Stanovení antioxidační aktivity Jiří Václavík Mechanismus účinku antioxidantů Radikálové reakce ● Iniciace LH + R∙ → L∙ + RH ● Propagace L∙ + O2 → LOO∙ peroxylový radikál LOO ∙ + LH → L∙ + LOOH peroxid ● Řetězení LOOH → LO∙ + HO∙ alkoxylový radikál 2 LOOH → LOO ∙ + LO∙ + H2O ● Terminace LO ∙ + LO ∙, LOO ∙ + LOO ∙, LO ∙ + LOO ∙ Mechanismus účinku antioxidantů Radikálové reakce ● Primární antioxidanty - AH ● L ∙ + AH → LH + A∙ ● LOO∙ + AH → LOOH + A∙ ● LO∙ + AH → LOH + A∙ Spektrometrie Elektrochemická detekce Chromatografie Způsoby detekce Stanovení antioxidační aktivity Spektometrie - kolorimetrie ● DPPH∙ Organický radikál 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ● ABTS+ ∙ Organický radikál 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) ● FRAP Reakce s Fe(III) Ferric reducing ability ● CUPRAC Cu(II) → Cu(I) Cupric reducing antioxidant power Stanovení antioxidační aktivity Spektrometrie – Fluorescence, chemiluminiscence ● ORAC Peroxylový radikál ● HORAC Hydroxylový radikál ● TRAP Luminol Stanovení antioxidační aktivity Chromatografie ● GC Plynová chromatografie ● HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie ● HPLC + Postkolonová derivatizace Stanovení antioxidační aktivity Elektrochemické stanovení ● Cyklická voltammetrie ● Amperometrie ● Biamperometrie Spektrometrie Reader Spektrometrie DPPH – 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ● Stabilní radikál v důsledku delokalizace elektronu přes celou molekulu ● Nedimerizuje ● Delokalizace způsobuje fialové zbarvení ● Reakce s donory vodíku → žluté zbarvení ● Standard Trolox Spektrometrie DPPH – 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl Spektrometrie ABTS ● ABTS - (2,2’-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6sulphonic acid)) ● Radikál generován ztrátou elektronu ● Oxidace peroxodisíranem sodným nebo oxidem manganičitým ● Zelené zbarvení ● Standard Trolox Spektrometrie ABTS ABTS - (2,2’-azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6sulfonová kyselina)) Spektrometrie ABTS - spektrum Spektrometrie ABTS – průběh generování radikálu Spektrometrie FRAP ● Ferric reducing antioxidant power ● Fe(III) → Fe(II) komplex ● Ligand 2,4,6-tri(2-pyridyl)- 1,3,5-triazine ● Fe(II) komplex - námořní modrá ● Standard Trolox nebo askorbová kyselina Spektrometrie FRAP – ligand 2,4,6-tri(2-pyridyl)- 1,3,5-triazin Spektrometrie PFRAP ● Potassium ferricyanide reducing power ● Atioxidat reaguje s ferrikyanidem draselným → ferrokyanid draselný ● Následná reakce s FeCl3 → ferrokyanid železitý modrý komplex Spektrometrie CUPRAC ● Cupric reducing antioxidant power ● Cu(II) → Cu(I) ● CuSO4 a neocuproine ● Absorbance v 450nm ● Standard Trolox Spektrometrie CUPRAC – neocuproine Spektrometrie Stanovení antioxidačních enzymů ● Superoxiddizmutáza sledování úbytku superoxidu spektrofotometricky 245-250nm ● Glutathion peroxidáza spektrofotometrie měření spotřeby NADPH při redukci GSSH ● Kataláza sledování úbytku H2O2 spektrofotometricky 240nm Spektrometrie Fluorimetrie ● Fluorescence je emise světla látkou, která absorbovala elektromagnetickou vlnu jiné vlnové délky ● Emitované světlo má obvykle delší vlnovou délku ● Fluorescence - elektron v molekule přechází do stavu s nižší energií Spektrometrie Fluorescein Spektrometrie Fluorescein Spektrometrie ORAC ● Oxygen radical absorption capacity ● Indukovaný peroxylový radikál pomocí AAPH 2,2’-azobis-(2-amidino-propane) dihydrochloride ● Fluorescein - fluorescenčí indikátor ● Ztráta fluorescece – indikuje stupeň rozkladu v důsledku reakce s radikálem ● Standard Trolox Spektrometrie AAPH – 2,2’-azobis-(2-amidino-propane) dihydrochlorid Spektrometrie HORAC ● Hydroxyl radical averting capacity ● Stanovuje schopnost antioxidatů chelatovat kovové ionty ● Co(II) komplex – protekce proti hydroxylovému radikálu – Reakce Fentonova typu ● Fluorescein – indikátor ● Standard - Gallová kyselina Spektrometrie TRAP ● Total peroxyl radical trapping antioxidant parameter ● Chemiluminiscece (CL) - luminol ● CL – luminol - radikál generovaný AAPH 2,2’-azobis-(2-amidino-propane) dihydrochlorid ● Doba zhášení CL signálu Spektrometrie Luminol Spektrometrie The lipid peroxidation inhibition assay ● Reakce Fentonova typu (Co(II) + H2O2), indukující lipoperoxidaci ● Linolenová kyselina – modelový substrát ● Malondialdehyd MDA – konečný produkt lipoperoxidace ● Thoibarbiturová kyselia s MDA dává fluoreskující produkty Spektrometrie Thiobarbiturová kyselina Elektrochemické stanovení Cyklická voltammetrie ● Potenciodynamické měření ● Potenciál na pracovní elektrodě se mění lineárně ● Poté se napětí mění zpět Elektrochemické stanovení Cyklická voltammetrie Elektrochemické stanovení Cyklická voltammetrie Elektrochemické stanovení Cyklická voltammetrie – důležité údaje ● Intenzity katodových a anodových proudů Ia, Ic ● Anodový redoxní poteciál (Ea) ● Katodový redoxní poteciál (Ec) ● Plocha vlny signálu anody (S) ● Standard kyselina askorbová Elektrochemické stanovení Ampérometrie ● Měření intenzity proudu mezi pracovní a referenční elektrodou ● Konstantní napěťový potenciál ● Proud protéká v závislosti a redoxních reakcích v analytu ● Redukce 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl ● (DPPH•) na skleněné elektrodě HPLC HPLC ● Separace na reverzní fázi ● Postkolonová derivatizace ABTS, DPPH ● UV/VIS detekce (DAD) ● Antioxidační aktivita komplexních směsí ● Použitelné pro GSH, tokoferol, askorbát ● Standard trolox, gallová kyselia HPLC HPLC HPLC Děkuji