřevné články vytvářející aerosol. Na vzniku aerosolu se  také  podílí  zmlžující  plyn,  zatímco  na  jeho  odparu  sušící  plyn  (zahřátý  dusík).  Páry  rozpouštědla  a analytu  jsou  následně  vystaveny  ionizujícím  fotonům  emitovaných  z kryptonové výbojky, které indikují sérii reakcí vedoucích k ionizaci analyzované látky. Jedná  se  tedy  o modifikaci  klasické  metody  APCI,  u níž  je  namísto  výbojové  elektrody  použita  výbojka.     Obr. 17. Schematický nákres APPI iontového zdroje.   Kryptonová výbojka je schopná emitovat fotony s energií 10 eV, což odpovídá vlnové délce  UV  záření.  Tato  energie  může  ionizovat  velkou  část  organických  sloučenin, přičemž  nepřesahuje ionizační energii jednotlivých složek vzduchu (dusík, kyslík), nebo nejběžnějších  rozpouštědel  (voda,  methanol,  acetonitril).  Analyzovaná  látka  může  tedy  být  ionizována  přímo  emitovanými  fotony  vyražením  elektronu  z molekuly  za  vzniku  molekulového  ionu  M+• .  Vzniklý  molekulový  ion  následně  reaguje  s molekulami  rozpouštědla  a abstrahuje  z něho proton, přičemž vzniká kladně nabitý iontový komplex (kvazimolekulový ion) [M+H]+ .       19    Přímá ionizace (direct APPI) je provázená nízkou účinností, což lze z části vysvětlit absorpcí  fotonů molekulami rozpouštědla a jejich fotoexcitací. Pro dosažení vyšší účinnosti se zavádí  do mobilní fáze společně s analytem tzv. dopant (dopant APPI). Jedná se o látky, které musí  být fotoionizovatelné a schopné ionizovat molekuly analytu. Mezi nejužívanější dopanty patří  toluen (Ei  = 8,83 eV) a aceton (Ei  = 9,70 eV). Pokud je dopant v relativně vysokém poměru  vůči samotnému analytu, narůstá účinnost ionizace 10 až 100 násobně.      + M M+ + DD+   Vznik  kationradikálů  M+•   anebo  protonovaných  molekul  [M+H]+   závisí  na  ionizačních  energiích  a protonových  afinitách  jak  molekul  analytu,  tak  i složek  rozpouštědla.  Kationradikál vzniká přednostně v rozpouštědle s nízkou protonovou afinitou (halogenovaná  rozpouštědla, cyklohexan, …), zatím co rozpouštědla s vyšší protonovou afinitou (metanol,  acetonitril) budou poddajné k protonovému transferu.  Pokud molekula analytu nese elektronegativní funkční skupinu, můžeme měřit spektra APPI  i v negativním módu s kvazimolekulovým iontem [M–H]‾.   APPI je poměrně moderní metoda využívána při ionizaci především nepolárních sloučenin  s molekulovou  hmotností  přibližně  do  2 000  Da,  např.  flavonoidů,  steroidů,  pesticidů  a polyaromatických uhlovodíků.    3.7. Ionizace laserem za účasti matrice (MALDI ‐ Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization) Metoda  ionizace  MALDI  se  ukázala  jako  velmi  účinná  pro  analýzu  některých  velkých  biopolymerů  ‐  zejména  v  kombinaci  s  hmotnostním  analyzátorem  doby  letu  neboli  průletovým  analyzátorem  (TOF  –  Time‐Of‐Flight),  který  má  v  podstatě  teoreticky  neomezený rozsah m/z.  MALDI‐TOF  hmotností spektrometrie je univerzální analytická technika sloužící k detekci a  charakterizaci směsí hlavně velkých organických molekul např. biopolymerů a syntetických  polymerů.  Tato  ionizační  metoda  je  založená  na  laserem  indukované  desorpci  matrice  malých  organických  molekul,  která  způsobí  uvolnění  analytu  tak,  aby  se  velké,  křehké  molekuly analytu dostaly do plynné fáze ve formě iontů, aniž by byly fragmentovány nebo  rozkládány. MALDI je považována za velmi šetrnou měkkou techniku ionizace, která ionizuje  celou  molekulu  analytu.  Klíčovým  v tomto  procesu  ionizace  je  použití  matrice.  Matrice  je  nízkomolekulová  organická  látka,  která  usnadňuje  ionizačný  proces.  Struktury  několika  běžných  příkladů  matric  uvádí  obrázek  18.  Společné  pro  všechny  matrice  je  přítomnost  20    konjugovaného π‐systému (zvýrazněno žlutě), který je schopen absorbovat energii ve formě  UV světla a rozptýlit molekuly analytu do plynné fáze.   OH HO O OH CHCA DHB SA kyselina -kyano- 4-hydroxyskořicová kyselina 3,5-dimethoxy- 4-hydroxyskořicová kyselina 2,5-dihydroxybenzoová HO N O OH HO H3CO OCH3 OH O   Obr. 18. Struktury nejčastěji využívaných matric.   Odsolené roztoky matrice a analytu (nutný přebytek matrice – až 5 000 : 1) se nanesou na  malou  kovovou  destičku  známou  jako  terčová  nebo  spotovací  deska  (terčík).  (Obr.  19)  Terčová  deska  je  obvykle  vyrobena  z  leštěné  nerezové  oceli  a  má  políčka  tzv.  spoty  pro  použití několika různých vzorků.       Obr. 19. Terčová nebo spotovací deska firmy Applied Biosystem.  Analyt  se  nejčastěji  nanáší  pipetou  na  terčovou  desku  rozpuštěný  v rozpouštědle  spolu  s matricí.  (Obr.  20)  V případě  přítomnosti  anorganických  solí  (napr.  z pufrů)  ve  vzorku  je  nutné  vzorek  předem  zbavit  těchto  solí  odsolením.  Existuje  několik  technik  na  odsolení  vzorků.  Rovněž  existuje  několik  způsobů  nanášení  vzorku  a  matrice  na  terčovou  MALDI  desku.  Rozpouštědlo  se  nechá  odpařit  z  roztoku  vzorku  a  matrice  a  zanechá  za  sebou  pevný  kokrystalizovaný vzorek na desce, která bude analyzována. Po vložení do spektrometru se  prostor  kolem  terčové  deska  uvede  do  vakua  a  vzorek  se  zasáhne  pulsním  UV  laserem  obvykle s vlnovou délkou 337 nm (dusíkový laser). Délka pulsu se běžně pohybuje v rozsahu  0,5 – 20 ns. Kromě dusíkového laseru, který je cenově nejpříznivější, se používá také Nd:YAG  laser s vlnovou délkou 355 nm, nebo nejnověji infračervený Er:YAG laser s vlnovou délkou  2,94 μm avšak diskuze o jejich výhodách a aplikacích jsou mimo rozsah tohoto textu. Energie  laseru je absorbována molekulami matrice, kdy proběhne jejich razantní ablace z povrchu  21    vzorku, a tím se molekuly analytu spolu s matricí dostanou do plynné fáze. Během procesu  ablace jsou molekuly analytu ionizovány, obvykle protonovým přenosem z blízkých molekul  matrice. (Obr. 21)  terčová deska odsolená směs analytu a matrice     Obr. 20. Nanášení vzorku analytu a matrice na terčovou desku pro MALDI MS    spektrometr.   Při  MALDI  ionizaci  vznikají  převážně  kvazimolekulové  ionty  [M+H]+ ,  nebo  [M–H]‾,  ionty  [M+2H]2+ , [M+Na]+ , [M+K]+  a jiné. Tyto generované ionty analytu v plynné fázi mohou být  analyzovány nejčastěji průletovým (TOF) analyzátorem.       Obr. 21. Znázornění vlivu laserového záření na vzorek s matricí za účelem ionizace.  Na  rozdíl  od  jiných  forem  ionizace  MALDI  nabízí  řadu  výhod,  jako  například  elektronová  ionizace (EI). Její zavedení spolu s ESI ionizací umožnilo studium molekul, které byly dříve  neanalyzovatelné  v  plynné  fázi,  protože  byli  netěkavé,  polární  nebo  příliš  velké.  Technika  MALDI je považována za metodu měkké ionizace, což znamená, že po ionizaci molekulové  ionty  zůstávají  neporušené.  To  umožňuje  analyzovat  pomoci  hmotnostní  spektrometrie  i  směsi  sloučenin.  Když  jsou  pozorovány  pouze  molekulové  ionty,  hmotnostní  spektrum  22    ukazuje  složení  této  směsi,  přičemž  jednotlivé  složky  jsou  uspořádaných  poměrem  jejich  hmotnosti  k  náboji.  To  by  nebylo možné  nebo  velmi  obtížné  v případě,  že  by  hmotnostní  spektrum obsahovalo fragmentové ionty. Další výhoda MALDI spočívá v možnosti skladování  a  archivace  vzorků.  Tím,  že  na  terčové  desce  se  po  nanesení  vzorku  analytu  s  matricí  a  odpaření  rozpouštědla  vytvoří  vrstvička  pevného  vzorku  a  laserové  světlo  svítí  jenom  na  velmi  malém  procentu  vzorku,  většina  vzorku  zůstává  nedotčena  a  je  možné  ji  skladovat  (např.  pod  inertní  atmosférou,  za  chladu,  …)  a  opětovně  použít  na  měření.  MALDI  nabízí  univerzální molekulární analýzu s rozsáhlými aplikacemi nejenom v chemii a biochemii, ale  také  v biologii,  farmacii,  medicíně,  průmyslu  atd.  Kromě  klasických  stanovení  proteinů,  peptidů,  oligosacharidů,  oligonukleotidů,  metabolitů  nebo  i  menších  molekul  se  dneska  využívají  např.  pro  identifikaci  mikroorganismu  jako  bakterií,  kvasinek a  plísní  izolovaných  z různých biologických materiálů, pro stanovení biomarkerů mnohých onemocnění apod.      23    4. Hmotnostní analyzátory a detektory   K separaci jednotlivých iontů v hmotnostním analyzátoru dochází na základě jejich poměru  hmotnosti k náboji. Teoreticky by signál, který vzniká po dopadu iontů se stejnou efektivní  hmotností  m/z  na  detektor,  měl  mít  velmi  úzký  interval  a  tyto  signály  by  ve  výsledném  spektru vypadaly spíše jako čáry. Ve skutečnosti však má takový signál tvar rozšiřujícího se  píku (většinou Gaussovy křivky) a to z důvodu odlišné rychlosti (případně směru) stejných  iontů  při  průletu  analyzátorem.  Míra  rozlišení  píku  pro  konkrétní  ion  souvisí  s kvalitou  hmotnostního  analyzátoru.  Rozšíření  (šířka)  jednotlivých  píků  charakterizuje  nejdůležitější  vlastnost spektrometru – rozlišovací schopnost. Rozlišovací schopnost (= Resolving Power,  RP) vyjadřuje míru vzájemného odlišení dvou sousedních iontů s rozdílným poměrem m/z.  Kvantitativně to můžeme vyjádřit jako poměr hmotnosti píku m1, který se z 10 % (popřípadě  z 5  %)  překrývá  se  sousedním  píkem  s hmotností  m2,  a  rozdílem  hmotností  těchto  sousedních iontů ∆m respektive m1–m 2. (Obr. 22a) Vztah potom lze zapsat jako:     Jestli‐že  je  tedy  RP  =  1  000,  dokážeme  rozlišit  sousední  ionty  s 10%  překryvem  píků  s hmotností 100 a 100,1. Pro RP = 100 000 by bylo možné takto odlišit ionty s hmotnostmi  100  a  100,001.  Toto  vyjádření  se  dneska  používá  jenom  zřídka  a  výhradě  u  sektorových  přístrojů s magnetickým analyzátorem.     Obr. 22. Rozlišovací schopnost spektrometru vyjádřen způsobem a) nebo b).  24    V  současnosti  užívaný způsob  vyjádření  rozlišovací  schopnosti  spektrometru  je  založen  na  poměru hmotnosti určitého iontu m k šířce píku daného iontu ∆m v určité výšce, nejčastěji  50 % ∆m1/2. (Obr. 22b) Vztah poté vypadá následovně:     Hmotnostní  spektrometry  můžeme  dělit  na  přístroje  s vysokým  a  nízkým  rozlišením.  U  přístrojů  s nízkým  rozlišením  se  RP  pohybuje  v rozmezí  600  –  3 000,  zatímco  u  přístrojů  s vysokým rozlišením od 25 000 až 150 000. To znamená, že dva sousední ionty lze rozlišit  s přesností na 5 až 6 desetinných míst. Tohoto se v praxi využívá jen při molekulách s malou  až  střední  molekulovou  hmotností,  neboť  s narůstající  hodnotou  poměru  m/z  by  musela  narůstat i rozlišovací schopnost. Například, aby bylo možné rozlišit 2 píky iontů s 10%‐ním  překryvem, přičemž jeden z těchto píků leží při m/z = 10 000 a hmotnost druhého píku se liší  o 2 desetinné místa (0,01 hmotnostní jednotky), musela by rozlišovací schopnost přístroje  být  až  1 000 000,  což  je  pro  současné  spektrometry  nereálná  hodnota.  Proto  se  musí  RP  vztahovat k určité hodnotě nebo rozsahu m/z. Podmínkou pro výpočet RP je záznam spektra  v tzv. profilovém (kontinuálním) módu, z kterého je možné změřit šířku píků (více v kapitole  6).   Dalším parametrem určujícím kvalitu hmotnostního analyzátoru je tzv. přesnost (správnost)  určení hodnoty m/z (= Mass Accuracy). Ta slouží k číselnému vyjádření správnosti určení m/z  iontu  přístrojem.  Přesnost  měření  vypovídá  o  chybě,  resp.  rozdílu  mezi  měřenou  (experimentální) a vypočítanou (správnou) hodnotou efektivní hmotnosti.     Je  to  bezrozměrná  veličina  vyjádřená  v  jednotkách  ppm.  Uvádí  se  se  znaménkem,  díky  němuž zjistíme, jedná‐li se o negativní nebo pozitivní odchylku. Jestliže je přesnost měření  vysoká (< 5 ppm), můžeme spolehlivě určit přesné elementární složení, resp. sumární vzorec  analyzované látky.   Vysoká rozlišovací schopnost spektrometru a vysoká přesnost měření nám umožňuje zjistit  hmotnost  molekulového  nebo  fragmentovaného  iontu  a  odlišit  tak  látky  s velmi  blízkou  hmotností,  jako  například  propanal  CH3CH2CHO  (m/z  =  58,04187)  a butan  C4H10  (m/z  =  58,07825).  Hmotnost iontu lze vyjádřit dvěma způsoby. Buď pomocí atomové hmotnostní konstanty  (také označována jako unifikovaná atomová hmotnostní jednotka u nebo dalton Da), ta je  definována jako 1/12 hmotnosti izotopu 12 C, jehož hmotnost se konvenčně rovná 12,000 000  Da.  