1_B_Biochemie_FAF2019_Cvičení č-glukosa.docx - 1 Cvičení č.1B: STANOVENÍ KONCENTRACE GLUKOSY TEORETICKÁ PŘÍPRAVA NA CVIČENÍ Glykolýza, hormonální regulace glukosemie, oGTT (orální glukosotoleranční test) – diagnostický význam, glykemická křivka, diabetes mellitus (DM). Znalost principu spektrofotometrického měření (Lambert-Beerův zákon a jeho použití). PRINCIP METODY Stanovení koncentrace glukosy ve vzorku pomocí setu BioSystems je založeno na principu spektrofotometrického stanovení na základě enzymatické reakce. Enzym glukosaoxidasa katalyzuje oxidaci glukosy kyslíkem za vzniku laktonu glukonové kyseliny a peroxidu vodíku. Vzniklý peroxid vodíku je substrátem v navazující reakci katalyzované peroxidasou, v níž je substituovaný fenol a 4-aminoantipyrin oxidačně kopulován na červeně zbarvený produkt, jehož intenzitu lze měřit spektrofotometricky. Intenzita zabarvení je úměrná koncentraci glukosy ve vzorku. glukosaoxidasa glukosa + ½ O2 + H2O → glukonát + H2O2 peroxidasa 2 H2O2 + 4 - aminoantipyrin + fenol → chinonimin + 4 H2O REAGENCIE – složení: Reagent (A) : fosfát 70 mmol/l, fenol 5 mmol/l, glukosaoxidasa > 10U/ml, peroxidasa > 1 U/ml, 4 - aminoantipyrin 0,4 mmol/l, pH = 7,5 Standard (S) : Biosystems (glukosa 100 mg/dl (5,55 mmol/l) nebo jiný. Reagencie jsou připraveny k použití. Vlastní moč (M) - Moč pro analýzu přineste s sebou na cvičení! VZORKY: ÚLOHA 1_A: Analýzu proveďte ve vzorcích vlastní moči a v neznámém vzorku na základě standardu doporučeného ke kalibraci metody na automatických analyzátorech o koncentraci 5,55 mmol/l (pokud není určeno vedoucím jinak). STANDARD je výrobcem dodáván ve vodném roztoku nebo lyofilizovaný a pro použití bude připraven těsně před cvičením rekonstituováním s deionizovanou vodou podle návodu výrobce. Doba exspirace rekonstituovaného standardu bude vyznačena na každé lahvičce. ÚLOHA 1_A: Spektrofotomerické stanovení koncentrace glukosy ve vzorku z jednoho standardu 1. Do stojánku si připravíme dostatečný počet centrifugačních zkumavek (“ependorfek“) a zkumavky označíme. Každý vzorek připravíme dle tabulky do dvou zkumavek pro paralelní stanovení. Pipetujte až na dno zkumavky, zabraňte stékání pipetovaných vzorků nebo činidel po stěnách zkumavek (ztráty kvantity vzhledem k malému objemu vzorků!). 1_B_Biochemie_FAF2019_Cvičení č-glukosa.docx - 2 - 2. Obsah zkumavek dobře promíchejte pomocí vortexu. Nechejte reagovat 10 minut při laboratorní teplotě ( 16-25°C). Po inkubaci proveďte měření obsahu zkumavek na spektrofotometru Hewlett Packard 89090A/HELIOS při vlnové délce 500 nm. Měření proveďte v mikrokyvetách. Zbarvení je stálé nejméně 2 hodiny. Při měření dbejte na čistotu stěn kyvet, případně před vložením do držáku kyvetu vyleštěte. Měření se provádí proti vodě (spektrofotometr je „vynulován“ na kyvetu s vodou). Celý objem zkumavky musíte umístit do kyvety - pipetou. Změřte absorbance blanku (ABl), standardu (ASt), vzorku moči (AVzm), i neznámého vzorku (AVzn) a hodnoty zapisujte do protokolu. Z paralelních hodnot vypočítejte průměry. Proveďte výpočet obsahu glukosy ve vzorku vlastní moči a neznámého vzorku. Výsledek uvádějte vždy s jednotkou (mmol/l). VYHODNOCENÍ - VÝPOČET Pro vyhodnocení všech naměřených výsledků použijeme vzorec: výpočet koncentrace glukosy v moči a neznámého vzorku pomocí standardu ze vztahu: AVzorku - ABlanku ___________ × CSt (Glu) = C glukosy (mmol/l) AStandardu – ABlanku Koncentrace standardu: CSt (Glu) = 5,55 mmol/l (dle vedoucího cvičení) zk Koncentrace Glc Objem vzorku Reagent A A500 Průměr A500 A500 VZ - A500 BLANK 1 Blank (vz. bez analytu) 10 l vody 1000 l 2 3 Standard koncentrace 5,55 mM 10 l 1000 l 4 5 Vzorek moč 10 l 1000 l 6 7 Neznámý vzorek 10 l 1000 l 8 1_B_Biochemie_FAF2019_Cvičení č-glukosa.docx - 3 ÚLOHA 1_B: Stanovení glukosy pomocí diagnostického proužku (SIEMENS - Multistix 10 SG) 1. Ponořte všechny testovací zóny proužku do vzorku moči a poté je okamžitě vytáhněte. 