PPřřirozenirozenéé antioxidaantioxidaččnníí systsystéémymy Antioxidační enzymy, nízkomolekulové antioxidanty PharmDr. JPharmDr. Jáán Vann Vanččo, Ph.D.o, Ph.D. ÚÚstav chemických lstav chemických lééččiv, FaF VFU Brnoiv, FaF VFU Brno AntioxidaAntioxidaččnníí ochrannochrannéé systsystéémymy • Tvoří spolupracující a vzájemně propojený systém • Narušení funkce jedné části systému je možné kompenzovat zvýšením aktivity jiné části systému Dle funkce je jich možné rozdělit na: 1. Systémy vychytávající, konvertující a detoxikující RONS 2. Systémy zabraňující tvorbě RONS (např. chelatační činidla) 3. Reparační mechanizmy (např. degradace poškozených proteinů, oprava oxidačně poškozených bazí, apoptosa) AntioxidaAntioxidaččnníí ochrannochrannéé systsystéémymy katalasa H2O + 1/2 O2 H2O2 GSH GSSG NADP+ GSHreduktasa NADPH + H+ GSH- peroxidasa H2O Cl- HClO< poškození tkaniva O2 + O2 + 2H+ SOD normální metabolizmus Fe2+ HO O2 - nenasycené mastné kyseliny O2 RO2 ROOH normální metabolizmus 4-hydroxynonenal poškození tkaniva glutathion transferasa a- tokoferol a- tokoferyl)( poškození biomolekul - karotenb - karotenub radikál GSH GS ubichinol ubichinon kyselina askorbová kyselina dehydroaskorbová Fe2+ Fe3+ H2O2 O2 HO O2 - 1 O2 katalasa kyselina a- lipoová kyselina dihydrolipoová GSH GS AntioxidaAntioxidaččnníí ochrannochrannéé systsystéémymy Antioxidační systémy 1.skupiny: • Scavengers (vychytávače) - např. superoxiddismutasa – dismutuje superoxid na dikyslík a peroxid vodíku • Trappers (lapače) – např. vit. E vytváří s hydroxylem stabilní radikál • Quenchers (zhášeče) – např. b-karoten zháší singletový kyslík AntioxidaAntioxidaččnníí ochrannochrannéé systsystéémymy Antioxidační systémy 2.skupiny: • látky vytvářející redoxně stabilní komplexy s Cu(II) a Fe(II), např. transferin, albumin, desferroxamin • inhibitory enzymů vytvářející volné radikály, např. inhibitory xantinoxidasy, která katalyzuje tvorbu superoxidu ze xantinu nebo hypoxantinu • enzymy odstraňující peroxidy, např. katalasa nebo peroxidasy, zabraňují tak vzniku hydroxylu Fentonovou reakcí AntioxidaAntioxidaččnníí ochrannochrannéé systsystéémymy Antioxidační systémy 3.skupiny: • lipofilní enzymy, např. fosfolipasa A odštěpuje oxidačně poškozené mastné kyseliny • proteolytické enzymy, které rozkládají poškozené proteiny • reparační systémy pro opravu oxidačně poškozené DNA, např. reparační endonukleasy AntioxidaAntioxidaččnníí ochrannochrannéé systsystéémymy Dle molekulové hmotnosti je jich možné rozdělit na: • Antioxidanty vysokomolekulové – enzymové – neenzymové • Antioxidanty nízkomolekulové – přírodní – syntetické Dle místa účinku a nejčastějšího výskytu je jich možné rozdělit na: • cytoplazmatické (hydrofilní) • membránové (lipofilní) AntioxidaAntioxidaččnníí ochrannochrannéé systsystéémymy Dle distribuce v různých orgánech: • vysoká koncentrace kyseliny L-askorbové je v oku (až mM koncentrace), kde hraje úlohu nejdůležitejšího antioxidantu v ochraně před peroxylovými radikály a dalšími ROS (doprovodními a regeneračními antioxidačními systémy jsou b-karoten a GSH) • vysoká aktivita GSH dependentního antioxidačního a biotransformačního systému (g-glutamyltransferasa, GPx) je v játrech • biologicky determinovaná koncentrace antioxidantů – např. kyselina močová v ledvinách (až 10-násobně vyšší koncentrace jako v jiných tělních tekutinách) AntioxidaAntioxidaččnníí enzymyenzymy Superoxiddismutasy • skupina enzymů katalyzujících dismutaci superoxidu na kyslík a peroxid vodíku • metaloenzymy - obsahují různé ionty kovů v aktivních centrech – Cu,Zn-SOD (SOD-1, EC-SOD) – Mn-SOD (SOD-2) – Fe-SOD – mutantní SOD Cu,Cu,ZnZn--superoxiddismutasasuperoxiddismutasa Struktura: Cu,Cu,ZnZn--superoxiddismutasasuperoxiddismutasa Mechanizmy dismutace: - redoxní - neredoxní Cu(II) + O2 Cu O2 Cu O2 + O2 Cu O2 2+ O2 Cu(II) + H2O2 2H+ O2 MnMn(III)(III)--superoxiddismutasasuperoxiddismutasa Struktura: MnMn(III)(III)--superoxiddismutasasuperoxiddismutasa Výskyt: mikroorganismy, mitochondrie – v souladu s endosymbiotickou teorií původu mitochondrií Mechanizmus dismutace: -redoxní Mn(III) + O2 -. ↔ [Mn(III)-O2 -.] → Mn(II) + O2 Mn(II) + O2 -. ↔ [Mn(II)-O2 -.] → Mn(III) + H2O2 FeFe(III)(III)--superoxiddismutasasuperoxiddismutasa Struktura: FeFe(III)(III)--superoxiddismutasasuperoxiddismutasa Výskyt: mikroorganismy E.coli, B.cereus; nenachází se v živočišných buňkách Mechanizmus dismutace: -redoxní Fe(III) + O2 -. ↔ [Fe(III)-O2 -.] → Fe(II) + O2 Fe(II) + O2 -. ↔ [Fe(II)-O2 -.] → Fe(III) + H2O2 KatalasaKatalasa Struktura: Aktivní centrum: U mikroorganismů se vyskytuje také tzv. pseudokatalasa, která obsahuje v aktivním centru mangan KatalasaKatalasa Výskyt: u všech aerobních organismů, u člověka je nejvyšší aktivita katalasy v játrech a erytrocytech Mechanizmus rozkladu H2O2: -na rozdíl od peroxidas, reaguje přímo s peroxidem vodíku -peroxidasy využívají peroxid vodíku k oxidaci jiného substrátu PorFe(III) + H2O2 → PorFe(IV)=O+. + H2O PorFe(IV)=O+. + H2O2 → PorFe(III) + H2O + O2 compound I compound I PeroxidasyPeroxidasy Model krystalové struktury laktoperoxidasy s přiblížením aktivního místa enzymu s navázaným oxidovaným produktem HOSCN Lit.: Singh, A.K. et al. Crystal Structure of bovine lactoperoxidase with iodide ions at 2.9A resolution. To be Published. PDB code 2NQX PeroxidasyPeroxidasy –– mechanismusmechanismus úúččinkuinku compoundcompound II compoundcompound IIIIAA BBCC A:A: B:B: compoundcompound IIII C:C: Lit.: Heinecke J.W. Toxicology 177, 11-22 (2002); Arnhold J. et al. Eur. J. Inorg. Chem. 3801–3811 (2006). GlutathionperoxidasyGlutathionperoxidasy ((GPxGPx)) Struktura: v aktivním centru obsahuje atom selenu v aminokyselině selenocystein Výskyt: jenom u živočichů, u člověka je nejvyšší aktivita GPx v játrech, krvi a