Hmotnost  iontu  vyjádřená  pomocí  této  jednotky  je  tzv.  relativní  hmotnost.  Druhý,  jednodušší způsob vyjádření hmotnosti iontu nám umožňuje hmotnostní (nukleonové) číslo.  Toto  číslo  udává  součet  protonů  a  neutronů  v daném  iontu,  respektive  v jádře  iontu.  25    Hmotnost  protonů  a  neutronů  se  považuje  za  jednotkovou  a  vypočítat  ji  lze  tak,  že  se  relativní atomová resp. molekulová hmotnost iontu zaokrouhlí na celou jednotku hmotnosti.  Takový  způsob  je  sice  jednodušší,  avšak  poskytuje  jen  malou  rozlišovací  schopnost  a  umožňuje  určit  hmotnost  dvou  rozdílných  iontů  s přesností  na  1  Da  (tedy  rozdíl  jedné  nukleonové částice).  Hmotnostní analyzátor patří mezi základní části hmotnostního spektrometru. Jeho úlohou je  rozdělení  vzniklých  iontů  a fragmentů  na  základě  jejich  rozdílné  hmotnosti.  Typ  hmotnostního analyzátoru určuje kvalitu a cenu hmotnostního spektrometru.     4.1. Magnetický sektorový analyzátor s jednoduchou a dvojitou fokusací iontů Tento analyzátor je jeden z nejstarších disperzních přístrojů umožňující rozdělení iontů na  základě jejich efektivních hmotností m/z. Obsahuje magnet tvořící statické magnetické pole,  skrz které prolétávají kladně nabité ionty, přičemž se separuje celkový iontový paprsek na  samostatné iontové paprsky s individuálním poměrem m/z. (Obr. 23)    Obr. 23. Nákres magnetického sektorového analyzátoru s jednoduchou fokusací iontů  Kladně  nabité  ionty  s hmotností  m  a nábojem  z jsou  urychlovány  záporným  elektrickým  potenciálem  (napětím)  V.  Ionty  následně  vstupují  do  homogenního  magnetického  pole  s indukcí B, kde se jejich dráha zakřivuje a opisují trajektorii o poloměru r.  Urychlením získají ionty potenciální energii EP, rovnající se kinetické energii Ek, takže platí:      26    resp.    Kde v představuje rychlost daného iontu v magnetickém poli po urychlení. Úpravou tohoto  vztahu pro rychlost v potom získáme:    a tedy    Na  každou  nabitou  částici  v magnetickém  poli  působí  dostředivá  síla  FD  způsobená  magnetickou tzv. Lorentzovou silou FL. Tato síla je kolmá na vektor rychlosti a způsobuje, že  daný ion při letu opisuje dráhu kružnice s poloměrem r. Z pohybu iontu po kruhové dráze  vyplývá, že dostředivá síla FD je v rovnováze s odstředivou silou FO.  Tento vztah  zapíšeme  jako:          Po odvození pro m/z:    Jestliže tedy dosadíme za rychlost v výše upravený vztah, získáme rovnici:    Z tohoto vztahu lze vyjádřit základní rovnici pro magnetický analyzátor:    Na jejímž základě můžeme popsat závislost efektivní hmotnosti m/z na experimentálních  parametrech. Hmotnost m se udává v relativních jednotkách, náboj z představuje násobek  náboje jednoho elektronu, respektive počet elementárních nábojů. Poloměr r je neměnný,  z rovnice  tedy  vyplývá,  že  jestliže  chceme,  aby  jednotlivé  ionty  s různými  hodnotami  m/z  postupně  dopadaly  na  detektor,  musíme  měnit  buď  velikost  magnetické  indukce  B  nebo  27    velikost  urychlovacího  napětí  V.  Mluvíme  potom  o  magnetickém  anebo  elektrickém  (napěťovém) skenování, v praxi se můžeme setkat s oběma metodami.   Elektrické  skenování  však  provází  několik  nevýhod.  Velikost  urychlujícího  napětí  ovlivňuje  celkový počet a fokusaci iontů dopadajících do štěrbiny detektoru, proto je změna velikosti  tohoto napětí při skenovacím procesu značně omezená.   Magnetické skenování je výhodnější z hlediska skenování celého hmotnostního rozmezí při  konstantní hodnotě V. Drobnou nevýhodou je pouze kvadratická závislost poměru m/z na  hodnotě B, která způsobuje, že píky iontů s vyšší efektivní hmotností se ve spektru jeví blíže  u sebe než píky nižších hodnot. Tento problém lze vyřešit striktně stabilizovaným napájením  elektromagnetu elektrickým proudem.  Ioty v iontovém zdroji vznikají na různých místech a pohybují se určitou rychlostí ještě před  samotným  urychlením.  Po  urychlení  vstupují  skrz  štěrbinu  do  magnetického  sektoru  s malými  rychlostními  rozdíly  a  s určitou  směrovou  divergencí.  Konkrétní  svazek  iontů  se  stejnou efektivní hmotností m/z se po proletění magnetickým pólem soustředí do jednoho  bodu  tzv.  ohniska,  kde  se  nachází detektor.  Jedná  se  o  směrovou  fokusaci  magnetického  pole. Tyto hmotnostní spektrometry řadíme mezi přístroje s jednoduchou fokusací. (Obr. 24)      Obr. 24. Příklad jednoduché fokusace  Takové přístroje mají jen malou rozlišovací schopnost, zpravidla se RP = 300 – 3000. Nízká  rozlišovací  schopnost  je  způsobené  tím,  že  ionty  po  směrové  fokusaci  mají  stále  různé  hodnoty kinetické energie.   Kinetickou energii tedy rychlost iontů lze sjednotit pomocí elektrostatického analyzátoru.  Tento pomocný disperzní prvek je tvořen dvěma zakřivenými (cylindrickými) elektrodami, ty  jsou  připojeny  na  zdroj  vysokého  napětí.  Ionty  vstupující  do  elektrického  sektoru  mají  kinetickou energii EK = Ep = z . V a tedy opět platí:        28    Odvozením pro rychlost v:    Elektrické  pole  působí  na  každou  nabitou  částici  dostředivou  silou  FD,  ta  je  způsobena  elektrickou silou FE = z . E, kde E je intenzita elektrického pole. I tato síla je kolmá na vektor  rychlosti a zapříčiňuje, že ionty budou opisovat dráhu kružnice s poloměrem r. Velikost této  síly se rovná velikosti odstředivé síly FO. Jestliže se FO = FD, můžeme odvodit následující:         Dosazením rychlosti v a vypočtením rovnice pro poloměr r získáme vztah:     Z této rovnice vyplývá, že poloměr kruhu, který bude částice opisovat při konstantní intenzitě  elektrického pole E, závisí jen na akcelerujícím napětí V a to nezávisle na různých efektivních  hmotnostech m/z. Při stálém poloměru r lze měnit velikost urychlujícího potenciálu V tak,  aby  štěrbinou  proletěly  jen  částice  s požadovanou  rychlostí  (kinetickou  energií),  zatímco  ostatní  částice  narazí  do  stěn  elektrod.  Do  magnetického  sektoru  následně  vstupuje  energeticky  sjednocený  iontový  svazek  a  až  tady  dochází  k rozdělování  iontů  na  základě  poměru m/z.      Obr. 25. Schéma magnetického sektorového analyzátoru s dvojitou fokusací iontů    s uspořádaním (E‐B).  29    Hmotnostní  spektrometry  s elektrostatickým  analyzátorem  umožňující  rychlostní  fokusaci  označujeme jako přístroje s dvojitou fokusací. Uspořádání elektrického sektoru je variabilní.  Můžeme  se  tedy  setkat  s „normálním“  uspořádáním  (E‐B)  nebo  „opačným“  (B‐E),  kde  se  elektrostatický  analyzátor  nachází  až  za  magnetickým.  Pomocný  elektrický  sektor  dokáže  výrazně zvýšit rozlišovací schopnost přístroje k hodnotám RP > 10 000.    4.2. Kvadrupólový analyzátor Kvadrupólový  analyzátor  umožňuje  separaci  iontů  v závislosti  na  hodnotách  m/z  pomocí  elektrického pole bez použití magnetů. Elektrické pole vytváří čtyři pravidelně uspořádané  paralelní válcovité elektrody s délkou přibližně 15 cm. Na jednu dvojici protilehlých elektrod  je aplikované kladné jednosměrné napětí +U a střídavé vysokofrekvenční napětí +VVF, na  druhou dvojici stejně velké, záporné, jednosměrné napětí –U a střídavé vysokofrekvenční  napětí –VVF. Střídavé napětí je definováno průběhem  . . , kde ω je uhlová  frekvence. Toto střídavé napětí je od záporného fázově posunuto o 180° a má řádově 6‐krát  větší amplitudu jako kladné nebo záporné jednosměrné napětí:  | | (napr U = 400 V  a V0 = 2 500 V). Obě napětí se na každé dvojici elektrod skládají (v tomto případě by napětí  oscilovalo  mezi  hodnotami  +2 900  V  až  ‐2 100  V).  Středová  osa,  do  které  vstupují  ionty  z iontového  zdroje  a  směřují  k detektoru,  je  udržována  na  nulovém  potenciálu.  Vysokofrekvenční střídavé napětí VVF bývá také označováno jako radiofrekvenční (VRF), neboť  jeho frekvence se pohybuje řádově v jednotkách megahertz.   Mechanismus tohoto analyzátoru nejlépe vysvětlíme, když rozdělíme elektrody na kladné a  záporné. Pokud by byly dvě protilehlé elektrody (v ose X) připojené pouze na zdroj kladného  jednosměrného napětí, pak by kladné ionty jakékoliv hmotnosti byly odpuzovány od těchto  elektrod a prošly by přímo mezi nimi. Abychom dokázali separovat těžší ionty od lehčích,  potřebujeme  na  elektrody  aplikovat  střídavé  napětí.  To  mění  svoje  znaménko  (polaritu)  v závislosti  na  čase  a  frekvenci  oscilování.  Pokud  je  toto  napětí  kladné,  ionty  budou  stále  odpuzovány. Jakmile ale napětí začne přecházet do záporné půlperiody oscilace a záporná  hodnota tohoto napětí převýší hodnotu jednosměrného napětí, elektrody se stanou dočasně  negativní  (tj.  přepólují  se).  Kladné  ionty  budou  k záporným  elektrodám  přitahovány  a  eventuálně mohou do jedné z nich narazit. Fakt, zda ionty do elektrody narazí, závisí od jejich  hmotností, velikostí nábojů, síly elektrického pole a frekvenci oscilování střídavého napětí.   30      Obr. 26. Schématický diagram kvadrupólového analyzátoru.  Ionty s větší efektivní hmotností m/z mají větší setrvačnost, takže reagují na změnu polarity  jen velmi málo a dokáží stabilním oscilačním pohybem projít až k detektoru (než se jejich  dráha výrazně vychýlí, polarita se znovu změní na kladnou a jsou opět odpuzovány). Lehčí  ionty jsou naopak více ovlivňovány změnami polarity střídavého napětí a opisují nestabilní  oscilační  dráhy.  Mají  menší  setrvačnost,  takže  snáze  změní  směr  k záporné  elektrodě.  Opakovanými změnami polarity napětí narůstá amplituda kmitavého pohybu iontů, dokud  nenarazí  do  jedné  z elektrod.  Skrz  kladné  elektrody  se  k detektoru  dostanou  jen  ionty  s relativní hmotností větší, než je určitá hodnota m/z, proto nazýváme kladné elektrody high  mass filter (filtr těžší hmotnosti). Ionty tímto „filtrem“ buď projdou, nebo narazí do jedné  z elektrod.  Kdyby  byl  druhý  pár  protilehlých  elektrod  (v  ose  Y)  připojený  pouze  na  zdroj  záporného  jednosměrného napětí, pak by byly kladné ionty k těmto elektrodám přitahovány nezávisle  na  jejich  efektivní  hmotnosti.  Aplikováním  střídavého  napětí,  začínajícího  v záporné  půlperiodě oscilace se nic nezmění. Jakmile ale toto napětí přejde do pozitivní půlperiody a  hodnota tohoto napětí převýší hodnotu jednosměrného napětí, stanou se elektrody dočasně  pozitivní. Těžké ionty vzhledem ke své vysoké setrvačnosti, jež byly přitahovány k záporným  elektrodám,  nedokáží  rychle  reagovat  na  změnu  polarity  elektrod  a  opisují  nestabilní  oscilační  dráhy,  až  nakonec  do  jedné  z elektrod  narazí.  Lehčí  ionty  však  dokáží  rychle  reagovat na změny polarity střídavého napětí a opisují stabilní oscilační dráhy, díky nimž se  dostanou až k detektoru. Z tohoto důvodu se záporné elektrody nazývají low mass filter (filtr  malých hmotností). Kladné ionty tímto „filtrem“ projdou jen do určité efektivní hmotnosti  m/z.  Spojením těchto čtyř elektrod získáme dvojitý hmotnostní filtr (double mass filtter). Kladné  ionty se pohybují po stabilních nebo nestabilních prostorových (spirálovitých) drahách. Při  určitém  poměru  obou  aplikovaných  napětí  projde  filtrem  pouze  úzký  pás  iontů  s určitou  hodnotou m/z. Postupnou změnou jednosměrného napětí U a střídavého napětí VRF od nuly  po maximální hodnotu (při zachování konstantního poměru U/VRF) dokážeme proskenovat  celé spektrum efektivních hmotností.    31    Kvadrupólový  analyzátor  pracuje  při  vysoké  rychlosti  a  hmotnostní  spektrum  se  zaznamenává  v průběhu  zlomků  sekundy.  Tato  rychlost  má  velký  význam  při  kombinaci  hmotnostní  spektrometrie  s chromatografickými  metodami,  kde  je  možné  zaznamenat  několik  hmotnostních  spekter  jednoho  chromatografického  píku.  Analyzátor  je  schopný  měřit spektra iontů do efektivní hmotnosti m/z = 4 000, avšak má celkem malou rozlišovací  schopnost.  Výhodami  jsou  nízká  cena,  potřeba  nižšího  vakua  (oproti  sektorovým  analyzátorům)  v rozmezí  10‐3   až  10‐5   Pa  a  možnost  tandemového  uspořádání  MS/MS  (nejčastěji triple quadrupole).    4.3. Iontová past Hmotnostní analyzátory založené na principu iontové pasti fungují na podobném principu  jako  kvadrupólové  hmotnostní  filtry  –  využívají  proměnlivé  elektrické  pole  na  zachycení  kladných  iontů.  