1 UV-VIS fotometrie Spektrofotometrické stanovení fenazonu v Antipyrinu železitými ionty pomocí kalibrační křivky Teorie Molekuly vzorku absorbují z dopadajícího záření fotony vhodné vlnové délky λ (tj. ty, které odpovídají jejich energetickým hladinám) a přecházejí do vyššího energetického stavu. V UV-VIS oblasti mají fotony energii dostatečnou k tomu, aby jejich absorpce způsobila přechod vnějších elektronů (200-600 kJ/mol). Skupiny, v kterých se realizuje takový elektronový přechod, se nazývají chromofory. U koordinačně kovalentních sloučenin (vazba donorakceptor) se jedná o energetické přechody v d a f orbitalech Obr. 1 Vlnové délky elektromagnetického záření Obr.2 Některé chromofory 2 Definice absorbance a Lambert-Beerův zákon (ČL 2009) 3 Tvorba komplexu s fenazonem Fenazon (l,5-dimethyl-2-fenyl-2,3-dihydro-pyrrazol-3-on) tvoří se železitými ionty v kyselém prostředí oranžově červený komplex [Fe2(fenazon)3]6+ , který poskytuje charakteristické absorpční spektrum s maximem přibližně 460 nm a který lze využít pro identifikaci a stanovení fenazonu. Využití komplexů ke kvantitativnímu stanovení je typické pro analyty kovové ionty (Mn+ ), které vytvoří donor-akceptorovou vazbu s tzv. ligandem (L) a vznikne komplex [M-L], někdy i ML2 nebo dokonce M2L3 (viz stanovení Cu s Chelatonem III). Ovšem v tomto případě je analytem právě ligand a Fe(3+) je činidlem. Přístrojové vybavení Jednopaprskový fotometr HP8453 4 Obr.3 Fotometr s diodovým polem HP 8453 Obr. 4 Popis fotometru Hewlett Packard 8453 http://www.p-forster.com/english/themes/Spectroscopy/BASICS/ 5 Obsluha přístroje Nejprve zkontrolujeme, zda je přístroj zapojen do elektrické sítě, a zapneme fotometr v levé spodní části spektrofotometru se nachází tlačítko. V pravém horním rohu fotometru začne blikat kontrolka. Po jejím ustalém na žluté barvě lze spustit počítač. a pak teprve spustíme ovládací software Chemstation. Jedná se o ovládání jednopaprskového přístroje, a proto každá série měření začíná změřením „blanku“ – obvykle rozpouštědla, ve kterém budu provádět následující měření analytu (Tlačítko BLANK). Pak už můžeme měřit libovolný počet vzorků (SAMPLE). Pokud nám některé naměřené spektrum nevyhovuje, po označení (klepnutím myši) jej můžeme odstranit (Delete). Software Chemstation, modul UV-VIS Obsluha je velmi jednoduchá a umožňuje přehledně srovnávat více spekter, odečítat hodnoty maxim i absorbancí (kliknutím pravého tlačítka myši). Zapisujme do tabulky maximum informací o příslušném vzorku kvůli pozdější orientaci. Budeme pracovat v modu Standard. Můžeme exportovat spektrální data do excelovského sešitu a detailně je zpracovat doma na počítači. 6 Postup (úloha 3, str. 15-16, ROZDÍLY od Skript: měří se na fotometrech HP8453, do 50 ml odměrky splachujeme 0,2 g fenazonu) Chemikálie: čištěná voda, okyselený základní roztok Fe(NO3)3 (c = 0,0125 M). Úkoly • Příprava základního roztoku činidla • Naředění kalibračních roztoků • změření kalibrační závislosti A vs. c(fenazon) při 460 nm – udělat 3x (15 bodů) • stanovení antipyrinu v neznámém vzorku pozn.: měření absorbance vždy proti slepému vzorku! Postup: kalibrační závislost =z ávislost A = f(c_fenazon) do 50-ml odměrné baňky navažte na analytických vahách 0,20 g fenazonu a rozpusťte ve 30 ml destil. vody. Po rozpuštění doplňte vodou po rysku a promíchejte. Z takto připraveného základního roztoku přesně odpipetujte postupně do pěti 25ml baněk 2,00; 3,00; 5,00; 7,00 a 10,00 ml základního roztoku. Přidejte byretou 5,00 ml roztoku Fe(NO3)3, doplňte vodou po rysku a promíchejte. Porovnávací roztok připravte doplněním 5,00 ml roztoku Fe(NO3)3 ve 25ml odměrné baňce vodou. Změřte absorbanci všech pěti roztoků proti slepému roztoku při vlnové délce 460 nm. Tento postup opakujte 3x (včetně nové navážky) – ověříte si tak přesnost celého postupu. Naměřené hodnoty vyhodnoťte graficky na milimetrový papír. Stanovení obsahu fenazonu v neznámém vzorku do 25ml odměrné baňky kvantitativně převeďte roztok vzorku, přidejte 5,00 ml roztoku Fe(NO3)3, doplňte vodou po rysku a promíchejte. Změřte absorbanci připraveného roztoku proti slepému roztoku při vlnové délce 460 nm. Po skončení všech měření přístroj vypněte, kyvety vyndejte z přístroje, omyjte a osušte. Vyhodnocení: koncentraci neznámého roztoku vzorku fenazonu stanovte odečtením z kalibrační závislosti. Jako výsledek udávejte: mg fenazonu ve vzorku 7 Příloha Komunikační okno pro HP 8453 Úvodní obrazovka softwaru 8 Nastavení módu pro snímání spekter Načtení metody 9 Method setup: počet spektrálních maxim a minim k označení, rozsah měření Výběr vlnových délek k přímému měření absorbance Neshoda v použití zdrojů: pro UV oblast nutno použít Deuteriovou výbojku, pro měření nad 350 nm wolframovou žárovku (Tungsten lamp). 10 Schéma přístroje s oběma světel. zdroji zapnutými a při měření (blanku) Spektru blanku, které bude sloužit jako reference (pro každou vlnovou délku) Dialog pro zadání textového popisu při měření vzorku 11 spectrum/peaks fixed wavelengths dvojklik na spektrum Dialog před ukončením činnosti softwaru.