ledvinách, nižší aktivita je v erytrocytech a oční čočce. Mechanizmus účinku: -peroxidasa využívá peroxid vodíku k oxidaci glutathionu (GSH) na jeho oxidovanou formu (GSSG) protein-Se- + ROOH + H+ → ROH + protein-SeOH (selenová kyselina) protein-SeOH + GSH → protein-Se-SG + H2O protein-Se-SG + GSH → protein-SeH-GSSG → protein-Se- + H+ + GSSG H2O2 + 2 GSH → GSSG + 2 H2O LOOH + 2 GSH → GSSG + H2O + LOH GlutathionperoxidasyGlutathionperoxidasy ((GPxGPx)) Další biologicky významné peroxidasy: Cytochrom c peroxidasa – vyskytuje se v mitochondriích a některých bakteriích NADH-peroxidasa Askorbátperoxidasa GlutathionreduktasaGlutathionreduktasa Struktura: Výskyt: u živočichů i mikroorganismů, u člověka je nejvyšší aktivita v orgánech kde je vysoká aktivita GPx. Katalyzuje reakci: GSSG + NADPH + H+ → 2GSH + NADP+ GlutathionGlutathion--SS--transferasatransferasa (GST)(GST) Význam: má velký význam při detoxikaci xenobiotik a produktů oxidačního poškození biomolekul, např. konjuguje s 4-hydroxy-non-2-enálem (4-HNE). Katalyzuje reakci: GSH + RX → RSG + HX AntioxidaAntioxidaččnníí systsystéémy 3.skupinymy 3.skupiny –– oprava modifikacoprava modifikacíí DNADNA LONGLONG--TERM CONSEQUENCESTERM CONSEQUENCES Ageing Cancer Disease DNA REPAIR MECHANISMSDNA REPAIR MECHANISMS SHORTSHORT--TERM CONSEQUENCESTERM CONSEQUENCES ABNORMAL GROWTH & METABOLISM PHYSIOLOGICAL DYSFUNCTION CELL DEATH Decreased cellular proliferation Defective signalling pathways Impaired protein/ gene expression Genomic instability DNA DAMAGE AntioxidaAntioxidaččnníí systsystéémy 3.skupinymy 3.skupiny –– oprava modifikacoprava modifikacíí DNADNA Význam • zábrana mutacím neslučitelných s životem, • zabezpečení produkce plně funkčních proteinů transkripcí, • modifikace epigeneticky podmíněné regulace transkripce, • prevence karcinogeneze a geneticky podmíněných ochoření Různé mechanizmy jsou zprostředkovány specifickými enzymy, napojenými na enzymy obecné syntézy DNA Základní typy oprav DNA: 1. přímá místní modifikace – cílená modifikace oxidačního poškození, nejčastěji u dimerů vzniklých působením UV-záření (světlem reaktivovaná fotolyasa) nebo methylovaných míst (v poloze 5-methylovaný cytosin a v poloze 6-N-methylovaný adenin) jsou demethylovány pomocí místně specifických enzymů (DNA-demethylas) Oprava modifikacOprava modifikacíí DNADNA Základní typy oprav DNA: 2. BER – Base excission repair (vystřihnutí jediné bázy) se uplatňuje • u lézí malých rozměrů, obvykle 1-2 bázy vedle sebe • u abázických míst a jednořetězcových zlomů • v prvním kroku je specifickou glykosylasou odštěpená poškozená báze • pak je pomocí b-lyasy a AP endonukleasy odštěpená deoxyribosa a komplementární báze je pak připojená DNA-polymerasou a řetězec je skompletován DNA-ligasou ROS C 8-oxoGA TC OH Bi-functional glycosylase C A TC OH 3’ b-lyase 8-oxoG HO C A TC OH G CT AG HO G CT AG HO G CT AG HO C A TC OH G