© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 1
10 Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty
Respirační řetězec je více méně sled oxidačně-redukčních dějů lokalizovaných na vnitřní
mitochondriální membráně, který v buňce probíhá za účelem zisku energie. V jeho průběhu jsou
odebírány různým látkám vodíky, které jsou v průběhu respiračního řetězce rozštěpeny na
protony a elektrony. Elektrony jsou nakonec využity k redukci dikyslíku na vodu, protony
vytvářejí mezi mitochondriální matrix a mezimembránovým prostorem chemický a elektrický
gradient, jehož energie je využita (především) k syntéze ATP.
Než se začneme zabývat tím, jak vůbec respirační řetězec funguje, zaměříme se na to, jak
probíhá transformace energie v našem organismu, jakými způsoby vůbec může vznikat ATP, kde
se v buňce berou redukované kofaktory, podíváme se, které enzymové komplexy se respiračního
řetězce účastní a pak snad i zvládneme pochopit, jak to všechno spolu souvisí.
10.1 Transformace energie v buňce
Začneme-li hodně zeširoka, dostaneme se k první větě termodynamické, která je vyjádřením
zákona zachování energie.
ΔU = ΔW + ΔQ
1. věta termodynamická nám říká, že při jakékoliv změně energie (ΔU) můžeme tuto energii
rozdělit na dvě složky:
 energii užitečnou/netepelnou (ΔW; práce)
 energii neužitečnou/tepelnou (ΔQ; teplo)
Vztáhneme-li výše popsané na lidský organismus, můžeme říct, že energii přijímáme ve formě
chemické energie živin (ΔU). Takto získanou energii následně vydáváme ve formě práce (ΔW) a
tepla (ΔQ).
Práce v našem těle zahrnuje:
 udržování bazálního metabolismu
 fyzickou aktivitu (svalovou práci apod.)
 tvorbu rezerv (tuků a glykogenu)
Teplo v našem těle vzniká při jednotlivých krocích transformace energie (tj. při předávání
energie z jednoho vysokoenergetického systému na jiný). Vyjděme ze schématu:
Nejvíce energie mají živiny. Při jejím přenosu mezi jednotlivými systémy (redukované kofaktory,
protonový gradient, ATP) se jí vždy podaří část zachytit, ale nikdy ne všechnu – ta část, kterou se
zachytit nepodaří, se uvolní ve formě tepla.
Uvolněné teplo ale není až tak neužitečné – podílí se na udržování stálé tělesné teploty.
O vzniku některých vysokoenergetických systémů již bylo pojednáno v předchozích kapitolách.
Pro přehlednost a úplnost se se vznikem všech z nich setkáme v dalších částech této kapitoly.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 2
10. 2 Vznik ATP v buňce
ATP je univerzálním zdrojem energie (v některých starších textech se setkáme s termínem
„univerzální energetické platidlo“, který jeho funkci plně vystihuje – buňka jím „platí“ za každou
reakci, která by samovolně neproběhla). V buňce může vznikat dvěma hlavními způsoby vzniku:
a) substrátovou fosforylací (jen minimální množství ATP)
b) oxidativní fosforylací1
(asi 95% všeho ATP v buňce)
Substrátová fosforylace
Můžeme se s ní setkat v glykolýze (2 reakce) a citrátovém cyklu (1 reakce). ATP vzniká tzv. na
úrovni substrátu, což znamená, že se účastní těchto reakcí jako jeden ze substrátů.
V glykolýze se jedná o:
a) přeměnu 1,3-bisfosfoglycerátu (smíšený anhydrid = makroergní sloučenina) na
3-fosfoglycerát
b) přeměnu fosfoenolpyruvátu (enolester = makroergní sloučenina) na pyruvát
V citrátovém cyklu se jedná o přeměnu sukcinyl-CoA na sukcinát (vzniká GTP, které rychle
konvertuje na ATP; viz Citrátový cyklus).