Obdobně  také  využívají  střídavé  radiofrekvenční  napětí,  díky  němu  bývají  označovány jako radiofrekvenční pasti nebo Paulovy pasti podle svého vynálezce Wolfganga  Paula, který za vývoj této metody získal v roce 1989 Nobelovu cenu za fyziku.   Radiofrekvenční  pasti  se  skládají  ze  3  elektrod  s hyperbolickým  profilem:  střední  =  prstencové  (kruhové,  ring)  elektrody  a  dvou  protilehlých  vypuklých  (koncových,  endcaps)  elektrod, které tvoří dno a záklop iontové pasti. (Obr. 27) Tyto dvě elektrody obsahují otvory  pro vstup iontů z iontového zdroje a výstup k detektoru. Ionty se po vstupu do pasti pohybují  v prostoru  mezi těmito třemi elektrodami. V tomto prostoru působí  proměnlivé elektrické  pole,  jež  zadržuje  všechny  ionty  různých  hmotností,  přičemž  se  tyto  ionty  pohybují  po  stabilních oscilujících drahách (Lissajousovy křivky). Změnou amplitudy vloženého napětí se  oscilující dráhy stávají nestabilními a ionty se postupně vypuzují z pasti směrem k detektoru  v pořadí narůstajících efektivních hmotností m/z.   Hlavním rozdílem oproti kvadrupólovému filtru je, že ionty dopadající na detektor nemají  stabilní  trajektorii  letu,  nýbrž  nestabilní  dráhu.  Kromě  toho  iontové  pasti  nevyžadují  přítomnost jednosměrného napětí (i když i to se může použít). Vnitřní tlak bývá řádově větší  než u kvadrupólu tj. 1 – 0,1 Pa. Vyšší tlak je způsoben přítomností helia, které stabilizuje  pohyb  iontů  v iontové  pasti  a  tím  i  zvyšuje  rozlišovací  schopnost  samotného  přístroje.  Analyzátory na principu iontové pasti mohou skenovat efektivní hmotnosti iontů do hodnot  m/z  2 000  s rozlišovací  schopností  RP  <  10 000.  Tuto  rozlišovací  schopnost  lze  zvýšit  zmenšením  rychlosti  skenování  –  tedy  rychlostí,  při  níž  budou  jednotlivé  ionty  z pasti  vypuzované.   32        Obr. 27. Schéma iontové pasti.   Iontová past umožňuje spojení s plynovou a vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií jako  i tandemové uspořádání analyzátorů MS – MS, až v několika sériích. Tohoto se využívá při  sledování fragmentačních cest a objasňování složitých struktur organických látek.     4.4. Průletový analyzátor (TOF – Time‐Of‐Flight) Průletový hmotnostní analyzátor neboli analyzátor doby letu využívá k určení hmotnosti čas,  za  který  ionty  přeletí  vzdálenost  od  vstupu  do  analyzátoru  k detektoru.  První  koncepty  metody  TOF  vznikly  už  ve 30.  letech  20.  století  a  v průběhu  dalších  let  vývoj  rychle  postupoval. Koncem šedesátých let však začaly být vytlačovány cenově dostupnějšími a v té  době  také  přesnějšími  kvadrupólovými  filtry.  Opětovný  zájem  o  tento  typ  analyzátoru  podmínil až vývoj ionizační metody MALDI a jejich vzájemné propojení. Průletový analyzátor  může být lineární (Obr. 28) nebo s reflektronem (rTOF). (Obr. 29)      Obr. 28. Schéma lineárního TOF analyzátoru.  33    Lineární průletový analyzátor se skládá z akceleračních elektrod, evakuované letové trubice a  detektoru.  Letová  trubice  měří  obvykle  100  –  200  cm.  Ionty  jsou  urychlovány  pulzně  v periodických  svazcích  elektrickým  potenciálem  V o  velikosti  v  rozsahu  15  –  25  kV  na  stejnou hodnotu kinetické energie EK:     Urychlené ionty vstupují úzkou štěrbinou do letové trubice, kde se pohybují různou rychlostí  v závislosti na efektivních hmotnostech m/z a dopadají v různém čase na detektor. Čas t, za  který ion dopadne na detektor je definovaný vztahem:    kde l je délka letové trubice a v je rychlost iontu. Rychlost v odvodíme jako:    Dosazením  rychlosti  v  do  rovnice  pro  výpočet  kinetické  energie  EK  a  následnou  úpravou  získáme vztah:    Úpravou rovnice pro poměr hmotnosti k náboji m/z dostaneme rovnici:    Z tohoto vztahu vyplývá, že při konstantní délce letové trubice a neměnném urychlovacím  napětí bude čas, za jaký ion dopadne na detektor, závislý od jeho efektivní hmotnosti m/z.  Volně řečeno, čím je ion lehčí, tím kratší bude čas jeho letu trubicí analyzátoru k detektoru.   Lineární  uspořádání  analyzátorů  TOF  je  spojeno  s nižší  rozlišovací  schopností  především  z důvodů  prostorového  rozprostření  a  odlišných  velikostí  kinetických  energií  iontů  před  akcelerací. Rozlišovací schopnost lze zvýšit pomocí tzv. iontového zrcadla, neboli reflektronu  (uspořádání  průletového  analyzátoru  s  reflektronem  –  rTOF).  (Obr.  29)  Iontové  zrcadlo  je  v podstatě elektrické pole, jehož intenzita je větší než intenzita akceleračního pole. Ionty jsou  tímto  polem  postupně  zpomalovány  různě  dlouhou  dobu  v závislosti  na  jejich  počáteční  kinetické energii. Těžší ionty zpomalují déle než lehčí a jsou tedy déle „zadržovány“. Po tom,  co  ionty  dosáhnou  nulové  kinetické  energie,  jsou  z tohoto  elektrického  pole  vypuzovány  směrem k detektoru se stejnou kinetickou energií, s jakou do tohoto pole vešly. Dochází však  k prodloužení  času  letu  iontů.  Touto  časovou  fokusací  se  zmenšuje  rozdíl  počátečních  kinetických  energií  iontů  a  zvyšuje  se  rozlišovací  schopnost  až  několikanásobně  oproti  34    původnímu  lineárnímu  uspořádání.  Použití  reflektronu  dokáže  výrazně  zvýšit  rozlišovací  schopnost  přístroje  až  k  hodnotám  RP  >  15 000.  Dalším  prodloužením  letové  trubice  je  možné ještě více zvýšit rozlišovací schopnost přístroje.   detektor pulzní urychlení iontů vstup iontů letová trubice 15 - 25 kV reflektron (iontové zrcadlo) 23 kVodpuzovací elektroda   Obr. 29. Schéma průletového analyzátoru s reflektronem (rTOF).  Na rozdíl od ostatních typů hmotnostních analyzátorů není metoda TOF omezená maximální  hodnotou efektivní hmotnosti a je prakticky využívaná až do 1 000 000 Da. Této skutečnosti  se  využívá  při  studiu  biopolymerů  s vysokými  molekulovými  hmotnostmi  zejména  v kombinaci s ionizační technikou MALDI nebo ESI.    Principiálně jiným druhem analyzátorů jsou iontová cyklotronová rezonance s Fourierovou  transformací  (FT‐ICR),  elektrostatická  orbitální  past  –  Orbitrap  a  analyzátory  iontové  pohyblivosti. Nicméně diskuze o jejich technických podrobnostech je mimo rozsah tohoto  textu.    4.5. Tandemové uspořádání MS/MS Tandemové  uspořádání  analyzátorů  v  hmotnostní  spektrometrii  se  používá  k detailní  charakterizaci  analytu.  Toto  uspořádání  obsahuje  minimálně  dva  analyzátory  nejčastěji  spojené tzv. kolizní celou. Technika MS/MS (resp. MSn ) zabezpečuje vícestupňovou tvorbu  iontů,  jejich  analýzu  a  fragmentaci.  Největší  význam  má  právě  při  studiu  fragmentů  a  fragmentačních cest. K fragmentaci mezi jednotlivými analyzátory dochází buď samovolným  rozpadem  (vlivem  vnitřní  energie)  nebo  za  pomoci  kolizního  plynu  (např.  vzduchu  nebo  některého ze vzácných plynů).  Tandemové uspořádání MS umožňuje selektivně analyzovat vybraný ion tzv. prekurzorový  (zkoumaný)  ion,  z něhož  vznikají  fragmentové  ionty.  Obvykle  dochází  k výběru  prekurzorového  iontu  v prvním  analyzátoru,  ten  je  podroben  fragmentaci  v kolizní  cele.  Následuje  analýze  fragmentových  tzv.  produktových  iontů  v druhém  analyzátoru.  Ty  jsou  35    zaznamenávány  a  mohou  být  opět  podrobeny  další  fragmentaci.  Tato  metoda  výrazně  ulehčuje  určení  struktury  látky,  díky  čemuž  se  dnes  uplatňuje  ve  strukturní  analýze  sloučenin.  Tandemová  MSn   technika  nejčastěji  využívá  kvadrupólové  filtry  nebo  iontové  pasti  s uspořádáním  za  sebou  (Triple  Q),  analyzátor  s dvojí  fokusací  a  kvadrupólovými  filtry,  kvadrupól  –  TOF,  TOF  –  TOF  atd.  Umožňuje  také  spojení  s plynovou  nebo  kapalinovou  chromatografií,  takže  lze  separovaně  analyzovat  všechny  složky  směsi.  Tandemové  hmotnostní  spektrometry  našly  uplatnění  nejenom  ve  strukturní  analýze,  ale  také  v kvantitativní analýze.      4.6. Detektory. Detektory  jsou  součástí  všech  hmotnostních  spektrometrů  vyjma  iontové  cyklotronové  rezonance s Fourierovou transformací (FTICR) a Orbitrapu, kde je detekce prováděna přímo v  analyzátoru. Iontový tok procházející úzkou výstupní štěrbinou hmotnostního analyzátoru je  velmi malý a proto je potřebné jej zesílit. V detektoru dochází k jeho převedení na elektrický  signál  a  zesílení.  Detektorem  v hmotnostních  spektrometrech  bývá  nejčastěji  elektronový  násobič,  fotonásobič,  nebo  tzv.  Faradayova  klec,  nicméně  diskuze  o  technických  podrobnostech různých metod detekce iontů jsou mimo rozsah tohoto textu.      36    5. Hmotnostní spektrum   Hmotnostní  spektrum  vyjadřuje  poměrové  zastoupení  jednotlivých  iontů  vzniklých  po  ionizaci a případné fragmentaci analyzované látky. Toto spektrum podává důležité informace  o  struktuře  analyzované  látky,  především  vyjadřuje  molekulovou  hmotnost,  z které  je  možné  následně  určit  i  sumární  vzorec  analytu.  V  případě  použití  EI  ionizace  je  možné  vzájemně porovnávat hmotnostní spektra se spektry v standartních databázích, díky čemuž  lze dané látky identifikovat.   Hmotnostní  spektrum  tvoří  souřadnicové  osy  X  a  Y.  Na  vodorovné  ose  X  se  nacházejí  hodnoty  efektivních  hmotností  m/z  a  svislá  osa  Y  reprezentuje  intenzitu  (odezvu)  jednotlivých píků v procentech. Tvar píků připomíná Gaussovu křivku a pokud hmotnostní  spektrum  zůstane  v takovéto  podobě  zachované,  hovoříme  o  profilovém  (kontinuálním)  spektru. Z profilového spektra je možné vyčíst jednotlivé šířky píků. Toto spektrum může být  zjednodušeno do sloupcového grafu, při němž se poloha signálu odečítá z těžiště píku a jeho  intenzita  zodpovídá  výšce  nebo  ploše.  Touto  úpravou  spektra  získáme  tzv.  histogram.  Hmotnostní spektrum se následně normalizuje – absolutní hodnoty intenzit se převedou na  relativní  v rozmezí  0  až  100  %.  Nejintenzivnější  pík  se  nazývá  základní  pík  (base  peak)  a  intenzity ostatních píků jsou vztaženy vůči němu.  Molekulový ion vzniká vyražením jednoho elektronu z molekuly analyzované látky – jedná se  tedy o molekulu s kladným nábojem a nepárovým počtem elektronů, tzv. kationradikál M+• .  Přítomnost  molekulového  iontu  v hmotnostním  spektru  umožňuje  určit  relativní  molekulovou  hmotnost  analyzované  látky.  Přesnost  s jakou  lze  určit  relativní  hmotnost  molekuly, určuje rozlišovací schopnost hmotnostního spektrometru. Dnešní přístroje dokáží  změřit hodnotu hmotnosti s přesností na pět nebo šest desetinných míst. U přístrojů s nižší  rozlišovací  schopností  se  stanovuje  pouze  hmotnostní  (nukleonové)  číslo  molekulového  iontu. Přítomnost a intenzita molekulového píku závisí od struktury analyzované látky a typu  ionizační metody.   Abychom mohli konkrétní ion definovat jako molekulový, musí splnit následující podmínky:   Molekulový  ion  musí  mít  největší  hmotnost  z daného  hmotnostního  spektra.  Přitom  se  přihlíží  na  přítomnost:  izotopových  iontů  [M+1]+• ,  [M+2]+• ,  aduktů  s  protonem  [M+H]+ ,  s  kationy  např.  alkalických  kovů,  stříbra,  amonného  kationtu  [M+Kat]+ ,  s molekulami  rozpouštědla (voda, acetonitril, atd.), ale také na produkty ionto‐molekulových reakcí např.  [M+CH3CO]+ . Kromě aduktů se musí přihlížet také na negativní ionty, např. ion [M‐H]‾. Adukt  [M+H]+  je charakteristický pro větší počet (měkkých) ionizačních technik, často je označován  jako  kvázimolekulový  ion.  Na  obrázku  30  (ESI‐MS)  vidíme  různé  typy  aduktů  a  rozdíly  v efektivních hmotnostech.  37          Obr. 30. Příklady užitečných aduktů pro interpretaci ESI‐MS  Pokud analyzovaná organická látka obsahuje pouze běžné prvky (H, C, O, S, N, halogeny) a  v její struktuře se nenachází dusík, hmotnostní číslo molekulového iontu bude sudé. Stejně  tak bude hmotnost iontu sudá, jestliže se v molekule nachází sudý počet dusíkatých atomů.  Pokud  se  ve  struktuře  nachází  lichý  počet  atomů  dusíku,  bude  i  hmotnostní  číslo  molekulového iontu liché. Tento fakt označujeme jako tzv. dusíkové pravidlo a platí jen pro  molekuly s běžně se vyskytujícími prvky. Pravidlo se nevztahuje na organokovové sloučeniny,  neboť některé kovy mají liché hmotnostní číslo.   