CT AG HO APE dGTP DNA Polb XRCC1 C GA TC OH DNA ligase IIIa G CT AG HO O OO N N N N O N O H H P O O O O O N N N O P O O O H H P O O O 8-oxoguanine ReactiveOxygenSpeciesDamage hAPE: d-elimination hOGG1: b-lyase hOGG1: glycosylase Nucleic Acids H H hAPE/HAP1/REF1: human apurinic/apyrimidinic endonuclease Oprava modifikacOprava modifikacíí DNADNA Základní typy oprav DNA: 3. NER – Nucleotide excission repair (vystřihnutí nukleotidu/ů) se uplatňuje • u lézí větších rozměrů, ovlivňujících zejména tvar molekuly DNA • je záložním systémem pro BER • NER začíná rozdělením poškozeného vlákna DNA na dvou místech (směrem 5´ i 3´ od místa poškození DNA) ATP-dependentní nukleasou a uvolní se oligomer dlouhý 24-29 nukleotidů • vzniklá díra je vyplněná komplementárními bázemi DNA-polymerasou a řetězec je obnovený DNA-ligasou3 ’ 5 ’ 5 ’ 3 ’ ‘Repair synthesis’: dNTP’s, PCNA, RFC, RPA, DNA Pol d/e, XRCC1 3 ’ 5 ’ 5 ’ 3 ’ DNA ligase 24-29mer repair product 5 ’ 3 ’ XPGXPF XP A TFII H RP A 3 ’ 5 ’ Global Genomic Transcription- coupled 5 ’ 3 ’ 3 ’ 5 ’ XPC:hHR23 B 5 ’ 3 ’ 3 ’ 5 ’ RNA Pol II C S A C S B 5 ’ 3 ’ 3 ’ 5 ’ Bulky lesion ‘DNA unwinding’: XPB, XPD ThioredoxinThioredoxin Výskyt: polypeptid s Mr = 12000, vyskytuje se u eukarytů i prokaryotů; obsahuje dvě sousedící –SH skupiny cysteinů, které můžou být oxidovány za vzniku disulfidického můstku Význam: je kofaktorem mnohých reparačních enzymů, např. methioninsulfoxidreduktasy nebo na thioredoxinu závislé alkylhydroperoxidreduktasy. Účastní se reakce: thioredoxin-(SH)2 + protein-S-S → thioredoxin-S-S + protein-(SH)2 - do původního redukovaného stavu se dostává také pomocí enzymu thioredoxinreduktasy, která obsahuje FAD a je závislá na NADPH; strukturně i mechanismem je podobná glutathionreduktase thioredoxin-S-S + NADPH + H+ → thioredoxin-(SH)2 + NADP+ VysokomolekulovVysokomolekulovéé chelatachelataččnníí ččinidlainidla Vážoucí Fe(II) a Fe(III): • Transferin – vazbová kapacita 20-30%, obvykle váže ióny Fe(III) z transferinu, zabraňuje vzniku hydroxylu a peroxidaci lipidů • Laktoferin – uvolňuje se degranulací PMN leukocytů, obvykle váže Fe(III), zabraňuje vzniku hydroxylu a lipoperoxidaci • Haptoglobin – váže hemoglobin a met-hemoglobin a vylučuje je z radikálových reakcí • Hemopexin – má vysokou afinitu k hemu, inhibuje lipoperoxidaci • Albumin – má vysoké zastoupení v krvi (50g/l), váže Fe(II) i Cu(II), ale nezabraňuje tvorbě HO., díky lokálnímu účinku hydroxylu se řadí mezi sebeobětující antioxidanty (self-sacrificing antioxidants) • Ceruloplasmin – vykazuje ferrooxidasovou aktivitu (oxiduje Fe(II) na Fe(III)), napomáhá reinkorporaci Fe(III) do ferritinu, reaguje přímo se superoxidem, ale nedismutuje ho!, navázané ionty Cu(II) a Cu(I) nezpůsobují tvorbu hydroxylu • Siderofory a Hepcidin – siderofory jsou tvořeny mikroorganismy pro přímé získávání železa z lidského organismu, hepcidin těmto