Povšimněme si, že v reakcích glykolýzy poskytuje potřebný fosfát a energii pro vznik ATP přímo
reagující makroergní látka (1,3-BPG a PEP), zatímco v reakci citrátového cyklu vzniká ATP z ADP a
anorganického fosfátu, přeměna sukcinyl-CoA na sukcinát poskytuje „pouze“ potřebnou energii.
Oxidativní fosforylace
Probíhá na komplexu ATP-synthasy, o kterém bude pojednáno dále v této kapitole.
10.3 Mitochondrie
Mitochondrie jsou pro respirační řetězec zásadními organelami – respirační řetězec se odehrává
na jejich vnitřní membráně2
– a proto je vhodné o nich něco vědět. Jelikož je tento text určen ke
studiu biochemie a ne histologie, zaměříme se na fakty, které jsou důležité pro biochemii.
1
Kromě substrátové a oxidativní fosforylace existuje ještě samostatně stojící pojem fosforylace, který
znamená přenos fosforylové skupiny; obecně: substrát-OH + ATP → produkt-O-P + ADP
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 3
Mitochondrie jsou organely obalené dvěma membránami – vnější a vnitřní.
 vnější membrána je hladká a je velmi propustná
 vnitřní membrána:
o je zbrázděná (vybíhá v tubuly nebo kristy)
o osahuje až 80% proteinů
o fosfolipidy obsahuje v menší míře než většina ostatních membrán (nejběžnějším
fosfolipidem je, pro mitochondrie typický, kardiolipin)
o pro většinu látek je nepropustná (tato nepropustnost je důležitá především
v případě protonů!)
Mezi oběma membránami se nachází mezimembránový prostor.
Významné je i to, že mitochondrie mají svou vlastní cirkulární DNA (říkáme, že se jedná o
semiautonomní organely), která kóduje část mitochondriálních proteinů, tedy i část proteinů
dýchacího řetězce. Zbývající část mitochondriálních proteinů je zakódována v DNA buňky,
přičemž „soužití“ mitochondrií a buněk je již tak rozsáhlé, že u některých proteinů, které mají
více podjednotek, jsou některé podjednotky kódovány mitochondriální DNA, jiné podjednotky
jadernou DNA a až po svém spojení mohou vykonávat danou funkci.
10.4 Vznik redukovaných kofaktorů
Redukované kofaktory vznikají při oxidaci živin (přesněji při jejich dehydrogenaci). V některých
případech vznikají v cytosolu, v jiných v mitochondriální matrix… ty, které vznikají
v mitochondriální matrix, jsou ihned dostupné pro dýchací řetězec, zatímco ty, které vznikají
v cytosolu je potřeba „k dýchacímu řetězci“ (tedy do mitochondrie) dopravit.
A) Vznik NADH+H+
v matrix mitochondrie
V matrix mitochondrie probíhá citrátový cyklus, β-oxidace mastných kyselin, oxidační
dekarboxylace 2-oxokyselin, dehydrogenace β-hydroxybutyrátu (ketolátka) a dehydrogenační
deaminace glutamátu. Všechny tyto děje poskytují NADH+H+
, pro větší přehlednost využijeme
tabulku.
Tabulka 1 - Vznik NADH+H+
v matric mitochondrie
Proces Reakce Enzymy (dehydrogenasy)
CITRÁTOVÝ CYKLUS
isocitrát → 2-oxoglutarát isocitrátdehydrogenasa
2-oxoglutarát → sukcinyl-CoA 2-oxoglutarátdehydrogenasa
malát → oxalacetát malátdehydrogenasa
OXIDAČNÍ
DEKARBOXYLACE
2-OXOKYSELIN
pyruvát → acetyl-CoA pyruvátdehydrogenasa
2-oxoglutarát → sukcinyl-CoA 2-oxoglutarátdehydrogenasa
2-oxokyseliny vzniklé z Val, Leu, Ile specifické dehydrogenasy
KETOLÁTKY β-hydroxybutyrát → acetoacetát hydroxybutyrátdehydrogenasa
DYHYDROGENAČNÍ
DEAMINACE
glutamát → 2-oxoglutarát glutamátdehydrogenasa
B) Vznik NADH+H+
v cytosolu
V cytosolu probíhá glykolýza, glukoneogeneze, případně dehydrogenace exogenního alkoholu
(etanolu), při které vzniká acetaldehyd (který může být následně opět dehydrogenován
enzymem acetaldehyddehydrogenasou za vzniku kyseliny octové).