Mezi  molekulovým  iontem  a  fragmentovými  ionty  musí  existovat  logická  spojitost.  Fragmentové ionty vznikají po odštěpení radikálů nebo neutrálních molekul např. alkylové  skupiny  [M‐15]+ ,  vody  [M‐18]+• ,  karbonylu  [M‐28]+•   a podobných.  Přičemž  vylučujeme  nepravděpodobné  fragmenty  s rozdílem  hmotnosti  od  potenciálního  molekulového  iontu  v intervalu 4 – 14, 21 – 25 anebo hodnoty 37, 38 apod. Jestliže tato podmínka není splněna,  uvažovaný  pík  nereprezentuje  molekulový  ion.  V takovém  případě  se  s  největší  pravděpodobností jedná o hmotnostní spektrum dvou nebo více látek.  Mezi intenzitou molekulového píku a strukturou analyzované látky existuje přímý vztah. Platí  tedy, že s rostoucím počtem cyklů a nenasycených dvojných vazeb intenzita molekulového  píku  roste.  Při  elektronové  ionizaci  klesá  intenzita  molekulového  píku  v pořadí:  aromát  a  nenasycený  heterocyklus  >  konjugované  olefiny  >  cykloalkany  >  thioly  >  sulfidy  >  nerozvětvené  uhlovodíky  >  ketony  >  aminy  >  estery  >  ethery  >  karboxylové  sloučeniny  >  rozvětvené  uhlovodíky  >  alkoholy.  Intenzita  molekulového  píku  s větvením  řetězce  v dané  homologické řadě klesá.     5.1. Izotopové ionty v hmotnostní spektrometrii Konstantní  zastoupení  stabilních  izotopů  v přírodě  se  odráží  i  na  hmotnostním  spektru  analyzované látky. Jednotlivé prvky obsahující jeden nebo více těžších izotopů provázejí ve  spektru  molekulový  ion  i  ionty  jeho  fragmentů.  Doprovodné  píky  izotopových  iontů  odvozené  od  molekulového  iontu  se  označují  [M+1]+. ,  [M+2]+. (popřípadě  vyššími  čísly).  Přehled  relativního  zastoupení  stabilních  izotopů  běžných  elementů  uvádí  tabulka  č.  4.  38    Relativní intenzita těchto píků a jejich zastoupení závisí od sumárního (molekulového) vzorce  analyzované látky. S větší molekulovou hmotností (resp. s větším počtem atomů v molekule)  narůstá intenzita, ale i počet píků izotopových iontů.  Tabulka č. 4. Relativní zastoupení stabilních izotopů běžných elementů.   Element  M  M+1  M+2  M+4    izotop  %  izotop  %  izotop  %  izotop  %  vodík  1 H  99,985  2 H  0,015  ‐  ‐  ‐  ‐  uhlík  12 C  98,892  13 C  1,108  ‐  ‐  ‐  ‐  dusík  14 N  99,635  15 N  0,365  ‐  ‐  ‐  ‐  kyslík  16 O  99,759  17 O  0,037  18 O  0,204  ‐  ‐  fluor  19 F  100,00  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  křemík  28 Si  92,18  29 Si  4,71  30 Si  3,12  ‐  ‐  fosfor  31 P  100,00  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  síra  32 S  95,018  33 S  0,750  34 S  4,215  36 S  0,107  chlor  35 Cl  75,40  ‐  ‐  37 Cl  24,60  ‐  ‐  brom  79 Br  50,57  81 Br  49,43  ‐  ‐  ‐  ‐  jod  127 I  100,00  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐  ‐    Jako  vzorový  příklad  můžeme  uvést  izotopy  uhlíku  12 C  a  13 C  s poměrovým  zastoupením  v přírodě 98,9 % : 1,1 %. (Obr. 31) V případě molekuly obsahující 10 atomů uhlíku je relativní  intenzita  píku  pro  molekulový  ion  M  normalizovaná  na 100  %.  Intenzita  píku  pro  M+1  je  přibližně 10‐ti násobná, můžeme vidět i pík iontu M+2 odpovídající přítomnosti 2 atomů 13 C  v této  molekule.  Ve  sloučenině,  která  by  obsahovala  60  uhlíkových  atomů,  je  opět  normalizovaná intenzita píku M na 100 %. Intenzita píku M+1 je však téměř 60‐ti násobná  s intenzitou 65 %. Mimo to můžeme vidět rostoucí intenzitu píku iontu M+2. Ve spektru však  můžeme  pozorovat  i  další  izotopové  ionty  s nárůstem  molekulové  hmotnosti  o  3,  4  a  5  Daltonů. Tento jev lze vysvětlit rostoucí pravděpodobností, s jakou se může nacházet izotop  13 C v molekule. Analogicky je možné sledovat nárůst intenzity (resp. také počtu) izotopových  píků i u látek obsahujících 100 či více uhlíků.      Obr. 31. Poměrné zastoupení izotopů uhlíka.  39    Podobně tomu je i u chlorovaných uhlovodíků. Poměr přirozených stabilních izotopů 35 Cl a  37 Cl je 75,4 % : 24,6 %. V hmotnostním spektru bychom měli vidět normalizovaný pík pro  molekulový ion s 100 % a pík izotopového iontu M+2. Pokud by se v uhlovodíku nacházely 2  nebo více atomů chlóru pravděpodobnost, že jeden z těchto atomů bude izotop, narůstá a  ve spektru bychom pak našli izotopové ionty s hodnotami M+2, M+4 atd. Intenzita by rostla  úměrně k počtu chlorovaných atomů. Tuto skutečnost lze pozorovat i u ostatních uvedených  příkladů bromu a síry (respektive u každého prvku, který není monoizotopický). Obr. 32.  x x+2 x+4 x+6 x+8 100 32,6 Cl x x+2 x+4 x+6 x+8 100 65,3 Cl2 10,6 x x+2 x+4 x+6 x+8 100 98,1 Cl3 31,9 3,5 x x+2 x+4 x+6 x+8 100 97,7 Br x x+2 x+4 x+6 x+8 51,2 100 Br2 48,9 x x+2 x+4 x+6 x+8 34,1 100 Br3 97,8 31,9 35 Cl : 37 Cl 75,4 % : 24,6 % 79 Br : 81 Br 50,57 % : 49,43 % x x+2 x+4 x+6 x+8 100 4,4 S x x+2 x+4 x+6 x+8 100 8,9 S2 x x+2 x+4 x+6 x+8 76,7 100 BrCl 24,5 32 S : 34 S 95,02 % : 4,22 %     Obr. 32. Intenzity píku u některých izotopových klastrů obsahujících Cl, Br a S.  40    Poměr  intenzit  píků  jednotlivých  iontových  izotopů  lze  zjistit  pomocí  koeficientu  binomického  rozvoje  (a+b)n ,  kde  a  a  b  představují  relativní  zastoupení  těžšího  a  lehčího  izotopu  a  exponenciál  n  je  počet  pojednávaných  atomů  v molekule.  Např.  u molekuly  obsahující 2 atomy síry s relativním poměrem stabilních izotopů 32 S a 34 S 95,02 % : 4,22 %  zapíšeme vztah:  (a + b)2  = a2  + 2ab + b2   (95,02 + 4,22)2  = 9028,8 + 801,97 + 17,81  Poměr vyjádříme jako:  9028,8 : 801,97 : 17,81  M : M+2 : M+4  A intenzitu píků dopočítáme:  hodnotě 9028,8 odpovídá 100 %   potom 801,97 odpovídá 8,9 %  a 17,81 potom 0,2 %.  Intenzita píku s m/z M+4 je vůči základnímu píku příliš malá (0,2 %) a v hmotnostním spektru  se neobjeví. (Obr. 32)  Výpočet  sumárního  (molekulového)  vzorce  patří  k důležitým  atributům,  které  z hmotnostního  spektra  můžeme  získat.  U  přístrojů  s nízkou  rozlišovací  schopností  lze  sumární  vzorec  vypočítat  vyhodnocením  poměru  intenzit  píků  izotopových  iontů  vůči intenzitě  píku  molekulového  iontu.  Takové  vyhodnocení  je  poměrně  komplikované,  a  jelikož  dnes  již  všechnu  výpočetní  činnost  vykonávají  počítače,  nebudeme  se  této  problematice blíže věnovat. U přístroje s nižším rozlišením je možné určit počet atomů uhlíku  s přesností ± 1.  Přibližný počet atomů uhlíku ve sloučenině lze získat ze vztahu:    Přesné  elementární  složení  a  eventuálně  i  molekulový  vzorec  lze  určit  pomocí  přístrojů  s vysokou rozlišovací schopností (RP = 10 000 – 25 000) a přesností měření m/z < 3 ppm na  základě molekulové hmotnosti a zastoupení izotopů. Díky přesné číselné hodnotě hmotnosti  molekulového iontu je možné určit kombinaci a počet atomů a tím i sumární vzorec. Čím  přesnější je měření, tím lehčí a jednodušší bude určení sumárního vzorce. Podobně můžeme  určit sumární vzorec a elementární složení i u všech fragmentů, čehož se prakticky využívá  při studiu fragmentových cest a celkové struktuře analyzované látky.    41    5.2.Základní pravidla fragmentací při ionizaci EI Fragmentace je proces, při kterém vznikají jednodušší štěpené částice tzv. fragmenty, díky  přetržení chemických vazeb v molekulovém iontu, důsledkem čehož vzniká sekundární ion  (výjimečně další kationradikál) a k němu komplementární radikál nebo neutrální molekula.  Fragmentace je závislá od energie, kterou měla molekula před ionizací, způsobu ionizace,  množství dodané energie ionizačním procesem a tlaku, při němž dochází k ionizaci. Všechny  tyto podmínky ovlivňují množství přebytečné energie získané molekulou, tato energie pak  určuje,  do  jaké  míry  bude  k fragmentaci  docházet.  V následující  části  se  budeme  věnovat  fragmentaci při elektronové ionizaci (EI).   Aby byl ion detekovatelný a viditelný v hmotnostním spektru, musí mít dostatečně dlouhou  životnost. Ion s délkou životnosti delší než 10‐4  s označujeme jako stabilní. Opakem jsou ionty  nestabilní  –  s délkou  životnosti  kratší  než  10‐6  s.  Takové  ionty  vznikají  a  zanikají  ještě  v ionizačním  zdroji  a  v hmotnostním  spektru  se  neprojeví.  Ionty  s délkou  života  v rozmezí   10‐4  až 10‐6  se rozpadají buď v ionizační komoře, nebo přímo v hmotnostním analyzátoru a  označují se jako metastabilní ionty. V případě, že se takový ion rozpadne v prostoru mezi  ionizační komorou a magnetickým (resp. elektrickým) polem v tzv. oblasti bez pole (field free  region),  proletí  část  svojí  dráhy  jako  ion  s původní  hmotností  m1 +   a  druhou  část  jako  fragmentovaný  ion  s menší  hmotností  m2 + .  Nově  vzniklý  fragment  m2 +   si  rozdělí  původní  kinetickou energii s odštěpenou částicí m3. V hmotnostním spektru se tento metastabilní ion  projeví  zdánlivou  (neskutečnou)  hmotností  s difuzním  (roztáhnutým)  píkem.  Metastabilní  ionty označujeme symbolem m*. Hmotnost takovéhoto iontu charakterizuje vztah:    Metastabilní  ionty  se  často  vyskytují  při  aromatických  sloučeninách  a  poskytují  důležité  informace ke studiu fragmentačních cest analyzované látky. Jsou relativně častými jevy při  elektronové ionizaci a často se tvoří v procesech MALDI. Bez ohledu na to, jak jsou tyto ionty  tvořeny,  jejich  fragmentační  rozklad  po  opuštění  iontového  zdroje  je  procesem  unimolekulárního  rozkladu.  Fragmentace  metastabilních  iontů  je  v  současné  době  pozorována  jenom  ve spojení  s  magnetickými  sektorovými  analyzátory  nebo  v  driftové  trubici nástrojů MALDI‐TOF, které jsou široce používány k určení sekvencí peptidů.  Intenzita každého píku v hmotnostním spektru narůstá jednoduchostí vzniku daného iontu a  klesá s jeho snižující se stabilitou. Pro molekulový ion platí, že čím je nižší ionizační potenciál  některého  z elektronů  v molekule  (čím  je  hodnota  dodané  energie  nižší),  tím  snáze  dojde  k jeho  vzniku.  Ionizační  potenciál  elektronů  roste  v pořadí:  Nevazebné  elektrony  heteroatomů  <  konjugované    π  elektrony  <  nekonjugované  π  elektrony  <  σ  elektrony  jednoduchých vazeb C–C < σ elektrony vazeb C–H. Nejpravděpodobněji tedy vzniká kladný  náboj  na  heterocyklu  nebo  v místě  násobné  vazby  s  heteroatomem.  Intenzita  píku  molekulového  iontu  narůstá  s  jeho  stabilitou.  Stabilita  cyklických  sloučenin  je  větší  než  u  42    acyklických  a  výrazně  narůstá  delokalizací  kladného  náboje  (konjugace  π  elektronů)  v molekule. Důkazem zvýšené stability způsobené rezonancí mohou být píky aromatických  iontů s nábojem z = 2, které v hmotnostním spektru poskytují necelé hodnoty m/z v případě  liché hodnoty m.   Jednoduché alkany jsou naopak silně náchylné k fragmentaci, neboť nejčastějším způsobem  ionizace je uvolnění σ elektronu z kovalentní vazby C–C. Sigma vazba s jedním elektronem je  vysoce nestabilní a podléhá štěpení. Na obrázku 33 můžeme ilustrovat vzorový příklad.        Obr. 33. Hmotnostní spektrum 2‐methylbutanu s EI.   Při  EI  ionizaci  může  dojít  v molekule  2‐metylbutanu  k uvolnění  elektronu  na  kterémkoliv  atomu  uhlíku  za  vzniku  molekulového  iontu  M+• .  Vzhledem  k množství  dodané  energie  ionizujících elektronů (70 eV) a přítomnosti pouze jednoduchých σ vazeb dochází k efektivní  fragmentaci za vzniku několika fragmentovaných částic. Důkazem nestability molekulového  iontu je také jeho pík s nízkou intenzitou, který v hmotnostním spektru vidíme u hodnoty  m/z 72. (Obr. 33) Odštěpením metylového radikálu může vzniknout sekundární n‐butylový  kation nebo primární isobutylový kation se stejnou efektivní hmotností m/z 57. (Schéma 1)       Schéma 1. Schéma EI ionizace a fragmentace 2‐methylbutanu.   Protože víme, že sekundární kation je stabilnější než primární, bude pravděpodobnější vznik píku sekundárního butylového kationtu.  Základní  pík  s relativní  intenzitou  100 %  patří  iontu  43    s hodnotou  m/z  43.  Jedná  se  o  nejvíce  zastoupený  a  tedy  nejstabilnější  štěpný  ion,  který  vzniká  eliminací  etylového  radikálu.  Fragmentový  pík  s hodnotou  m/z  42  může  vzniknout  ztrátou  vodíkového  radikálu  z iontu  s m/z  43.  Ztrátou  dalšího  vodíkového  radikálu  vzniká  relativně  stabilní  allylový  kation  s m/z  41.  (Schéma  2)  Důkazem  etylového  kationtu  je  pík  s hodnotou m/z 29 a málo výrazný pík s m/z 15 je zase důkazem methylového kationtu.       Schéma 2. Ztráta vodíkového radikálu iontu m/z 43.  Fragmentační  procesy  neprobíhají  podobným  způsobem  jako  běžné  reakce  v organické  chemii.  Nejčastěji  dochází  k odtržení  neutrálního  fragmentu  –  radikálu  nebo  jednoduché  molekuly.  Častým  jevem  jsou  tzv.  přesmyky.  Mechanismy  fragmentace  můžeme  rozdělit  podle způsobu jejich iniciace buď radikálovým centrem (nespárovaným elektronem) nebo  nábojovým  centrem.  Přenos  elektronů  ve  schématech  se  značí  podobně  jako  v organické  chemii: jednoelektronový proces jednoduchou šipkou a přenos celého elektronového páru  dvojitou šipkou.  Štěpení σ vazby  Štěpení jednoduchých vazeb je typické především u alkanů, méně časté pak u nasycených  sloučenin s heteroatomy ve své struktuře. K samotnému štěpení dochází v důsledku vysoké  nestability  chemické  vazby  tvořené  jedním  elektronem.  Mechanizmus  je  iniciovaný  radikálovým centrem, při němž vzniká kation a neutrální radikál.   α‐Štěpení  K α‐štěpení dochází nejčastěji při odštěpení nevazebného elektronu z heteroatomu. Jedná se  o mechanizmus iniciovaný radikálovým centrem. Heteroatom s lichým počtem elektronů se  snaží  o  tvorbu  nové  (násobné)  vazby  pomocí  nespárovaného  elektronu.  Vazba  mezi  α‐β  uhlíkem  se  homologicky  štěpí  za  vzniku  neutrálních  radikálů  R•   a  kationtu  H2C=X+ ,  resp.   + CH2‐X.  (Schéma  3)  α‐Štěpení  je  typické  pro  aminy,  thioly,  alkoholy,  ketony  případně  halogenidy.      Schéma 3. Příklad α–štěpení.  Benzylové štěpení za tvorby tropyliového iontu  Substituované  alkylbenzeny  poskytují  intenzivní  pík  s  m/z  91  odpovídající  sedmičlennému  rezonančně stabilizovanému tropyliovému kationtu. (Schéma 4) Pík tropyliového kationtu je  typický  pro  všechny  sloučeniny  obsahující  benzyl  a  jeho  intenzita  klesá  s rostoucí  délkou  44    alkylového řetězce. Ke štěpení dochází mezi α‐β uhlíkem od benzenového jádra a následným  přesmykem  vzniká  stabilizovaný  kruh.  Tropyliový  kation  bývá  častokrát  doprovázen  pentadienyliovým  kationtem  s m/z  65  vzniklým po  odštěpení  acetylenu  z původního  kationtu.      Schéma 4. Benzylové štěpení a vznik tropylioveho iontu.  Mc Laffertyho přesmyk  McLaffertyho přesmyk patří mezi nejznámější příklad přesmyku v hmotnostní spektrometrii  iniciovaný  radikálovým  centrem.  (Schémata  5  a  6)  Při  tomto  přesmyku  dochází  k přenosu  vodíku z γ uhlíku (C4) na heteroatom (resp. i uhlík) přes nenasycený šestičlánkový tranzitní  stav, přičemž vzniká neutrální molekula a kationradikál. Reakce se hodně vyskytuje u alkenů,  iminů  a  především  u  karbonylových  sloučenin.  Po  vzniku  kationradikálu  dochází  k tautomernímu  přesmyku  vodíku  z γ  uhlíku  na  heteroatom  a  k  přeskupení  vazeb,  přitom  kladný  náboj  z heteroatomu  může  migrovat  nebo  zůstat  na  něm.  Pohyb  náboje  závisí  od  typu heteroatomu a navázaných substituentů v molekule. Výsledkem přesmyku je v případě  nepohyblivého náboje kationradikál a odštěpená nenasycená neutrální molekula, v případě  migrujícího náboje α,β nenasycená sloučenina obsahující heteroatom jako kationradikál.            Schéma  5.  a)  Příklad  McLaffertyho  přesmyku  ketonů;  b)  všeobecná  schéma    McLaffertyho přesmyku.  Kromě získaných znalostí o molekulové hmotnosti a hmotnosti fragmentů v případě použití  hmotnostní  spektrometrie  s  ionizací  EI  můžeme  naměřená  spektra  látek  softwarově  porovnat  s knihovnami  naměřených  spekter  (NIST  –  National  Intitute  of  Standards  and  Technology, Mass Spectral Library; Wiley Registry of Mass Spectral Data). To může výrazně  pomoci při interpretaci spekter a určení struktury analytu. V dnešní době databáze obsahují  stovky tisíc spekter i s fragmentacemi. Spektra naměřená s ionizací EI (70 eV) jsou víceméně  45    nezávislá na experimentálních podmínkách měření. Na obrázku 34 je uveden příklad náhledu  do této databáze.       Obr. 34. Náhled do databáze MS spekter NIST  Na rozdíl od EI MS spekter knihovny spekter měkkých ionizačních technik jsou méně rozsáhlé  a nejsou univerzálně použitelné. Vzhled MS spektra velmi silně závisí na experimentálních  podmínkách měření (typ a energie ionizace, uspořádání iontového zdroje, typ a konstrukce  analyzátoru, složení analyzované směsi – tvorba aduktů, apod.). U měkkých technik většinou  nejsou  přítomny  fragmentové  ionty.  Na  rozdíl  od  EI  MS  spekter,  kde  fragmentové  ionty  výrazně přispívají k určení struktury analytu, u měkkých ionizačních technik MSn  spektra také  silně  závisí  na  experimentálních  podmínkách  a  typu  přístroje.  Proto  interpretace  těchto  spekter si vyžaduje individuální přístup operátora přístroje. Výjimkou jsou databáze molekul  z určitých  specifických  oblastí  (analýza  proteinů  a  peptidů,  oligosacharidů,  apod.),  kde  je  přístrojové porovnávání s existujícími knihovnami často používané.             46    6. Spojení hmotnostní spektrometrie a separačních technik Hlavní výhodou spojení hmotnostní spektrometrie a separačních technik je, že v rámci jedné  analýzy  můžeme  směs  látek  zároveň  separovat  separační  technikou  vhodnou  pro  danou  směs (GC, LC, CE atd.) a posléze identifikovat jednotlivé složky neznámé směsi.   GC/MS byla první chromatografickou metodou spojenou s MS. Malý průtok nosného plynu  v GC  zabezpečoval  spolehlivé  fungování  iontového  zdroje  v MS.  Nejčastěji  se  využívalo  elektronové  a  chemické  ionizace,  analyzátorem  byl  Q  nebo  IT,  dnes  i  TOF.  Pro  analýzu  GC/MS  se  hodí  zejména  látky  termicky  stabilní,  těkavé,  méně  polární  a  s nízkou  molekulovou  hmotností.  V některých  případech  lze  převést  netěkavou  látku  na  těkavou  derivatizací  (např.  menší  karboxylové  kyseliny  převést  na  estery).  Jedná  se  o  široce  využívanou  techniku  vhodnou  pro  analýzu  složitých  směsí  (těkavé  přírodní  látky,  těkavé  polutanty, forenzní analýza, ...).  LC/MS  je  schopna  podat  informace  o  struktuře  látek,  jež  jsou  polárnější,  termicky  méně  stabilní a mají vyšší molekulovou hmotnost než je tomu u GC/MS. K ionizaci se využívají  šetrnější metody jako ESI nebo APCI, případně APPI při nepolárních a labilních sloučeninách.  Jako hmotnostní analyzátory jsou u LC/MS běžně využívané kvadrupólové filtry, iontové pasti  a  TOF.  Je  možné  i  tandemové  uspořádání  (např.  Q‐TOF).  Nevýhodou  spojení  kapalinové  chromatografie s hmotnostní spektrometrií oproti GC/MS je vysoký rozdíl tlaků na rozhraní  s hmotnostním analyzátorem. Spojení LC a MS umožňuje identifikaci i stopových množství  látek  ve složitých  směsích  s využitím  v téměř  všech  oblastech  vědy,  výzkumu,  průmyslu,  zdravotnictví, státní správy apod.   CE/MS  neboli  spojení  kapilární  elektroforézy  s hmotnostní  spektrometrií  může  být  alternativou k HPLC, umožňuje totiž separaci iontových látek. Není však tak běžná jako LC  nebo GC/MS.   SFC/MS  využívá  superkritickou  fluidní  chromatografii  ve  spojení  s MS.  Tato  metoda  je  vhodná pro polární i nepolární látky rozpustné v rozpouštědlech pro SFC (např. CO2). SFC/MS  je v dnešní době stále poměrně málo využívanou metodou.       47    7. Obrazová příloha – příklady hmotnostních spekter Obrazová  příloha  obsahuje  příklady  hmotnostních  spekter  naměřených  na  přístrojích  využívajících ionizační techniky EI, ESI a MALDI.  Příklad 1.  Hmotnostní spektrum acetaldehydu s monoizotopickou hmotností 44,03.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)    Příklad 2.  Hmotnostní spektrum ethanolu s monoizotopickou hmotností 46,04.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)    10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance Scan 894 (6.364 min): PROJEKT_101.D\ data.ms (-864) (-) 44.029.1 207.078.060.0 96.0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance #70: Acetaldehyde 29.0 44.0 14.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 2000 4000 6000 8000 m/ z--> Abundance Scan 1216 (8.622 min): PROJEKT_101.D\ data.ms(-1190) (-) 31.1 207.0 281.0132.996.0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 2000 4000 6000 8000 m/ z--> Abundance #95: Ethyl alcohol 31.0 2.0 CH3CH2OH Chemical Formula: C2H6O Exact Mass: 46,04 Molecular Weight: 46,07 48    Příklad 3.  Hmotnostní spektrum acetonu s monoizotopickou hmotností 58,04.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)    Příklad 4.  Hmotnostní spektrum propan‐2‐olu s monoizotopickou hmotností 60,06.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)        20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 2000 4000 6000 8000 m/ z--> Abundance Scan 1343 (9.512 min): PROJEKT_101.D\ data.ms(-1327) (-) 43.1 207.096.0 281.0132.9 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 2000 4000 6000 8000 m/ z--> Abundance #210: Acetone 43.0 15.0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 2000 4000 6000 8000 m/z--> Abundance Scan 1382 (9.786 min): PROJEKT_101.D\data.ms(-1373) (-) 45.0 207.096.0 281.0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 2000 4000 6000 8000 m/z--> Abundance #288: Isopropyl Alcohol 45.0 19.0 49    Příklad 5.  Hmotnostní spektrum 2‐methylfuranu s monoizotopickou hmotností 82,04.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)    Příklad 6.  Hmotnostní spektrum pent‐3‐en‐2‐onu  s monoizotopickou hmotností 84,06.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)        20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 2000 4000 6000 8000 m/ z--> Abundance Scan 1713 (12.107 min): PROJEKT_101.D\ data.ms(-1700) (-) 82.1 53.1 207.0 281.0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 2000 4000 6000 8000 m/ z--> Abundance #1144: Furan, 2-methyl- 82.0 53.0 27.0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance Scan 2363 (16.665 min): PROJEKT_101.D\ data.ms 69.1 41.1 281.0207.096.0 253.0133.0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance #1386: 3-Penten-2-one, (E)- 69.0 41.0 22.0 50    Příklad 7.  Hmotnostní spektrum toluenu s monoizotopickou hmotností 92,06.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)    Příklad 8.  Hmotnostní spektrum 4‐methylpent‐3‐en‐2‐onu  s monoizotopickou hmotností 98,07.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)        20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance Scan 2379 (16.777 min): PROJEKT_101.D\ data.ms(-2415) (-) 91.1 43.0 65.0 208.0 269.0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance #2395: Toluene 91.0 65.039.0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance Scan 2528 (17.822 min): PROJEKT_101.D\ data.ms(-2498) (-) 83.1 55.1 29.1 132.9 269.0208.0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance #3178: 3-Penten-2-one, 4-methyl- 83.055.0 29.0 CH3 Chemical Formula: C7H8 Exact Mass: 92,06 Molecular Weight: 92,14 O H3C Chemical Formula: C6H10O Exact Mass: 98,07 Molecular Weight: 98,14 51    Příklad 9.  Hmotnostní spektrum benzaldehydu s monoizotopickou hmotností 106,04.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)    Příklad 10.  Hmotnostní spektrum chloroformu s monoizotopickou hmotností 117,91.   Přístroj: GC‐MS HP 7890 A s 5975C Series GC/MSD (Q, Agilent)  Ionizační technika: EI  EI MS a porovnání s knihovnou spekter (obrázek dolu)        20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance Scan 3092 (21.777 min): PROJEKT_101.D\ data.ms (-3103) (-) 106.0 77.1 51.0 176.9 253.0 281.1209.0 343.0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/ z--> Abundance #4934: Benzaldehyde 77.0 105.0 51.0 27.0 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/z--> Abundance Scan 473 (2.906 min): PROJEKT_080.D\data.ms (-464) (-) 82.8 46.9 32.0 70.0 119.891.260.2 130.7 148.2106.8 139.6 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 m/z--> Abundance #8888: Trichloromethane 83.0 47.0 35.0 118.070.058.0 52    Příklad 11.  Hmotnostní spektrum 4‐methoxybenzofenonu s monoizotopickou hmotností 212,08.   