mechanismům brání, je syntetizován v játrech a vylučován močí, obsahuje 8 Cys z 20-25 aminokyselin VysokomolekulovVysokomolekulovéé chelatachelataččnníí ččinidlainidla Vážoucí Cu(II) a Cu(I): • Albumin – má vysoké zastoupení v krvi (50g/l), váže Fe(II) i Cu(II), ale nezabraňuje tvorbě HO., díky lokálnímu účinku hydroxylu se řadí mezi sebeobětující antioxidanty (self-sacrificing antioxidants) • Ceruloplasmin – vykazuje ferrooxidasovou aktivitu (oxiduje Fe(II) na Fe(III)), napomáhá reinkorporaci Fe(III) do ferritinu, reaguje přímo se superoxidem, ale nedismutuje ho!, navázané ionty Cu(II) a Cu(I) nezpůsobují tvorbu hydroxylu CP-Cu(II) + 4 Fe(II) → CP-Cu(I) + 4 Fe(III) CP-Cu(I) + O2 + 4H+ → CP-Cu(II) + 2H2O • Metalothioneiny – MT-I a MT-II v tkáních, MT-III v mozku; obsahují 23-33% sirné aminokyseliny cysteinu, vážou celou řadu těžkých kovů (5-7 iontů na molekulu), reagují se singletovým kyslíkem a hydroxylem za vzniku thiylových RS. radikálů, které se detoxikují dimerizací nebo GSH • Fytochelatiny – vyskytují se v rostlinách a plní pravděpodobně funkci metalothioneinu NNíízkomolekulovzkomolekulovéé, v lidsk, v lidskéém tm těěle syntetizovanle syntetizovanéé antioxidantyantioxidanty Glutathion (GSH) • složení • reaguje s hydoxylovými radikály, HOCl, peroxynitritem, alkylhydroxylmi a alkylperoxylmi, C-radikály, oxidem dusnatým a singletovým kyslíkem R. + GSH → GS. + RH GS. + GS. → GSSG GS. + GS- → GSSG-. GS. + O2 → GSOO. GSH + NO → GSNO NNíízkomolekulovzkomolekulovéé, v lidsk, v lidskéém tm těěle syntetizovanle syntetizovanéé antioxidantyantioxidanty Bilirubin • koncový produkt degradace hemu u člověka • váže se s albuminem a chrání ho a navázané mastné kyseliny před oxidačním poškozením • je výrazným vychytávačem peroxylových radikálů a singletového kyslíku a-Keto kyseliny • ketokyseliny jako pyruvát nebo a-ketoglutarát jsou schopny vychytávat peroxid vodíku a pravděpodobně i HOCl a ONOOSteroidní hormony • hormony estradiol, estron a estriol jsou schopny inhibovat lipoperoxidaci (včetně peroxidace LDL) • slouží jako blokátory řetězové reakce lipoperoxidace (reagují s alkylperoxylovými meziprodukty za vzniku stabilnějšího fenoxylového radikálu NNíízkomolekulovzkomolekulovéé, v lidsk, v lidskéém tm těěle syntetizovanle syntetizovanéé antioxidantyantioxidanty Melatonin a serotonin • serotonin blokuje přímo lipoperoxidaci (vytváří stabilný fenoxylový radikál) • melatonin není schopný účinkovat tímto mechanizmem, stimuluje ale produkci antioxidačních enzymů, např. glutathionperoxidasy Kyselina a-lipoová • je silným redukčním činidlem, kofaktorem mnohých enzymů, např. při dekarboxylaci ketokyselin • reaguje a alkylperoxyly, HOCl, hydroxylovými radikály, peroxynitritem a chelatuje Cu(II) i Fe(II) • je schopna redukovat GSSG na GSH, tokoferylový radikál na tokoferol a dehydroaskorbát na kyselinu-L-askorbovou NNíízkomolekulovzkomolekulovéé, v