2
Buňky, které nemají mitochondrie neprovozují dýchací řetězec (např. erytrocyty získávají energie pouze
anaerobní glykolýzou)
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 4
Tabulka 2 - Vznik NADH+H+
v cytosolu
Proces Reakce Enzymy
GLYKOLÝZA glyceraldehyd-3-P → 1,3-bisP-glycerát
glyceraldehyd-3-P-
dehydrogenasa
GLUKONEOGENEZE laktát → pyruvát laktátdehydrogenasa
DEHYDROGENACE EtOH
ethanol → acetaldehyd
acetaldehyd → kyselina octová
alkoholdehydrogenasa
acetaldehyddehydrogenasa
NADH+H+
vzniklé v cytoplazmě je potřeba dopravit do mitochondrie. O to se starají transportní
systémy známé jako člunky. Existují dva hlavní člunkové systémy – člunek aspartát/malátový a
glycerolfosfátový.
Aspartát/malátový člunek – srdce, játra, ledviny (univerzální)
V cytoplasmě3
máme jeden pool NADH+H+
/NAD+
, v mitochondriální matrix máme zcela jiný
pool NADH+H+
/NAD+
(mezi těmito pooly nedochází k výměně NAD+
, pouze k výměně vodíků!)
Aspartát/malátový člunek zajišťuje přenos dvou vodíků tím, že je „sebere“ NADH+H+
v cytosolu a
ve formě malátu je přenese do matrix. V matrix nastoupí zcela jiná molekula NAD+
, která si
vodíky „sebere“ z malátu a vytvoří z něj oxalacetát a ze sebe NADH+H+
. Tím byl zajištěn přenos
NADH+H+
(horní polovina schématu znázorněná černými šipkami).
Nyní je potřeba dostat oxalacetát zpět do cytoplazmy. Proto dochází k transaminaci a
z oxalacetátu vzniká aspartát, který přejde přes membránu a v cytosolu je opět transaminován
na oxalacetát. Tím byl zajištěn přenos oxalacetátu (dolní polovina schématu znázorněná černými šipkami).
Činnost celého člunku doplňuje transport 2-oxoglutarátu a glutamátu (barevné šipky). Malát je
z cytoplazmy transportován antiportem s 2-oxoglutarátem a aspartát je zpět do cytoplazmy
transportován antiportem s glutamátem. Tento systém antiportů zajišťuje kontinuálnost funkce
aspartát/malátového člunku.
3
Poznámka: Ve schématu vynecháváme vnější mitochondriální membránu, která je pro dané látky velmi
dobře propustná
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 5
Glycerolfosfátový člunek – mozek, sval
Glycerolfosfátový člunek je stavěný jednodušeji. Vychází z toho, že existují dvě formy enzymu
GPD (glycerolfosfátdehydrogenasy) – jedna z nich je spojena s NAD+
, druhá s FAD, přičemž ta
spojená s FAD se nachází na vnitřní mitochondriální membráně.
DHAP (dihydroxyacetonfosfát) si „utrhne“ dva vodíky a z NADH+H+
a přemění se na glycerol-3-P.