Přístroj: Trace GC ULTRA – ITQ 1100 GC/MS (ITQ, Thermo Scientific)  Ionizační technika: EI  GC chromatogram    EI MS        RT: 0.00 - 18.02 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 RelativeAbundance 14.45 17.91 17.57 17.26 16.72 16.48 16.01 14.3911.70 13.8711.8311.5810.4810.158.978.457.957.386.876.385.785.184.32 14.45 14.71 17.9617.2915.3514.3313.5213.0012.2111.4210.7510.119.198.548.227.666.964.04 6.504.52 5.92 NL: 2.02E7 TIC MS IVA1-a NL: 6.64E6 m/z= 134.50- 135.50 MS IVA1-a IVA1-a #852 RT: 11.59 AV: 1 SB: 238 10.57-12.66 NL: 7.19E4 T: + c Full ms [40.00-550.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 RelativeAbundance 135.04 211.97 77.09 107.12 181.07 51.09 92.14 115.11 141.15 377.01197.11 267.95 315.00254.05 469.91451.98342.97298.16 390.92 504.79 540.87 Náhled do databáze NIST  53    Příklad 12.  Hmotnostní spektrum cyklohexanon‐oximu s monoizotopickou hmotností 113,08.   Přístroj: Trace GC ULTRA – ITQ 1100 GC/MS (ITQ, Thermo Scientific)  Ionizační technika: EI  GC chromatogram    EI MS        RT: 0.00 - 18.04 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 RelativeAbundance 18.00 17.78 17.64 17.46 17.30 17.04 16.70 16.57 8.10 16.31 15.93 15.52 14.96 14.43 11.69 12.0011.5510.48 9.667.967.716.635.964.28 8.10 17.4516.987.89 8.41 8.73 16.3315.129.93 10.57 11.69 13.9912.467.595.725.154.63 NL: 6.58E6 TIC MS IVA10-a NL: 5.98E5 m/z= 54.50-55.50+ 58.50-59.50+ 71.50-72.50+ 112.50-113.50 MS IVA10-a IVA10-a #453 RT: 8.10 AV: 1 SB: 34 7.97-8.25 NL: 2.68E5 T: + c Full ms [40.00-550.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 RelativeAbundance 112.98 98.08 72.13 41.15 79.12 54.15 428.89252.94 284.91 383.81147.03 342.89224.90 299.88210.05 456.75 522.91507.00181.02 Náhled do databáze NIST  54    Příklad 13.  Hmotnostní spektrum benzilu s monoizotopickou hmotností 210,07.   Přístroj: Trace GC ULTRA – ITQ 1100 GC/MS (ITQ, Thermo Scientific)  Ionizační technika: EI  GC chromatogram     EI MS        RT: 0.00-18.03 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 Time(min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 RelativeAbundance 13.81 17.97 17.53 17.02 16.47 15.65 11.69 12.3511.0810.419.868.728.117.426.686.004.29 5.04 13.81 14.30 17.9617.2015.1311.8011.23 12.2610.559.694.06 4.40 8.918.205.11 6.20 7.17 NL:2.34E7 TIC MSIVA11-a NL:2.05E7 m/z= 49.50-50.50+ 50.50-51.50+ 76.50-77.50+ 104.50-105.50+ 105.50-106.50 MS IVA11-a IVA11-a#1106 RT: 13.81 AV: 1 SB: 15 13.76-13.87 NL: 9.43E6 T: +cFullms[40.00-550.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 RelativeAbundance 105.01 77.19 51.22 209.95 78.2274.20 152.10 194.07 281.00127.05 252.98 326.98 345.81 382.89 430.79216.05 492.88447.76 537.96 Náhled do databáze NIST  55    Příklad 14.  Hmotnostní spektrum aduktu anthracenu a maleinanhydridu s monoizotopickou hmotností  276,08.   Přístroj: Trace GC ULTRA – ITQ 1100 GC/MS (ITQ, Thermo Scientific)  Ionizační technika: EI  GC chromatogram     EI MS        RT: 0.00-18.04 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time(min) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 RelativeAbundance 16.32 18.02 17.73 17.55 16.24 15.94 15.64 15.22 14.5211.7010.48 8.968.838.146.705.10 16.32 16.17 15.71 16.4814.9513.9312.0111.508.96 10.388.317.214.96 6.43 NL:7.28E6 TIC MSIVA14-a NL:3.14E6 m/z= 88.50-89.50+ 100.50-101.50+ 177.50-178.50+ 178.50-179.50+ 275.50-276.50 MS IVA14-a IVA14-a#1396 RT: 16.32 AV: 1 NL: 2.41E6 T: +cFullms[40.00-550.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 RelativeAbundance 178.06 202.02 152.13 275.81101.16 252.96 326.9176.18 135.14 428.90404.96354.90248.92 451.03 502.83310.96 528.92 Náhled do databáze NIST  O O O Chemical Formula: C18H12O3 Exact Mass: 276,08 Molecular Weight: 276,29 56    Příklad 15.  Hmotnostní spektrum benzofenonu s monoizotopickou hmotností 182,07.   Přístroj: Trace GC ULTRA – ITQ 1100 GC/MS (ITQ, Thermo Scientific)  Ionizační technika: EI  GC chromatogram     EI MS        RT: 0.00-18.04 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time(min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 RelativeAbundance 12.77 18.02 17.51 17.02 16.57 15.82 14.6410.48 11.708.958.857.516.845.794.28 12.77 13.28 17.8216.8214.3311.7410.9710.029.144.04 4.48 7.486.03 NL:1.87E7 TIC MSIVA20-a NL:1.50E7 m/z= 49.50-50.50+ 50.50-51.50+ 76.50-77.50+ 104.50-105.50+ 180.50-181.50+ 181.50-182.50 MS IVA20-a IVA20-a#987 RT: 12.77 AV: 1 SB: 20 12.70-12.86 NL: 3.79E6 T: +cFullms[40.00-550.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 RelativeAbundance 105.05 181.98 77.12 51.12 152.11 78.1376.21 126.1487.13 326.95207.01 248.99 405.91282.04 354.92 451.00 528.63479.80 57    Příklad 16.  Hmotnostní spektrum benzoinu s monoizotopickou hmotností 212,08.   Přístroj: Trace GC ULTRA – ITQ 1100 GC/MS (ITQ, Thermo Scientific)  Ionizační technika: EI  GC chromatogram     EI MS        RT: 0.00-18.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time(min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 RelativeAbundance 13.80 17.97 17.54 17.22 16.86 16.33 15.74 10.48 11.69 12.138.958.857.846.405.52 13.80 14.36 17.8115.4513.7111.7711.2410.024.11 8.948.035.38 6.02 NL:1.22E7 TIC MSIVA21-a NL:1.00E7 m/z= 50.50-51.50+ 76.50-77.50+ 78.50-79.50+ 104.50-105.50+ 105.50-106.50+ 106.50-107.50 MS IVA21-a IVA21-a#1103 RT: 13.79 AV: 1 SB: 31 13.67-13.93 NL: 3.05E6 T: +cFullms[40.00-550.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 RelativeAbundance 105.02 77.11 51.12 193.99165.01115.10 221.03 266.95 372.91294.96 347.91 490.92392.73 467.90 539.81 Náhled do databáze NIST  OH O Chemical Formula: C14H12O2 Exact Mass: 212,08 Molecular Weight: 212,25 58    Příklad 17.  Hmotnostní spektrum benzo[b]thiofen‐1,1‐dioxidu s monoizotopickou hmotností 166,01.   Přístroj: Trace GC ULTRA – ITQ 1100 GC/MS (ITQ, Thermo Scientific)  Ionizační technika: EI  GC chromatogram     EI MS        RT: 0.00-18.01 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Time(min) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 RelativeAbundance 18.00 17.69 17.42 12.63 17.32 17.18 16.89 16.72 16.51 16.2310.48 15.88 15.37 11.698.95 14.72 10.408.868.156.745.974.28 12.63 13.16 17.8213.80 16.6711.8011.2810.298.957.986.846.175.37 NL: 5.17E6 TIC MSDS-a NL: 2.15E6 m/z= 108.50-109.50+ 136.50-137.50+ 137.50-138.50+ 165.50-166.50 MSDS-a DS-a#964 RT: 12.63 AV: 1 SB: 18 12.57-12.72 NL: 8.21E5 T: +cFullms[40.00-550.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 RelativeAbundance 136.95 109.01 165.88 89.14 50.08 404.94252.97 341.91314.95223.00 386.87 429.88198.05 535.07492.70 Náhled do databáze NIST  59    Příklad 18.  Hmotnostní spektrum 7‐hydroxy‐4‐methyl‐2H‐chromen‐2‐onu s monoizotopickou  hmotností 176,05.   Přístroj: Trace GC ULTRA – ITQ 1100 GC/MS (ITQ, Thermo Scientific)  Ionizační technika: EI  EI MS    Příklad 19.  Hmotnostní spektrum aminokyseliny Argininu s monoizotopickou hmotností 174,11.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód  IVA4-a#1238 RT: 14.92 AV: 1 SB: 70 14.73-15.34 NL: 3.15E4 T: +cFullms[40.00-550.00] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 RelativeAbundance 148.05 176.00 91.11 119.07 65.15 77.1451.13 198.11 386.9792.13 403.90 431.91 490.89265.01 369.94234.97 461.93 512.34 540.90300.95 330.96 +MS2 (175.11) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Arginine-HCl poz 175 MT100_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 1.5e6 cps. 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 m/z, Da 0.0 1.0e5 2.0e5 3.0e5 4.0e5 5.0e5 6.0e5 7.0e5 8.0e5 9.0e5 1.0e6 1.1e6 1.2e6 1.3e6 1.4e6 1.5e6 Intensity,cps 175.2 116.2 130.0 158.0 112.2 157.0114.4 141.0140.2132.8 60    Příklad 20.  Hmotnostní spektrum 11‐Keto‐β‐boswellic acid s monoizotopickou hmotností 470,34.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, negativní mód    Ionizační technika: ESI, pozitivní mód  -MS2 (469.09) CE (-50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of 11-keto-b-BSWA neg from100_InitProduct_Neg.wiff (Turbo Spray) Max. 8.9e6 cps. 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 m/z, Da 0.0 5.0e5 1.0e6 1.5e6 2.0e6 2.5e6 3.0e6 3.5e6 4.0e6 4.5e6 5.0e6 5.5e6 6.0e6 6.5e6 7.0e6 7.5e6 8.0e6 8.5e6 8.9e6 Intensity,cps 469.0 391.0 407.2 376.0 451.0359.2353.0 423.2269.0 339.0231.0 303.0 393.0281.2197.2 412.6 435.0308.8 +MS2 (471.31) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of 11-keto-b-BSWA poz from100_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 1.2e6 cps. 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 m/z, Da 0.00 5.00e4 1.00e5 1.50e5 2.00e5 2.50e5 3.00e5 3.50e5 4.00e5 4.50e5 5.00e5 5.50e5 6.00e5 6.50e5 7.00e5 7.50e5 8.00e5 8.50e5 9.00e5 9.50e5 1.00e6 1.05e6 1.10e6 1.15e6 1.20e6 Intensity,cps 471.2 105.2 119.2 121.2 107.2 265.2135.2 149.2 173.4 109.2 161.2131.2 147.2123.2 175.2 269.2233.2129.2 191.0163.2 219.0103.0 247.0215.0141.2 243.4177.0 287.2155.4 183.4125.4 407.2211.0 250.8 333.2255.2 297.2283.0 453.0435.4357.0113.0 389.4369.4328.8 337.0 411.6 O H HO H OH O H Chemical Formula: C30H46O4 Exact Mass: 470,34 Molecular Weight: 470,69 61    Příklad 21.  Hmotnostní spektrum 3‐Acetyl‐11‐keto‐β‐boswellic acid s monoizotopickou hmotností  512,35.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, negativní mód  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód      -MS2 (511.13) CE (-50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of 3Ac-11-keto-b-BSWA neg from100_InitProduct_Neg.wiff (Turbo Spr... Max. 1.0e7 cps. 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z, Da 0.0 5.0e5 1.0e6 1.5e6 2.0e6 2.5e6 3.0e6 3.5e6 4.0e6 4.5e6 5.0e6 5.5e6 6.0e6 6.5e6 7.0e6 7.5e6 8.0e6 8.5e6 9.0e6 9.5e6 1.0e7 Intensity,cps 511.0 451.2 +MS2 (513.29) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of 3Ac-11-keto-b-BSWA poz from100_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spr... Max. 2.4e6 cps. 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z, Da 0.0 1.0e5 2.0e5 3.0e5 4.0e5 5.0e5 6.0e5 7.0e5 8.0e5 9.0e5 1.0e6 1.1e6 1.2e6 1.3e6 1.4e6 1.5e6 1.6e6 1.7e6 1.8e6 1.9e6 2.0e6 2.1e6 2.2e6 2.3e6 2.4e6 Intensity,cps 119.2 105.2 513.2 121.2 173.2 135.2107.2 159.2 145.2 109.2 131.2 175.2 147.2 123.2 233.0 269.2137.2 307.2 215.2 201.0157.2143.2 187.2117.2 163.2 219.2191.4 247.2 128.2 115.2 207.2 243.2177.2 213.0141.2 183.2 407.2169.2 287.4179.0 241.2 297.2255.2217.4 225.0153.2 271.0 435.2375.2193.4 285.2 389.0139.2 339.2315.0265.2 301.2 453.4249.4 399.2351.0113.2 495.0 62    Příklad 22.  Hmotnostní spektrum Clenbuterolu s monoizotopickou hmotností 276,08.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód  Příklad 23.  Hmotnostní spektrum Denatonium benzoatu s monoizotopickou hmotností 325,25.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód      +MS2 (276.80) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of CLE 277 poz MT100_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 2.7e7 cps. 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 m/z, Da 0.0 2.0e6 4.0e6 6.0e6 8.0e6 1.0e7 1.2e7 1.4e7 1.6e7 1.8e7 2.0e7 2.2e7 2.4e7 2.6e7 2.7e7 Intensity,cps 203.2132.2 168.2 140.2 104.2 131.2 167.2 259.2 277.2 105.2 151.2133.2 116.2 186.2 174.2113.2 153.2141.2127.2 161.2102.2 221.0138.2 190.2 +MS2 (325.15) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Denatonium_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 2.6e6 cps. 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 m/z, Da 0.0 2.0e5 4.0e5 6.0e5 8.0e5 1.0e6 1.2e6 1.4e6 1.6e6 1.8e6 2.0e6 2.2e6 2.4e6 2.6e6 Intensity,cps 91.2 86.4 325.2 233.2 112.2 148.2132.2117.8106.8 205.2160.089.0 63    Příklad 24.  Hmotnostní spektrum Bilobalidu s monoizotopickou hmotností 326,10.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, negativní mód  Příklad 25.  Hmotnostní spektrum Chrysinu s monoizotopickou hmotností 254,06.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, negativní mód      -MS2 (325.10) CE (-50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Bilobalid_InitProduct_Neg.wiff (Turbo Spray) Max. 5.6e4 cps. 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 m/z, Da 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 2.0e4 2.5e4 3.0e4 3.5e4 4.0e4 4.5e4 5.0e4 5.5e4 Intensity,cps 325.2 163.0 106.0 192.8 251.2 237.2 73.2 183.2 164.6109.0 119.0 80.0 219.2134.0 207.2197.292.6 191.0152.8 -MS2 (252.86) CE (-50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Chrysin_InitProduct_Neg.wiff (Turbo Spray) Max. 1.6e6 cps. 