lidsk, v lidskéém tm těěle syntetizovanle syntetizovanéé antioxidantyantioxidanty Koenzym Q (CoQ) • hraje významnou roli v mitochondriálním elektrontransportním řetězci, integruje se do membrán • v biologických systémech vystupuje v redukované formě (ubichinol – CoQH2) a oxidované formě (ubichinon CoQ), meziproduktem jednoelektronové oxidace ubichinolu je semichinon (CoQH.) • reaguje s peroxyly a tím je schopen narušit řetězovou reakci lipoperoxidace RO2 . + CoQH2 → RO2H + CoQH. • je schopen regenerovat tokoferylový radikál na tokoferol a-Toc. + CoQH2 → a-TocH + CoQH. • ubichinon může být regenerován na ubichinol enzymem DT-diaforasou NNíízkomolekulovzkomolekulovéé, v lidsk, v lidskéém tm těěle syntetizovanle syntetizovanéé antioxidantyantioxidanty Kyselina močová • reaguje přímo s hydroxylovými radikály za vzniku stabilnějšího radikálu •je výborným vychytávačen peroxynitritu a reaguje i s peroxidem vodíku a alkylperoxyly Další nízkomolekulové antioxidanty • dipeptidy obsahující histidin – karnosin, homokarnosin a anserin • melaniny – vznikají enzymově i neenzymově z DOPA • aminokyseliny a cystein-obsahující dipeptidy (např. cysteinylglycin) VybranVybranéé nníízkomolekulovzkomolekulovéé antioxidanty zantioxidanty zíískskáávanvanéé z potravyz potravy HO HO HO O O OH - e, -H+ + e, +H+ O HO HO O O- O - e, -H+ + e, +H+ O HO HO O O O kyselina L-askorbová kyselina semidehydroaskorbová kyselina L-dehydroaskorbov Kyselina L-askorbová (vitamin C) • je významným ve vodě rozpustným antioxidantem (reaguje s HO., superoxidem, peroxyly, peroxidem vodíku, singletovým kyslíkem, thiylovými radikály nebo fenoxylovými radikály) •je také význaným kofaktorem mnohých enzymů, např. prolinhydroxylasy, lysinhydroxylasy, dopamin-b-hydroxylasy, je substrátem pro askorbátperoxidasu, NADH-semidehydroaskorbátreduktasu a GSH-závislou dehydroaskorbátreduktasu HO HO HO O O OH O2 + HO + OH - + O HO HO O O O kyselina L-askorbová kyselina L-dehydroaskorbov VybranVybranéé nníízkomolekulovzkomolekulovéé antioxidanty zantioxidanty zíískskáávanvanéé z potravyz potravy Kyselina L-askorbová (vitamin C) • za určitých podmínek může působit také prooxidačně, např. v systému Fe(II)/Fe(III)-H2O2-kyselina askorbová • kyselina L-askorbová výrazně zvyšuje rychlost této reakce, pravděpodobně cyklickou redukcí vznikajících Fe(III) na Fe(II) •je tu terapeutické riziko pro pacienty léčeny železnatými solemi v kombinaci s vitaminem C O HO HO O OO HO HO HO O O OH O HO HO O O O +2 kyselina semidehydroaskorbová kyselina L-askorbová kyselina L-dehydroaskorbov VybranVybranéé nníízkomolekulovzkomolekulovéé antioxidanty zantioxidanty zíískskáávanvanéé z potravyz potravy Tokoferol (vitamin E) • je nejvýznamnějším vychytávačem peroxylových radikálů v membránach • tím přerušuje řetězovou reakci peroxidace membránových lipidů O C16H30 HO + O2 - O C16H30 O a-tokoferol a-tokoferylový radikál