PharmDr. JPharmDr. Jáán Vann Vanččo, Ph.D.o, Ph.D. ÚÚstav chemických lstav chemických lééččiv, FaF VFU Brnoiv, FaF VFU Brno Metody stanovenMetody stanoveníí antioxidaantioxidaččnníí aktivityaktivity Obecné metody hodnocení antioxidační aktivity a antioxidačního stavu biologických systémů, stanovení biomarkerů oxidačního stresu Metody hodnocení celkové antioxidační kapacity • mají využití při nespecifickém popisu stavu antioxidačních ochranných systémů • jsou využitelné jak pro čisté látky, tak pro směsi a biologické vzorky, např. plasma • pro lokalizaci oxidačního stresu v organismu je možné využít přímé i nepřímé metody detekce volných radikálů Přímé metody lokalizace oxidačního stresu v organismu • nejperspektivnějším se ukazuje využití neinvazivní techniky 3D-ESR (EPRI) Přímé metody lokalizace oxidačního stresu v organismu • interpretace výsledků měření Přímé metody lokalizace oxidačního stresu v organismu Příklady využití EPRI – detekce RONS při ischemickoreperfusním poškození tkáně Příklady využití EPRI – průchod značeného léčiva kůží Příklady využití EPRI – neinvazivní oximetrie v orgánech metoda MRI-EPRI co-imaging Ftalocyanát dilithný (PcLi2) Nepřímé metody hodnocení celkové antioxidační aktivity Nepřímé metody hodnocení celkové antioxidační aktivity kyselina a-parinarová phycoerytrobilin – typický chromofór v štruktúre b-phycoerytrinu (Mr=240 kDa) Nepřímé metody hodnocení celkové antioxidační aktivity ABTS Nepřímé metody hodnocení celkové antioxidační aktivity antioxidanty Nepřímé metody hodnocení celkové antioxidační aktivity Metoda zhMetoda zhášášeneníí ABTSABTS –– principy, pouprincipy, použžititíí Zhodnocení výsledků – pro větší skupinu látek je možné srovnávat %poklesu absorbance při stejné koncentraci, srovnání směrnic přímky, propočet na ekvivalent standardnekvivalent standardnííhoho antioxidantuantioxidantu Nepřímé metody hodnocení celkové antioxidační aktivity Metoda zhMetoda zhášášeneníí ABTSABTS –– screeningscreening antioxidaantioxidaččnnííchch schopnostschopnostíí smsměěssíí (on(on--line)line) - výhody – RP-HPLC analýza vhodná pro identifikaci složek směsí - post-kolonovou derivatizací je umožněná on-line identifikace aktivních látek Zhodnocení výsledků – antioxidační profil směsi a konkrétního antioxidantu ve směsi, propočet na ekvivalent standardnekvivalent standardníího antioxidantu (kyselinyho antioxidantu (kyseliny gallovgallovéé)) Ref.: Pazourek J., Václavík J., Žemlička M. Food Chem. 125, 785-790 (2011). Nepřímé metody hodnocení celkové antioxidační aktivity TRAP assay – Total peroxide radical-trapping antioxidant parameter • jedna z nejčastěji používaných metod • jako zdroje volných peroxylových radikálů se používají AAPH, ABAP, AMVN, které se samovolně rozkládají za vzniku radikálu • jako substrát se nejčastěji používá kyselina linoleová, jako kalibrant Trolox • vyhodnocuje se čas potřebný na dosažení maximální spotřeby kyslíku v roztoku Uninhibited reaction Nepřímé metody hodnocení celkové antioxidační aktivity ECL assay – Enhanced chemiluminiscence method • chemiluminiscence je kontinuálně produkována v systému HRP-H2O2-luminol • látky schopné zhášet radikály způsobí pokles nebo úplné vymizení luminiscence na čas, který je závislý na jejich antioxidační aktivitě Další metody hodnocení celkové antioxidační aktivity FRAP assay • je založena na měření schopnosti testovaných látek poskytovat elektrony a redukovat činidlo (železitý komplex tripyridyltriazinu) na intenzivně modře zbarvený