2. Zapněte stopky 3. Porovnejte jednotlivé testovací zóny s barevnými poli na etiketě lahvičky 4. Odečítejte každou zónu po uplynutí doby uvedené na etiketě (glukosa po 30 sec). Držte proužek co nejblíže barevnému poli a porovnávejte pečlivě. Odečet provádějte za dobrého osvětlení. ZÁVĚR: Uveďte výsledek stanovení, porovnejte oba způsoby Do svého protokolu uveďte: princip metody, reakci pomocí strukturních vzorců, Lambert-Beerův zákon, matematické odvození vztahu (1), naměřené hodnoty A, průměry, kalibrační přímku, zhodnocení, porovnání metod, porovnání s atestem a závěr. 1_B_Biochemie_FAF2019_Cvičení č-glukosa.docx - 4 TEORETICKÁ PŘÍPRAVA: Referenční hodnoty – člověk ( na lačno): glykemie (glukosemie): 4,4-6,1 mmol/l - v kapilární krvi , 3,9-5,5 mmol/l - v žilní krvi hypoglykemie: < 3,3 mmol/l hyperglykemie: > 5,5 mmol/l Po jídle nepřevyšuje ve venosní plazmě 11 mmol/l. Netrvá-li toto zvýšení déle než 60 min po příjmu potravy je považováno za fyziologické. POZNÁMKA: Výskyt glukosy v moči U člověka se ztráty glukosy močí větší než 0,72 mmol/24hodin označují jako glykosurie. Glykosurie je nejčastějším nálezem v moči vedoucím k odhalení diabetes mellitus (DM). Glukosa filtrovaná do primární moči z plazmy se aktivním transportem zpětně resorbuje v proximálních tubulech. Organismus si chrání glukosu před zbytečnými ztrátami, proto mají ledvinné tubuly značnou rezervní kapacitu. Za fyziologických okolností je transportní systém vytížen jen asi z jedné třetiny. Při hyperglykemii využití transportního systému stoupá, a překročí-li glykemie (odborně glukosemie = koncentrace glukosy v krvi) hodnoty kolem 10 mmol/l - tzv. ledvinný práh pro glukosu, je kapacita tubulární resorpce překročena a glukosa přechází do moči. Glykosurie je nejčastějším nálezem v moči vedoucím k odhalení DM. Negativní nález glukosy v moči však toto onemocnění nevylučuje. Stanovení glukosy v moči proto nepatří mezi základní biochemické parametry používané pro diagnózu a sledování DM. Nález glykosurie je nutno hodnotit společně s výší glykemie nalačno. Na základě hodnot glykemie rozlišujeme dva typy glykosurie: Hyperglykemická glykosurie - je typickým nálezem při DM. Vyskytuje se u hyperglykemických pacientů s DM. Při déletrvajícím onemocnění se ale zvyšuje renální práh pro glukosu a glykosurie může dokonce i vymizet. Proto jde pouze o orientační vyšetření a nelze podle něho usuzovat na přítomnost nebo nepřítomnost tohoto onemocnění. Přechodně se může vyskytnout i tzv. „alimentární glykosurie” jako důsledek stravy bohaté na sacharidy nebo v průběhu oGTT ( glukoso toleranční test). Normoglykemická renální glykosurie - při ní koncentrace glukosy v krvi není zvýšená. Je důsledkem poruchy ledvinných tubulárních buněk, které zajišťují zpětnou resorpci glukosy. Může být projevem autosomálně recesivního onemocnění a značí zánětlivé nebo jiné poškození ledvin postihující funkci proximálního tubulu. 1_B_Biochemie_FAF2019_Cvičení č-glukosa.docx - 5 - PŘÍLOHA POUŽITÁ ANALYTICKÁ METODA -SPEKTROFOTOMETRIE Analyty v klinické biochemii se nejčastěji stanovují spektrofotometricky, používané přístroje se nazývají spektrofotometry. Spektrofotometrie je analytická metoda založená na interakci elektromagnetického záření s analyzovaným roztokem. Část záření je pohlcena (absorbována) analyzovanou látkou, zbývající záření, které analyzovaným roztokem projde, je detekováno detektorem. Intenzita záření po průchodu vzorkem (I) je menší než původní intenzita záření (I0) do vzorku vstupující: I < I0. Množství pohlceného záření závisí na množství