STANOVENÍ KATALYTICKÉ KONCENTRACE LAKTÁT DEHYDROGENASY ÚLOHA A: Stanovení katalytické koncentrace LDH kinetickou metodou MATERIÁL Vzorky Studenti se seznámí s principem analýzy v kyvetě na spektrofotometru Agilent/HP/Helios. Provedou přípravu roztoků reagencií a vzorků kalibrátoru Lyonorm U a biochemickém kalibrátoru (lyofilizované bovinní sérum). Vlastní analýza katalytické koncentrace proběhne za předem definovaných podmínek (inkubace při RT nebo 37°C v časovém intervalu dle tabulky) v kyvetě, případně mikrotitrační destičce. Použitá metoda - kinetické měření v čase, studenti budou měřit změnu A při 340nm v čase na spektrofotometru, případě ELISA readeru, využijí aplikace kinetické měření. Po uplynutí analýzy si studenti vyvolají uložené výsledky analýzy a uvedou je do protokolu z měření. PŘÍPRAVA A PROVEDENÍ Příprava pracovního reagentu (R) : Kvantitativně přelejte obsah lahvičky B do lahvičky A. Důkladně promíchejte. Menší objemy lze připravit smícháním: 4 ml Reagentu A + 1 ml Reagentu B. Stabilita pracovního reagentu je 3 dny při 2-8ºC. Připravte jen takové množství pracovního reagentu, které je potřeba na konkrétní počet vašich vzorků pro celou skupinu. Odeberte 1 ml připraveného reagentu a smíchejte s 25 μl vzorku a zahájíte měření v čase. Naměřené hodnoty čas (min) A340 (vzorek 1) 0.5 1 1.5 2 KALKULACE Do protokolu uveďte výsledky analýzy. Proveďte porovnání výsledků stanovení katalytické koncentrace laktátdehydrogenasy v kalibrátoru s atestovanou hodnotou. Do závěru vyhodnoťte přínos analýzy v kyvetě na spektrofotometru pro laboratoř. Vysvětlete, co vyjadřuje jednotka μkat/l. Koncentrace LDH ve vzorku je stanovena pomocí následujícího vzorce: A340/min x Vt x 106 ------------------------ = U/L  x l x Vs Molární koeficient () NADH při 340 nm je 6300 a optická dráha je 1cm, celkový reakční objem (Vt) je 1.025ml, objem vzorku (Vs) je 25l. Jednotkou katalytické koncentrace U/l další jednotkou je kat/l. Vzájemný přepočet 1U/L je 0.01667 kat/L. Toto je výsledky vzorec pro výpočet katalytické koncentrace: A340/min x 6508= U/L A340/min x 108= kat/L VYHODNOCENÍ Do protokolu uveďte výsledky analýzy. Proveďte porovnání výsledků stanovení katalytické koncentrace laktátdehydrogenasy v kalibrátoru s atestovanou hodnotou. Do závěru vyhodnoťte přínos analýzy v kyvetě na spektrofotometru pro laboratoř. Vysvětlete, co vyjadřuje jednotka μkat/l. ÚLOHA B: Stanovení katalytické koncentrace LDH kinetickou metodou na automatickém analyzátoru TEORETICKÁ PŘÍPRAVA NA CVIČENÍ Laktátdehydrogenasa – její výskyt, biochemická funkce v organismu, diagnostický význam. Izoenzymy LDH. Princip kinetického měření enzymu LDH a jeho význam. PRINCIP METODY Laktátdehydrogenasa (LD nebo LDH) katalyzuje oxidaci laktátu pomocí NAD+ za vzniku pyruvátu a NADH. Katalytická koncentrace se určuje jako míra zvýšení NADH, který se měří spektrofotometricky. REAGENCIE – složení: Reagent (A) : N-Metyl-D-glukamin 0,406 mol/l, laktát 62,5 mmol/l, pH 9,4 Reagent (B) : NAD+ 50 mmol/l MATERIÁL Vzorky Studenti se seznámí s principem analýzy na automatickým analyzátoru. Provedou přípravu roztoků reagencií a vzorků kalibrátoru LYO-KAL (BIO-LA-TEST). Vlastní analýza katalytické koncentrace proběhne za předem definovaných podmínek (inkubace při 37°C v časovém intervalu 3 minuty) na automatickém analyzátoru BS-200 (MEDESA). Aplikaci reagencií a vzorků do kyvet na zásobní roztoky a reagencie provede obsluhující personál analyzátoru. Vlastní analýza proběhne po naprogramování přístroje automaticky. Použitá metoda - kinetické měření v čase. Po uplynutí analýzy si studenti vyvolají uložené výsledky analýzy a uvedou je do protokolu z měření. Využijí přitom kalibraci provedenou ředěním automaticky po nastavení na automatickém analyzátoru. PŘÍPRAVA A PROVEDENÍ Příprava pracovního reagentu (R) : Kvantitativně přelejte obsah lahvičky B do lahvičky A. Důkladně promíchejte. Menší objemy lze připravit smícháním: 4 ml Reagentu A + 1 ml Reagentu B. Stabilita pracovního reagentu je 3 dny při 2-8ºC. Připravte jen takové množství pracovního reagentu, které je potřeba na konkrétní počet vašich vzorků pro celou skupinu. Referenční hodnoty - člověk: LDH : 132-228 IU/l = 2,20-3,80 μkat/l Zvýšení: u pacientů s jaterním onemocněním, renálními poruchami, infarktem myokardu, s mnoha maligními chorobami, progresivní muskulární dystrofií.