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 m/z, Da 0.0 1.0e5 2.0e5 3.0e5 4.0e5 5.0e5 6.0e5 7.0e5 8.0e5 9.0e5 1.0e6 1.1e6 1.2e6 1.3e6 1.4e6 1.5e6 1.6e6 Intensity,cps 253.0 63.0 65.0 143.0 107.2 145.2 209.0119.0101.0 166.8 180.8165.0 185.289.260.8 77.0 92.079.0 139.0 225.2120.8 197.2168.8 O O O O OO H H HO HO Chemical Formula: C15H18O8 Exact Mass: 326,10 Molecular Weight: 326,30 64    Příklad 26.  Hmotnostní spektrum Sanguinarinu s monoizotopickou hmotností 332,09.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód    Příklad 27.  Hmotnostní spektrum Chelerytrinu s monoizotopickou hmotností 348,38.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód      +MS2 (332.08) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Sanguinarine poz_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 2.0e6 cps. 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300 305 310 315 320 325 330 335 m/z, Da 0.0 1.0e5 2.0e5 3.0e5 4.0e5 5.0e5 6.0e5 7.0e5 8.0e5 9.0e5 1.0e6 1.1e6 1.2e6 1.3e6 1.4e6 1.5e6 1.6e6 1.7e6 1.8e6 1.9e6 2.0e6 Intensity,cps 332.0 274.2 317.2304.2 246.2 244.2 302.2 330.0259.2247.2 275.2261.2230.2 232.0 288.8 316.0228.0 272.2 287.2257.2243.2 314.0241.8 300.8 +MS2 (348.12) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Chelerytrine poz_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 5.6e6 cps. 280 285 290 295 300 305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 m/z, Da 0.0 5.0e5 1.0e6 1.5e6 2.0e6 2.5e6 3.0e6 3.5e6 4.0e6 4.5e6 5.0e6 5.5e6 Intensity,cps 348.0 332.0 290.2 304.2 333.0 318.0 316.0 330.0 315.0288.0287.2 288.8 302.0 314.0301.0 305.2284.2 65    Příklad 28.  Hmotnostní spektrum Gentamycinu C1 s monoizotopickou hmotností 477,32.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód  Příklad 29.  Hmotnostní spektrum Gentamycinu C2 s monoizotopickou hmotností 463,30.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód      +MS2 (478.28) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Gentamicin C1_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 5.9e4 cps. 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480 m/z, Da 0.0 5000.0 1.0e4 1.5e4 2.0e4 2.5e4 3.0e4 3.5e4 4.0e4 4.5e4 5.0e4 5.5e4 5.9e4 Intensity,cps 322.4 478.4 302.2 461.0 319.2 344.2336.4 +MS2 (464.29) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Gentamicin C2_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 1.0e5 cps. 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 m/z, Da 0.00 5000.00 1.00e4 1.50e4 2.00e4 2.50e4 3.00e4 3.50e4 4.00e4 4.50e4 5.00e4 5.50e4 6.00e4 6.50e4 7.00e4 7.50e4 8.00e4 8.50e4 9.00e4 9.50e4 1.00e5 Intensity,cps 322.0 464.4 330.0305.0 347.0 66    Příklad 30.  Hmotnostní spektrum Lovastatinu s monoizotopickou hmotností 404,26.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód    Příklad 31.  Hmotnostní spektrum Meldonia s monoizotopickou hmotností 146,11.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód        +MS2 (405.36) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Lovastatin_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 1.8e6 cps. 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z, Da 0.0 1.0e5 2.0e5 3.0e5 4.0e5 5.0e5 6.0e5 7.0e5 8.0e5 9.0e5 1.0e6 1.1e6 1.2e6 1.3e6 1.4e6 1.5e6 1.6e6 1.7e6 1.8e6 1.8e6 Intensity,cps 199.0 173.2 128.2 143.2 225.2 105.2 145.2 141.2 159.2115.2 169.2 131.0 157.2 285.2171.2 119.2107.2 243.0 201.2 267.2249.2 303.2153.2 183.2 223.0 239.2 197.2 125.0 165.2130.0 405.2181.2 191.2 211.2121.2103.0 207.0 229.0147.2135.2 161.2 187.2 219.2 234.2111.4 257.2123.2 175.2 320.8260.8 270.4 +MS2 (147.14) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Meldonium_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 1.3e6 cps. 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 m/z, Da 0.00 5.00e4 1.00e5 1.50e5 2.00e5 2.50e5 3.00e5 3.50e5 4.00e5 4.50e5 5.00e5 5.50e5 6.00e5 6.50e5 7.00e5 7.50e5 8.00e5 8.50e5 9.00e5 9.50e5 1.00e6 1.05e6 1.10e6 1.15e6 1.20e6 1.25e6 Intensity,cps 58.2 147.0 59.2 42.2 43.2 56.0 85.041.0 73.2 131.8101.0 128.8113.2102.891.4 67    Příklad 32.  Hmotnostní spektrum Sulforafanu s monoizotopickou hmotností 177,03.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód  Příklad 33.  Hmotnostní spektrum Glukorafaninu s monoizotopickou hmotností 436,04.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, negativní mód      +MS2 (178.09) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Sulforaphane poz_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 3.2e6 cps. 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 m/z, Da 0.0 2.0e5 4.0e5 6.0e5 8.0e5 1.0e6 1.2e6 1.4e6 1.6e6 1.8e6 2.0e6 2.2e6 2.4e6 2.6e6 2.8e6 3.0e6 3.2e6 Intensity,cps 72.0 114.2 55.2 178.0 119.2 65.263.0 118.098.052.8 70.2 89.0 144.281.2 85.259.0 90.675.8 103.2 116.2 -MS2 (435.81) CE (-50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Glucoraphanin neg_InitProduct_Neg.wiff (Turbo Spray) Max. 9.7e5 cps. 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 m/z, Da 0.0 5.0e4 1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.5e5 3.0e5 3.5e5 4.0e5 4.5e5 5.0e5 5.5e5 6.0e5 6.5e5 7.0e5 7.5e5 8.0e5 8.5e5 9.0e5 9.5e5 Intensity,cps 436.0 371.8 258.8 420.6275.0226.0 243.2210.0 291.2 356.2 O HO HO OH S OH S N O S O O O O Chemical Formula: C12H22NO10S3 Exact Mass: 436,04 Molecular Weight: 436,49 C N S O Chemical Formula: C6H11NOS2 Exact Mass: 177,03 Molecular Weight: 177,28 S 68    Příklad 34.  Hmotnostní spektrum Solaninu s monoizotopickou hmotností 868,50.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód    Příklad 35.  Hmotnostní spektrum Silibininu s monoizotopickou hmotností 482,12.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, negativní mód        +MS2 (868.41) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Solanine_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 1.6e5 cps. 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 m/z, Da 0.0 1.0e4 2.0e4 3.0e4 4.0e4 5.0e4 6.0e4 7.0e4 8.0e4 9.0e4 1.0e5 1.1e5 1.2e5 1.3e5 1.4e5 1.5e5 1.6e5 Intensity,cps 398.4 868.4 380.2 706.6 206.2 722.4366.4 560.6 211.0 253.2 466.4338.4260.6 368.0327.4 -MS2 (480.88) CE (-50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Silibinin MS_InitProduct_Neg.wiff (Turbo Spray) Max. 2.4e6 cps. 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 m/z, Da 0.0 1.0e5 2.0e5 3.0e5 4.0e5 5.0e5 6.0e5 7.0e5 8.0e5 9.0e5 1.0e6 1.1e6 1.2e6 1.3e6 1.4e6 1.5e6 1.6e6 1.7e6 1.8e6 1.9e6 2.0e6 2.1e6 2.2e6 2.3e6 2.4e6 Intensity,cps 481.0 125.0 178.8152.0 301.0 273.0 453.0 83.0 124.0 463.2 283.0229.0 257.0 149.096.0 186.8 215.0121.0107.0 136.8 451.093.0 164.2 423.0255.2 284.8 435.0231.0201.2 354.8271.0143.2 299.0 406.8377.2316.8 324.8 401.6 69    Příklad 36.  Hmotnostní spektrum Oseltamiviru s monoizotopickou hmotností 312,20.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód    Příklad 37.  Hmotnostní spektrum Testosteronu s monoizotopickou hmotností 288,21.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód        +Q3: 10 MCA scans from Sample 1 (Oseltamivir) of Oseltamivir.wiff (Turbo Spray) Max. 1.9e7 cps. 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 m/z, Da 0.0 1.0e6 2.0e6 3.0e6 4.0e6 5.0e6 6.0e6 7.0e6 8.0e6 9.0e6 1.0e7 1.1e7 1.2e7 1.3e7 1.4e7 1.5e7 1.6e7 1.7e7 1.8e7 1.9e7 Intensity,cps 166.8 120.7 313.9 208.8 225.8 137.8 94.6 109.7 277.9 347.9243.6 314.7162.6 121.8 364.0260.980.6 329.7296.995.7 180.9111.6 198.9 209.8149.677.6 269.0154.9126.765.6 334.0 377.9257.9 343.7 395.797.6 228.8 306.074.5 194.7 309.9 430.0188.7 405.8102.6 434.0 453.8 478.8 +MS2 (289.21) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Testosterone_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 3.3e6 cps. 180 185 190 195 200 205 210 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 m/z, Da 0.0 2.0e5 4.0e5 6.0e5 8.0e5 1.0e6 1.2e6 1.4e6 1.6e6 1.8e6 2.0e6 2.2e6 2.4e6 2.6e6 2.8e6 3.0e6 3.2e6 3.3e6 Intensity,cps 289.4 271.2253.0 187.2 199.4189.2 213.4201.2185.4 211.0 227.4217.0 219.2 243.6229.2 245.0238.2198.4 70    Příklad 38.  Hmotnostní spektrum Boldenonu s monoizotopickou hmotností 286,19.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód    Příklad 39.  Hmotnostní spektrum Terbinafinu s monoizotopickou hmotností 291,20.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód      +MS2 (287.15) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Boldenone_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 1.4e5 cps. 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 m/z, Da 0.0 1.0e4 2.0e4 3.0e4 4.0e4 5.0e4 6.0e4 7.0e4 8.0e4 9.0e4 1.0e5 1.1e5 1.2e5 1.3e5 1.4e5 Intensity,cps 287.0 269.0173.0 161.4 158.8 179.4 187.0 158.0 199.2175.0 213.0 170.8 177.2155.4 215.2185.2 +MS2 (292.14) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Terbinafine_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 1.1e7 cps. 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 m/z, Da 0.00 5.00e5 1.00e6 1.50e6 2.00e6 2.50e6 3.00e6 3.50e6 4.00e6 4.50e6 5.00e6 5.50e6 6.00e6 6.50e6 7.00e6 7.50e6 8.00e6 8.50e6 9.00e6 9.50e6 1.00e7 1.05e7 1.09e7 Intensity,cps 292.0 170.2 205.2 150.4 261.2179.0165.0 203.0 236.2191.2189.2 219.0 249.0167.2155.2 207.2 231.0 246.0221.0 277.0 71    Příklad 40.  Hmotnostní spektrum Tymochinonu s monoizotopickou hmotností 166,08.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód    Příklad 41.  Hmotnostní spektrum Sibutraminu s monoizotopickou hmotností 279,18.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód      +MS2 (165.13) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Thymoquinone poz LT100_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 8.7e5 cps. 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 m/z, Da 0.0 5.0e4 1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.5e5 3.0e5 3.5e5 4.0e5 4.5e5 5.0e5 5.5e5 6.0e5 6.5e5 7.0e5 7.5e5 8.0e5 8.5e5 8.7e5 Intensity,cps 137.2 165.0 77.0 81.279.0 91.2 109.2 124.069.251.2 65.0 131.0107.0103.055.0 78.263.2 94.295.0 147.2119.2 128.0115.2 150.289.066.2 74.2 83.2 135.4108.0 144.854.0 73.0 +MS2 (280.14) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Sibutramin 1_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 8.7e6 cps. 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 m/z, Da 0.0 5.0e5 1.0e6 1.5e6 2.0e6 2.5e6 3.0e6 3.5e6 4.0e6 4.5e6 5.0e6 5.5e6 6.0e6 6.5e6 7.0e6 7.5e6 8.0e6 8.5e6 Intensity,cps 125.2 139.0 280.0 153.2 179.2151.2 165.0128.2 130.2 144.2 235.0167.4 193.2126.0 N Cl Chemical Formula: C17H26ClN Exact Mass: 279,18 Molecular Weight: 279,85 72    Příklad 42.  Hmotnostní spektrum Ciprofloxacinu s monoizotopickou hmotností 331,13.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód  Příklad 43.  Hmotnostní spektrum Diosgeninu s monoizotopickou hmotností 414,31.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód        +MS2 (332.13) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Ciprofloxacin_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 2.1e7 cps. 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 m/z, Da 0.0 1.0e6 2.0e6 3.0e6 4.0e6 5.0e6 6.0e6 7.0e6 8.0e6 9.0e6 1.0e7 1.1e7 1.2e7 1.3e7 1.4e7 1.5e7 1.6e7 1.7e7 1.8e7 1.9e7 2.0e7 2.1e7 Intensity,cps 231.0 314.0 332.0 288.0 245.0 203.2 204.0188.2 160.2 175.0162.2 268.0191.2 217.2215.0 294.0163.2 202.2156.2 173.2 229.0169.2 185.2 227.0 286.2183.2 243.2 273.2240.2 270.8199.2 213.0 253.2 257.0 311.8 +MS2 (415.28) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Diosgenin poz_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 5.3e5 cps. 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 m/z, Da 0.0 5.0e4 1.0e5 1.5e5 2.0e5 2.5e5 3.0e5 3.5e5 4.0e5 4.5e5 5.0e5 5.3e5 Intensity,cps 271.2 253.4 157.2 415.2 105.4 147.2 159.2 141.2 145.2115.2 131.2 109.4 171.4 197.2119.2 155.2 211.2175.2 169.4 185.2167.4 283.4149.4135.4103.2 225.4123.4 209.2196.2 238.4 177.4 242.2179.0138.8 397.6379.6256.0 H H HO Chemical Formula: C27H42O3 Exact Mass: 414,31 Molecular Weight: 414,63 O O H H H 73    Příklad 44.  Hmotnostní spektrum Hekogeninu s monoizotopickou hmotností 430,31.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód  Příklad 45.  Hmotnostní spektrum Ruskogeninu s monoizotopickou hmotností 430,31.   