analyzované látky ve vzorku: čím vyšší je koncentrace dané látky, tím více záření je pohlceno. Mnoho látek přítomných v biologických tekutinách (hlavně krvi a moči) je v klinických laboratořích analyzováno spektrofotometricky. Schéma spektrofotometru: Pro spektrofotometrickou analýzu barevných roztoků se používá elektomagnetické záření v oblasti viditelného světla (VIS,  = 400 - 800 nm), zdrojem světla je žárovka. Dále je časté použití ultrafialového záření (UV,  = 190 - 400 nm), kterým můžeme analyzovat i roztoky bezbarvé, zdrojem světla bývá nejčastěji deuteriová výbojka. Každá látka absorbuje záření určité vlnové délky (obsahuje tzv. chromofory schopné toto záření pohltit). Záření určité vlnové délky se označuje jako monochromatické. Získá se rozkladem polychromatického záření (u VIS jde o rozklad bílého světla emitovaného žárovkou) pomocí optické mřížky nebo hranolu. Vhodným nastavením štěrbiny za monochromátorem vstupuje do kyvety jen záření o určité vlnové délce, ostatní vlnové délky se odrážejí pod jiným úhlem. Podle oblasti elektromagnetického záření se volí použité kyvety: skleněné pro VIS, křemenné pro UV oblast (UV záření je sklem pohlcováno); v současné době se používají i speciální plastové kyvety. Principem analýzy prováděné v praktickém cvičení je metoda, která je založena na vzniku barevné látky, můžeme ji stanovit spektrofotometricky ve viditelné oblasti spektra. Doplňkové barvy viditelného světla (viz. také Obr.1): Pokud roztok absorbuje určitou vlnovou délku viditelného spektra (viz. prostřední sloupec tabulky), jeví se nám tento roztok jako barevný. Ostatní vlnové délky roztokem projdou, avšak pozorované zbarvení roztoku je dáno tzv. doplňkovou (komplementární) barvou k barvě pohlcené (viz. sloupec vpravo): zdroj čočka štěrbina monochromátor vzorek v kyvetě detektor II0 1_B_Biochemie_FAF2019_Cvičení č-glukosa.docx - 6 vlnová délka (nm) absorbovaná část VIS spektra komplementární - propuštěná barva (= určuje zbarvení roztoku ) 350 - 430 fialová žlutá 430 - 475 modrá žlutooranžová 475 - 495 zelenomodrá oranžová 495 - 505 modrozelená červenooranžová 505 - 555 zelená červená 555 - 575 žlutozelená purpurová 575 - 600 žlutá fialová 600 - 650 oranžová modrá 650 - 700 červená zelená Příklady:  pokud roztok absorbuje záření mezi 400 a 480 nm (modrofialová), bude propouštět všechny ostatní barvy, které budou okem vnímány jako barva žlutooranžová; znamená to, že žlutooranžová barva je komplementární k barvě modrofialové  pokud necháme procházet bílé světlo roztokem, který absorbuje záření mezi 505 a 555 nm (zelená), propuštěné záření a tudíž i zbarvení roztoku budou vnímány v barvě červené; původní bílé světlo obsahovalo všechny vlnové délky VIS v určitém poměru, tento poměr byl průchodem světla roztokem narušen a světlo tudíž změnilo barvu  pokud necháme procházet červeným roztokem červené světlo, bude toto záření propuštěno, neboť červený roztok červené záření neabsorbuje; naopak zelené záření (zelená je komplementární k červené) bude při průchodu červeným roztokem pohlcováno Obr.1 Komplementární barvy se nacházejí v kolečku naproti sobě Z uvedeného vyplývá, že pro spektrofotometrické stanovení musíme vybrat takovou vlnovou délku, která bude analyzovanou látkou nejvíce pohlcována. Optimální je, pokud je tato vlnová délka současně co nejméně pohlcována ostatními látkami přítomnými v roztoku. Vhodná vlnová délka se zjišťuje před vlastní spektrofotometrickou analýzou: proměří se tzv. absorpční spektrum jako závislost schopnosti absorbovat záření různých, kontinuálně měněných vlnových délek (viz. Obr.2). Pro vlastní analýzu se vybírá vlnová délka, která je analyzovanou látkou nejvíce pohlcována. 