ANTIOXIDANTY A VOLNÉ RADIKÁLY Detekce volných radikálů Rozdělení metod • Metody fyzikálně – chemické • Metody biochemické • Metody přímé • Metody nepřímé Elektronová paramagnetická rezonanční spektrometrie (EPR, ESR) • Metoda detekující volné radikály • Využívá paramagnetických vlastností volných radikálů • Vzorek je umístěn v silném magnetickém poli a vystaven mikrovlnnému záření • Nepárový elektron je excitován, změní spin a přejde na základní hladinu emisí fotonu • Tyto energetické přechody se projeví jako typický signál na osciloskopu Magnetické pole Energie Spin Mikrovlnné záření konsola s detektorem elektromagnety vzorek zdroj mikrovlnného záření počítač Spin trapping • K prodloužení životnosti radikálů slouží záchyt radikálů do stabilnějšího aduktu s vhodnou sloučeninou • Nejčastěji se využívá 5,5-dimethyl-1-pyrrolin-N-oxid (DMPO) a 2,2,6,6-tetramethylpiperidin-1-oxyl (TEMPO) • Lze využít i k detekci biologickém prostředí • Nevýhodou je jedovatost detektorových látek, nelze užívat v klinice EPR spektrum aduktu hydroxylového radikálu s DMPO Gue Q. et al.: ESR study on the structure antioxidant activity relationship of tea catechins and their epimers. Biochim. Biophys. Acta 1427,1999 13- 23 - . . DMPO-EGCG adukt EPR spektrum aduktu superoxidu s DMPO. Adukt s hydroxylovým radikálem se formuje jeho rozpadem. Jeho zhášením vzniká adukt DMPO s EGCG radikálem. Plant, Cell and Environment (2004), 27, 1415–1423 Gunera magellanica Lam. askorbyl radikál Lohan B.S. et al.: Determination of the Antioxidant Status of the Skin by In Vivo-Electron Paramagnetic Resonance (EPR) Spectroscopy. Cosmetics 2015, 2, 286-301 Junwang G. et al.: PLoS ONE 2014 nádor Elektrochemické měření ROS/RNS • Elektrochemie se zabývá studiem elektrochemického chování vzorku v závislosti na jeho složení a koncentraci • Využívají se elektrochemické elektrody – minisenzory • Lze využít v biologických systémech k detekci RNOS Pt katoda Ag anoda senzor https://www.wpiinc.com/blog/2013/04/24/vi deos/how-to-calibrate-an-iso-hpo100/ https://www.youtube.com/watch?v=6GzNh 0XRfq8 Luminiscenční sledování ROS/RNS • Luminiscence vzniká excitací atomu a následným návratem do základního stavu, čímž dojde k vyzáření fotonu • Používá se velmi často v biologickém materiálů • Existuje celá řada luminoforů pro různé reaktivní formy kyslíku a dusíku • Detekujeme pomocí luminometrů, fluorescenční mikroskopií nebo elektrochemicky • Chemiluminiscence • Fotoluminiscence - fluorescence • K detekci ROS/RNS a hodnocení antioxidační aktivity látek Systémy generující ROS/RNS • Xanthin/xanthinoxidasa superoxid • Peroxid vodíku + přechodné kovy hydroxyl • Peroxid vodíku H2O2 • AAPH peroxyl (2,2´-azo-bis(2-amidinopropan) dichlorid • SIN-1 (3-morfolino-sydnonimin) peroxynitrit • Nitroprusid sodný NO molsidomin superoxid NO peroxynitrit Chemiluminiscence Detekce ROS – luminol NH NH NH2 O O NH2 O O N N NH2 N N O O NH2 O O N N O OO O O O NH2 O O O O NH2 2 OH . - - dianion O2 dianion endoperoxid 3-aminoftalát (exitovaný stav) + N2+ foton stabilizovaný stav * ROS/RNS luminol Detekce peroxidu vodíku, superoxidu - lucigenin Free Rad Biol Med (2010), 48, 983-1001 dihydroethidium 2-OH-ethidium Fluorescence Detekce superoxidu – dihydroethidium fluorescenční mikroskopie elektrochemická detekce Detekce ROS - dichlorofluorescin kontrola oxidační stres Dichlorofluorescin diacetát vstup do buňky estrasy bez fluorescence ROS fluorescence Aromatická hydroxylace jako ukazatel tvorby hydroxylového radikálu in vivo k. acetylsalicylová Cholin salicylát k. salicylová katechol k. 2,3-dihydroxybenzoová k. 2,5-dihydroxybenzoová glukuronid glukuronid konjugát s glycinem konjugace hydroxylace • Stanovení v biologickém materiálu pomocí HPLC elektrochemická detekce fenylalanin o-tyrosin m-tyrosin Metody nepřímé – měření produktů oxidačního stresu • Stanovení produktů lipoperoxidace konjugovaný dien Metody nepřímé – měření produktů oxidačního stresu • Stanovení produktů lipoperoxidace (LP) – Stanovení konjugovaných dienů spektrofotometricky (210 nm) – Stanovení 4-hydroxy-2-nonenalu spektrofotometricky (370 nm) nebo HPLC - elektrochemická detekce – Stanovení vydechovaných těkavých uhlovodíků (etan, propan) plynovou chromatografií – Stanovení produktů LP IČ spektroskopií HPLC detekce aldehyd keton 2,4-dinitrofenylhydrazinem DNPH-konjugát R R1 Stanovení MDA kyselinou thiobarbiturovou TBA MDA spektrofotometrické stanovení (532 nm) Patton, S. and G. W. Kurtz. 2-Thiobarbituric acid as a reagent for detecting milk fat oxidation. J. Dairy Sci. 34:669–674.1951. Metody nepřímé – měření produktů oxidačního stresu • Stanovení oxidačně poškozených proteinů (spektrofotometricky, 370 nm) • Techniky molekulární biologie lipoperoxidace karbonyl 2,4-dinitrofenylhydrazin Metody nepřímé – měření produktů oxidačního stresu • Stanovení oxidačně poškozených sacharidů • Stanovení oxidačně poškozených NK – HPLC - elektrochemická detekce, ELISA metody ROS poškození DNA oxidační stres ROS antioxidanty dG 8-OH dG