železnatý komplex (abs. maximum při 593 nm) OPD assay • činidlo, o-fenylendiamin je substrátem peroxidas a jejich působením se mění na barevnou radikálovou formu (obdoba semichinonu), který vykazuje absorpci při 430 nm Plasma peroxidation potential assay • je založena na sledování produkce TBARS po přidáni systému generujícího hydroxylový radikál Fentonovou reakcí ke vzorku plasmy Další metody hodnocení celkové antioxidační aktivity Metoda zhMetoda zhášášeneníí DPPHDPPH –– princip, pouprincip, použžititíí - spektrofotometrická metoda (520 nm) - velice výhodná pro rychlý screening - účinné látky obvykle obsahují lehko abstrahovatelný vodík Zhodnocení výsledků – pro větší skupinu látek možné srovnat %poklesu absorbance při stejné koncentraci, srovnaní kinetických parametrů, propočet na ekvivalent standardnekvivalent standardnííhoho antioxidantuantioxidantu (L-ASC) Další metody hodnocení celkové antioxidační aktivity Neinvazivní metoda analýzy plynů ve vydechovaném vzduchu • je založena na měření koncentrace alkanů a alkenů, vznikajících zejména degradací lipidů pomocí GC-MS, metoda je využitelná i pro perfundované izolované orgány Další metody hodnocení celkové antioxidační aktivity Neinvazivní metoda analýzy plynů nad perfundovaným orgánem Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Hydroxylový radikál Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Hydroxylový radikál Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Hydroxylový radikál •detekce spin-trapového produktu reakce DMPO (5,5-dimethylpyrrolinN-oxid) pomocí ESR •vyhodnocení – kvalitativní nebo kvantitativní na základě intenzity signálu •vhodné jako relativní metoda Přímé a nepřímé metody hodnocení antioxidační aktivity Oxid dusnatý Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Oxid dusnatý Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Oxid dusnatý Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Oxid dusnatý Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Superoxid, metody stanovení SOD-aktivity • zdroje: chemické – KO2, N(Bu)4O2, crown étery, UV-fotolýza ethanolických roztoků, elektrochemická produkce, autooxidace flavinů, epinefrinu, pyrogalolu a NADH oxidace fenazin methosulfátem, biologické – aktivované neutrofily • detekční systémy • přímé – pulsní radiolysa, rapid-freeze EPR, stoped flow-spectroscopy, polarografické techniky, 19F-NMR, cyklická voltametrie • nepřímé – redukce cytochromu c, redukce tetrazoliových barviv, redukce nitromethanu, spektrální analýza produktů autooxidace epinefrinu, pyrogalolu, 6hydroxydopaminu, chemiluminiscence luminolu, tvorba nitritů z chloridu hydroxylamónia • biologické – geneticky modifikované kmeny Salmonela sp., nebo Escherichia sp. Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Superoxid, metody stanovení SOD-aktivity Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Superoxid, metody stanovení SOD-aktivity N N NN NO2 I +e- (O2 -.) -e- N N NN NO2 IINT+ INT + e-, H+ - e-, H+ N N NH N NO2 I formazán 2-(4-jódfenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-fenyltetrazól-2-ium Nepřímé metody specifického hodnocení antioxidační aktivity Peroxynitrit • zdroje: chemické – systém okyselený peroxid vodíku+NaNO2+ rychlá úprava pH přídavkem NaOH a odstranění nadbytku H2O2 pomocí MnO2, Angeliho sůl • detekční systémy •nepřímé – nitrace/hydroxylace cílových molekul, např. fenylalalnin, tyrosin, proteiny, aminokyseliny • biologické – specifické protilátky vůči nitrovaným proteinům