1_B_Biochemie_FAF2019_Cvičení č-glukosa.docx - 7 Obr.2 Příklad absorpčního spektra analyzované látky: maximální absorbce byla nalezena kolem 500 nm Princip spektrofotometrie: Při spektrofotometrii vycházíme z Lambert-Beerova zákona, který vyjadřuje vztah mezi koncentrací látky v roztoku a její absorbancí, tj. schopností molekul látky pohlcovat elektromagnetické záření o dané vlnové délce. Při průchodu světelného toku roztokem tak dochází k jeho zeslabení, protože částice látek přítomných v roztoku část elektromagnetického záření pohltí (absorbují). Záření, které projde kyvetou dopadá na detektor, který měří jeho intenzitu. Z tohoto důvodu je zavedena veličina zvaná transmitance (propustnost), která je definována vztahem: T = I / I0 kde I0 = intenzita záření vstupujícího do kyvety; I = intenzita záření po průchodu kyvetou; transmitance (T) nabývá hodnot 0 až 1:nulovou hodnotu má pokud je veškeré záření pohlceno, hodnotu 1 naopak tehdy, pokud kyvetou veškeré záření projde Někdy se transmitance vyjadřuje v procentech: T = (I / I0) x 100 tj. nabývá hodnot 0 až 100 % Množství absorbovaného záření lze vypočítat z hodnoty transmitance: A = - log T = log (1/T)  T = 10-A Veličina A se nazývá absorbace a je definována jako záporně vzatý dekadický logaritmus transmitance. Nabývá hodnot od nuly výše, většinou měříme v rozmezí 0 až 1,5 (nebo méně). Vyšší hodnoty absorbance již bývají málo přesné, měření vždy závisí na citlivosti detektoru (neboť např. A = 2 odpovídá T = 0,01, tj. pouze jedno procento z původní intenzity záření dopadlo na detektor; pro A = 3 je T = 0,001, tj. na detektor dopadá jen 0,1 % z původní intenzity záření). Lambert-Beerův zákon: A = c . l . e nebo T = 10-c.l.e A = absorbance; c = molární koncentrace; l = délka kyvety, resp. tloušťka vrstvy roztoku, kterou prochází záření; e = molární absorpční koeficient (tabelovaná hodnota); T = transmitance; Lambert-Beerův zákon platí pro monochromatické záření a obor nízkých koncentrací, řádově menších než 10-2 mol . l-1. Z Lambert-Beerova zákona vyplývá, že čím je koncentrace látky v roztoku vyšší, tím je vyšší hodnota naměřené absorbance (tj. absorbance je přímo úměrná koncentraci a naopak). Tato závislost je lineární, 1_B_Biochemie_FAF2019_Cvičení č-glukosa.docx - 8 neboť Lambert-Beerův zákon připomíná rovnici přímky (A = c . l . e  y = kx + q, kde x odpovídá hodnotě c, hodnota l.e odpovídá k, tj. směrnici přímky; q = 0, tj. závislost absorbance na koncentraci prochází počátkem), viz. Obr.3 U barevných roztoků naměříme ve viditelném spektru tím větší absorbanci, čím větší je jejich intenzita zbarvení (= tmavší, koncentrovanější roztok). Obr.3 Závislost absorbance na koncentraci Transmitance (propustnost) je nepřímo úměrná koncentraci: čím vyšší je koncentrace látky, tím méně záření vzorek propustí, tj. méně záření projde kyvetou  méně záření dopadne na detektor. Mezi koncentrací a transmitancí je exponenciální závislost (T = 10-c.l.e). Aby bylo možno určit koncentraci stanovované látky je nejprve nutné proměřit a sestrojit kalibrační křivku. Kalibrační křivka (Obr.4) pro fotometrická stanovení je grafické znázornění závislosti absorbance roztoku na koncentraci v něm přítomné stanovované látky. Křivku lze zpracovat na počítači, na praktiku však budeme používat ruční zpracování, je nutné přinést si milimetrový papír. Pro sestrojení kalibrační křivky používáme tzv. standardní roztoky stanovované látky (tzv. kalibrační roztoky). Standardním roztokem se rozumí roztok látky o známém složení a koncentraci. V praxi se používají minimálně tři, raději však více, standardní roztoky o různé koncentraci. Lze je nejlépe připravit naředěním koncentrovaného, tzv. zásobního roztoku standardu na několik nižších koncentrací. Rozmezí koncentrací by mělo být tak široké, aby se výsledky analýzy vzorků