Přístroj: 3200 QTRAP LC‐MS/MS (QTRAP, AB Sciex)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód        +MS2 (431.34) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Hecogenin poz_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 4.0e5 cps. 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 m/z, Da 0.0 2.0e4 4.0e4 6.0e4 8.0e4 1.0e5 1.2e5 1.4e5 1.6e5 1.8e5 2.0e5 2.2e5 2.4e5 2.6e5 2.8e5 3.0e5 3.2e5 3.4e5 3.6e5 3.8e5 4.0e5 Intensity,cps 299.4 431.4 105.2 133.2 173.4 107.0 187.4 145.4 159.2 317.2 395.4119.2 281.2 413.4 131.2 161.2121.2 135.4 115.2 143.2 171.4 185.2 129.2 175.2123.2 141.4 215.2 149.4 199.4 183.2 241.4 259.2225.2137.2125.2 211.0 269.0191.4169.0 287.4177.2163.4103.4 305.4239.0203.4 377.4229.0 243.4151.4 253.4193.4139.4111.4 315.0273.4 355.4337.4279.0113.4 319.0 359.0 +MS2 (431.35) CE (50): 26 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Ruscogenin poz_InitProduct_Pos.wiff (Turbo Spray) Max. 2.6e5 cps. 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 m/z, Da 0.0 1.0e4 2.0e4 3.0e4 4.0e4 5.0e4 6.0e4 7.0e4 8.0e4 9.0e4 1.0e5 1.1e5 1.2e5 1.3e5 1.4e5 1.5e5 1.6e5 1.7e5 1.8e5 1.9e5 2.0e5 2.1e5 2.2e5 2.3e5 2.4e5 2.5e5 Intensity,cps 287.2 139.2 121.2 251.2 269.2 105.2 157.4 431.2145.2 155.2 141.2128.4 173.4 115.4 165.0 195.2131.2 241.4169.2107.2 117.2 181.4133.2 209.2 147.2 236.2199.2 187.0 197.0127.2 152.0109.4 281.4211.4 227.2 299.4 135.0 163.2 249.4202.8 253.0 377.8123.4 395.6 H H HO H Chemical Formula: C27H42O4 Exact Mass: 430,31 Molecular Weight: 430,63 O O O H H H 74    Příklad 46.10  Hmotnostní spektrum T3P s monoizotopickou hmotností 318,06.   Přístroj: HPLC 1100 Series LCMS D Ion Trap (IT, Agilent)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód     Příklad 47.  Hmotnostní spektrum Flufenazín‐dekanoátu s monoizotopickou hmotností 591,31.   Přístroj: HPLC 1100 Series LCMS D Ion Trap (IT, Agilent)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód     Flufenazín dekanoát je neuroleptikum s dlouhodobým účinkem (depotní forma) používané  v léčbě  psychóz  a  hlavně  schizofrenie.  Látka  byla  naměřena  s použitím  ESI  v pozitivním  modu,  z čehož  lze  očekávat  přítomnost  [M+H]+   kvazimolekulového  iontu.  Fragmentační  spektrum MS2  na obrázku vyjadřuje přítomnost fragmentů 199,2 a 325,4, které patří .        125.0 139.0 167.0 213.0 231.0 319.0 337.0 125.0 213.0 +MS, 0.5min #16 0.0 0.5 1.0 1.5 7x10 Intens. 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 m/z 199.2 230.0 250.1 280.0 297.3 325.4 373.2 420.3 592.4 +MS2(592.7), 35.2min #1927 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 7x10 Intens. 100 200 300 400 500 600 700 800 m/z 75    Příklad 48.11  Hmotnostní spektrum s vysokým rozlišením látky se sumárním vzorcem C60H22F68N4S2 a  monoizotopickou hmotností 2154,02001.   Přístroj: Impact II (Q‐TOF, Bruker Daltonics, Brémy, Německo)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód        Po zvětšení v oblasti 1 700 – 2 600.        256.2663 282.2816 338.3440 430.1983 537.5359 563.5512 619.6136 1150.0952 +MS, 0.2‐0.8min #20‐99 0 1 2 3 4 6x10 Intens. 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 m/z 2155.0270 +MS, 0.2‐0.8min #20‐99 0 2000 4000 6000 Intens. 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 m/z NH NH NH NH S S C8F17 C8F17 C8F17 C8F17 76    Ionizační technika: ESI, negativní mód    Po zvětšení v oblasti 1 700 – 2 600.      Příklad 49.  Hmotnostní spektrum Polymyxinu B1 s monoizotopickou hmotností 1202,75.   Přístroj: HPLC 1100 Series LCMS D Ion Trap (IT, Agilent)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód         162.8373 255.2310 283.2622 353.1984 397.2247 442.0677 474.2271 555.1694 666.0188 748.1053 784.0823 824.0490 862.0987 929.3581 955.9749 973.9858 1018.3960 1069.9684 1148.0805 1184.0573 1224.0249 1262.0735 1283.1238 1338.0179 1359.0683 1404.3206 1565.9624 1633.9498 1865.9427 2153.0116 2188.9880 2267.0030 ‐MS, 0.1‐0.9min #11‐109 0 1 2 3 4 5 6 4x10 Intens. 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 m/z 1753.0379 1865.9427 1898.9222 1942.9145 1956.9290 1974.9358 1995.9852 2137.0325 2153.0116 2188.9880 2210.9622 2267.0030 2288.0536 2373.1094 2409.0878 2433.0770 2449.0535 ‐MS, 0.1‐0.9min #11‐109 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 4x10 Intens. 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500 2600 m/z 77    ESI MS  ESI MS2  – prekurzorový ion 602,5      101.2 153.0 184.0 241.3280.2 340.5 398.2 482.2 568.7 602.5 679.3 745.5 821.7 864.5 964.5 1203.6 1253.8 1301.8 602.5 +MS, 3.6min#148 0 1 2 3 4 5 5x10 Intens. 200 400 600 800 1000 1200 m/z 202.1 241.1 322.4 361.2 442.2 482.2 552.5 593.6 626.4 662.3 763.5 843.6 901.4 963.5 1103.9 +MS2(602.7), 3.6min#149 0 1 2 3 4 5 4x10 Intens. 200 400 600 800 1000 1200 m/z 78    Příklad 50.12   Hmotnostní  spektrum  produktů  reduktivní  aminace  N‐acetylglukosaminu  s  (2‐amino‐ ethyl)trimethylammonium‐chloridem s monoizotop. hmotnostmi 308,22, 310,22 a 290,21.   Přístroj: Agilent 7100 CE System + maXis II™ (QTOF, Bruker)  Ionizační technika: ESI, pozitivní mód   CE/ESI MS elektroferogram     OHHO HO H N NH O OH N Chemical Formula: C13H30N3O5 + Exact Mass: 308,22 Molecular Weight: 308,40 OHHO HO H N NH 18O OH N Chemical Formula: C13H30N3O4 18 O+ Exact Mass: 310,22 Molecular Weight: 310,40 OHHO HO OH N N N Chemical Formula: C13H28N3O4 + Exact Mass: 290,21 Molecular Weight: 290,38   ESI MS       308.2318 418.2613 +MS, 12.2‐12.2min #730‐733, Background Subtracted 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 5x10 Intens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z OHHO HO H N NH O OH N Chemical Formula: C13H30N3O5 + Exact Mass: 308,22 Molecular Weight: 308,40 79      Příklad 51.12   Hmotnostní  spektrum  produktů  reduktivní  aminace  N‐acetylglukosaminu  s kyselinou   2‐aminobenzoovou s monoizotopickou hmotnosti 342,14.   Přístroj: Agilent 7100 CE System + maXis II™ (QTOF, Bruker)  Ionizační technika: ESI, negativní mód   CE/ESI MS elektroferogram     ESI MS      290.2206 445.1477 +MS, 11.6‐11.7min #699‐704, Background Subtracted 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 5x10 Intens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z 0 5 10 15 20 25 30 Time [min] 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 5x10 Intens. 341.1453 ‐MS, 28.2‐28.5min #1693‐1712, Background Subtracted 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 5x10 Intens. 200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z EIE – m/z 341.2 BPE OHHO HO OH N N N Chemical Formula: C13H28N3O4 + Exact Mass: 290,21 Molecular Weight: 290,38 OHHO HO H N NH O OH Chemical Formula: C15H22N2O7 Exact Mass: 342,14 Molecular Weight: 342,35 O OH 80    Příklad 52.  Hmotnostní spektrum kalibrační směsi peptidů:  Angiotensin II s monoizotopickou hmotností 1046,2→  ,  Angiotensin I s monoizotopickou hmotností 1296,5→  ,  Neurotensin s monoizotopickou hmotností 1672,9→  ,  ACTH [1‐17] fragment s monoizotopickou hmotností 2093,5→  ,  ACTH [18‐39] fragment s monoizotopickou hmotností 2465,7→  .  Přístroj: AB SciEX 4700 MALDI (TOF/TOF, AB Sciex)  Ionizační technika: MALDI, pozitivní mód, rTOF   Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe O NH2O HO O N H HN NHH2N O H N O N H OH O H N O N H NH N O N O NH OH Chemical Formula: C50H71N13O12 Exact Mass: 1045,53 Molecular Weight: 1046,20           Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Arg O NH2 HO O N H OH O H N HO O N H S O H N OHO O N H NH N O H N O N H NH HN NH2 O H N NH O N H O H N NH2 O N O NH O N H OH N H2N O N H NH2 OH N HN NHH2N OH Chemical Formula: C95H145N29O23S Exact Mass: 2092,08 Molecular Weight: 2093,44   81                799 1195 1591 1987 2383 2779 Mass (m/z) 1.8E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %Intensity 4700 Reflector Spec #1 MC=>AdvBC(50,0.5,0.1)=>BC[BP= 1296.7,17545] 1296.6865 1672.9170 1046.5404 2093.0864 2465.2014 1656.1646 1338.6923 82    Příklad 53.  MS/MS (fragmentace) peptidu ACTH [18‐39] fragment s monoizotopickou hmotností 2465,7.  Přístroj: AB SciEX 4700 MALDI (TOF/TOF, AB Sciex)  Ionizační technika: MALDI, pozitivní mód, rTOF           9.0 528.2 1047.4 1566.6 2085.8 2605.0 Mass(m/z) 6.4E+4 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %Intensity 4700MS/MS Precursor 2465.2Spec#1MC=>AdvBC(50,0.5,0.1)[BP =1326.8, 64296] 1326.77 2318.38 1211.70 1742.991455.82 857.54 2300.3770.08 1229.73 464.30112.10 715.48 2322.28254.15 1011.59 1933.16563.3784.09 840.53 1183.72 1715.001542.85 2283.35 83    Příklad 54.  Hmotnostní spektrum směsi peptidů získaných enzymatickým štěpením Trypsinem proteinu:  BSA – Hovězí sérový albumin s monoizotopickou hmotností 69 293. Počet aminokyselin 607.  Přístroj: AB SciEX 4700 MALDI (TOF/TOF, AB Sciex)  Ionizační technika: MALDI, pozitivní mód, rTOF     Místa štěpení řetězce trypsinem   a chymotrypsinem      Sekvence proteínu:  10 20 30 40 50 MKWVTFISLL LLFSSAYSRG VFRRDTHKSE IAHRFKDLGE EHFKGLVLIA 60 70 80 90 100 FSQYLQQCPF DEHVKLVNEL TEFAKTCVAD ESHAGCEKSL HTLFGDELCK 110 120 130 140 150 VASLRETYGD MADCCEKQEP ERNECFLSHK DDSPDLPKLK PDPNTLCDEF 160 170 180 190 200 KADEKKFWGK YLYEIARRHP YFYAPELLYY ANKYNGVFQE CCQAEDKGAC 210 220 230 240 250 LLPKIETMRE KVLASSARQR LRCASIQKFG ERALKAWSVA RLSQKFPKAE 260 270 280 290 300 FVEVTKLVTD LTKVHKECCH GDLLECADDR ADLAKYICDN QDTISSKLKE 310 320 330 340 350 CCDKPLLEKS HCIAEVEKDA IPENLPPLTA DFAEDKDVCK NYQEAKDAFL 360 370 380 390 400 GSFLYEYSRR HPEYAVSVLL RLAKEYEATL EECCAKDDPH ACYSTVFDKL 410 420 430 440 450 KHLVDEPQNL IKQNCDQFEK LGEYGFQNAL IVRYTRKVPQ VSTPTLVEVS 460 470 480 490 500 RSLGKVGTRC CTKPESERMP CTEDYLSLIL NRLCVLHEKT PVSEKVTKCC 510 520 530 540 550 TESLVNRRPC FSALTPDETY VPKAFDEKLF TFHADICTLP DTEKQIKKQT 560 570 580 590 600 ALVELLKHKP KATEEQLKTV MENFVAFVDK CCAADDKEAC FAVEGPKLVV STQTALA   800 1180 1560 1940 2320 2700 Mass (m/z) 5525.6 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 %Intensity 4700 Reflector Spec #1 MC=>AdvBC(50,0.5,0.1)[BP = 1567.8,5526] 1567.77 1439.84 1639.96 1479.82 927.52 1001.61 1178.59 1880.94 1195.61 1496.85 1283.74 1083.62 1423.07 958.50 1017.61 2529.22 2301.09 1696.98 1366.73 1946.03 1750.98 2045.04 2612.17 84    8. Seznam použité a doporučené literatury   [1] HOFFMANN, Edmond de, STROOBANT, V. Mass spectrometry: principles and applications.  3rd  ed. Chichester: Wiley, 2007. ISBN 978‐0‐470‐03310‐4.  [2] HARRIS, Daniel C. Quantitative Chemical Analysis. 7th  ed. New York: W. H. Freeman and  Company, 2007. ISBN 0‐7167‐7041‐5.  [3]  KOVÁČ,  Štefan,  J.  LEŠKO  a  D.  ILAVSKÝ.  Metódy  kontroly  technologických  procesov:  Spektrálne metódy v organickej chémii a technoloógii. Bratislava: Alfa, 1987. Edícia chemickej  literatúry (Alfa). ISBN 063‐555‐87.  [4]  MILATA,  Viktor,  P.  SEGĽA,  V.  BREZOVÁ,  A.  GATIAL,  V.  KOVÁČIK,  M.  MIGLIERINI,  Š.  STANKOVSKÝ, J. ŠÍMA. Aplikovaná molekulová spektroskopia. Bratislava: Vydavateľstvo STU,  2008. Edícia vysokoškolských učebníc. ISBN 978‐80‐2227‐2960‐4.  [5]  JANDERA,  Pavel.  Atomová  a  molekulová  spektroskopie  se  zaměřením  na  stopovou  analýzu  kontaminantů.  Díl  B  ‐  Molekulová  spektroskopie  v  organické  analýze. Pardubice:  Univerzita Pardubice, 2006. ISBN 80‐7194‐906‐X.  [6]  SILVERSTEIN,  Robert  M.  Spectrometric  identification  of  organic  compounds.  8th   ed.  Hoboken: Wiley, 2015. ISBN 978‐0‐470‐61637‐6.  [7]  WATSON,  J.  Throck,  SPARKMAN,  O.  D.  Introduction  to  mass  spectrometry  :  instrumentation,  applications,  and  strategies  for  data  interpretation.  4th   ed.  Chichester:  Wiley, 2007. ISBN 978‐0470‐51634‐8.  [8]  SMITH,  R.  Martin.  Understanding  mass  spectra  :  a  basic  approach.  2nd   ed.  Hoboken:  Wiley, 2004. ISBN 0‐471‐42949‐X.  [9] PRETSCH, Ernö, P. BÜHLMANN a M. BADERTSCHER. Structure determination of organic  compounds: tables of spectral data. 4th, rev. and enl. ed. Berlin: Springer, 2009. ISBN 978‐3‐ 540‐93809‐5.  [10]  PIZOVA,  Hana  a  P.  BOBAL.  An  optimized  and  scalable  synthesis  of  propylphosphonic  anhydride for general use. Tetrahedron Letters, 2015, vol. 56, no. 15, pp. 2014 – 2017.  [11] Nepublikované výsledky.  [12] KRENKOVA, Jana, P. BOBAL, J. PARTYKA, R. CMELIK, a F. FORET. Investigation of a side  reaction occurring during N‐linked glycan labeling by cationic tags. J. Chromatogr. A, 2018,  vol. 1570, pp. 67 – 74.