o neznámé koncentraci vešly mezi nejnižší a nejvyšší hodnotu kalibrační křivky. Vzhledem k tomu, že koncentrace nekterých látek v moči je vysoká, je nutno vzorek moči před analýzou 100x naředit destilovanou vodou. Výsledek koncentrace x odečtený z kalibrační křivky je proto nutné vynásobit 100, abychom získali skutečnou koncentraci této látky v nenaředěné moči. Vynesením naměřených hodnot absorbancí standardních roztoků (osa y) proti jejich koncentracím (osa x) získáme lineární závislost mezi absorbancí a koncentrací (viz. Lambert-Beerův zákon). Při sestrojování kalibrační křivky nepropojujeme jednotlivé body přímo, ale proložíme jimi přímku procházející co nejblíže všem bodům. Kalibrační přímka by měla procházet také nulou (průsečíkem os x a y). Standardní roztoky je vhodné zpracovávat současně se vzorky o neznámých koncentracích, aby byly zachovány stejné podmínky analýzy, včetně případných nepřesností, např. při pipetování. Po proměření absorbancí standardních roztoků i neznámých vzorků a sestrojení kalibrační křivky vyneseme do kalibrační křivky naměřenou hodnotu absorbance neznámých vzorků. Spuštěním kolmice Kalibrační křivka 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 20 40 60 80 100 120 140 160 koncentrace c (mol/l) absorbanceA 1_B_Biochemie_FAF2019_Cvičení č-glukosa.docx - 9 od bodu, kde hodnota absorbance odpovídá bodu na kalibrační křivce odečteme na ose x hodnotu koncentrace látky v analyzovaném vzorku. Obr.4 Kalibrační křivka (x = neznámý vzorek, A = absorbance, c = koncentrace) Absorbanci měříme proti tzv. slepému vzorku (= slepý pokus, blank). Jedná se o roztok obsahující stejné množství všech přidaných činidel jako obsahuje analyzovaný vzorek (standard nebo vzorek o neznámé koncentraci), avšak s výjimkou vlastní stanovované látky. Pipetovaný objem stanovované látky (standardu nebo moči) nahradíme ve slepém pokusu stejným objemem destilované vody. Výraz „měříme proti slepému pokusu“ znamená, že fotometr před vlastním měřením absorbancí vynulujeme na slepý pokus: do kyvety nalijeme tento roztok a naměřenou absorbanci položíme rovnou nule. Při měření absorbancí standardních roztoků i vzorků o neznámé koncentraci tak bude automaticky odečtena případná „absorbance pozadí“, která není dána absorpcí záření analyzovanou látkou (v některých případech mohou totiž dané monochromatické záření absorbovat i přidaná činidla, což by bez použití slepého pokusu způsobilo naměření falešně vyšší absorbance a tím i falešně vyšší hodnotu zjištěné koncentrace). V praxi se většinou fotometr nejprve vynuluje na vodu (bezbarvá kapalina, samotné rozpouštědlo, s absorbancí = 0). Po té se do kyvety nalije slepý pokus, naměřená hodnota absorbance se zapíše (pro kontrolu, při příštím měření bychom při správné přípravě reakční směsi měli získat stejnou absorbanci) a fotometr se pak opět vynuluje. Pokud je fotometr vynulován pouze na vodu, je pak třeba od každé naměřené absorbance standardu či vzorku hodnotu absorbance slepého pokusu odečíst samostatně. Teprve tehdy je zajištěno, že při měření vzorků odpovídá absorbance pouze stanovované látce. Hodnota absorbance, a tudíž i výsledná koncentrace, nebude pak zkreslena jinou látkou, která je součástí roztoku. Výsledná hodnota kvantitativního stanovení (= zjišťujeme koncentraci, tj. kvantitu) závisí na přesnosti a pečlivosti při zpracování. Přidání pouze „přibližného“ množství činidla, nepřesné pipetování vzorků, nesprávná práce s fotometrem (nepřesné vynulování, špinavé kyvety, zbytky koncentrovanějšího roztoku v kyvetě při měření roztoků méně koncentrovaných, naředění vzorků vodou, která zůstala v kyvetě po proplachování) - to vše vede k získání nepřesných výsledků. http://www.novatin.com/stanoveni-glykovaneho-hemoglobinu/