Ten se dostane k mitochondriální membráně, potká se s druhou formou enzymu GPD a ta z něj
získané dva vodíky odtrhne a předá je přímo ubichinonu (Q), který se tak přemění na ubichinol
(QH2). Ubichinol je součástí elektron-transportního řetězce, vodíky do něj tedy přímo zapojí.
C) Vznik FADH2 na vnitřní mitochondriální membráně
Vznik flavinových redukovaných kofaktorů je sice méně významný než vznik NADH+H+
, ale přesto
jej nesmíme opomíjet. Vznik FADH2, které je možné využít v dýchacím řetězci, je spojen s vnitřní
mitochondriální membránou.
Flavinové kofaktory jsou na své enzymy napojeny pevně (tvoří prostetickou skupinu), což
znamená, že je možné využít v dýchacím řetězci jen ty FADH2, které vznikly přímo na vnitřní
mitochondriální membráně (enzymy, na které jsou napojeny, jsou přímo součástí dýchacího
řetězce). Příklady jsou uvedeny v tabulce:
Tabulka 3 - Vznik FADH2 na vnitřní mitochondriální membráně
Proces Reakce Enzym
β-OXIDACE MK
nasycený acyl-CoA →
α,β-nenasycený acyl-CoA
acyl-CoA-dehydrogenasa
CITRÁTOVÝ CYKLUS sukcinát → fumarát sukcinátdehydrogenasa
Rekapitulace kapitol 10.1 – 10.4
Doposud jsme zjistili, jakým způsobem probíhá transformace energie v buňce. Zopakovali jsme, kde a jak vzniká ATP na úrovni
substrátu (méně významný způsob vzniku ATP!) a kde se berou redukované kofaktory (případně, jakým způsobem je dostáváme
z cytosolu do mitochondriální matrix). Tedy jsme doposud probrali, co se děje před vlastním dýchacím řetězcem.
Nyní je čas podívat se na to, které komponenty se účastní dýchacího řetězce a na některé jejich vlastnosti.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 6
10.5 Kofaktory dýchacího řetězce (struktura a funkce)
Jak bylo řečeno na začátku, je dýchací řetězec soustava redoxních dějů odehrávajících se na
vnitřní mitochondriální membráně. Začíná oxidací NADH+H+
(resp. FADH2) a končí redukcí
kyslíku na vodu.
V průběhu respiračního řetězce dochází k transportu elektronů ve vnitřní mitochondriální
membráně, který je 3x spojen s přenosem protonů přes membránu do mezimembránového
prostoru (čímž se vytváří protonový gradient).
Přenosu elektronů i protonů se účastní 4 enzymové komplexy (bude probráno dále), přesněji jejich
kofaktory. Než se přesně podíváme, jak respirační řetězec probíhá, zaměříme se na jednotlivé
kofaktory a pak i enzymové komplexy, načež znalosti o nich spojíme a vytvoříme z nich funkční
řetězec.
Kofaktory jsou čtyř typů:
a) flavinové kofaktory (FMN, FAD)
b) nehemové železo a síra (Fe-S)
c) ubichinon (koenzym Q)
d) hem4
Flavinové kofaktory
N
N
NH
N
O
O
CH3
CH3
CH2
HC
HC
HC
CH2
OH
OH
OH
O P O P O CH2
O O
OH OH
N
O
OH
N
N
N
NH2
OH
FMN
FAD
Flavinové kofaktory účastnící se dýchacího řetězce jsou dvou typů – FAD a FMN. Jejich úkolem
v dýchacím řetězci je přenos vodíků (váží se na místa označená modrými šipkami).
Nehemové železo a síra
Nehemové železo a síru najdeme v proteinech v podobě klastrů Fe2S2 nebo Fe4S4.
S
Fe
3+
S
S
Fe
3+
S
S
S
Cys Cys
CysCys
+ e-
e-
S
Fe
3+
S
S
Fe
2+
S
S
S
Cys Cys
CysCys
oxidovaný stav redukovaný stav
Cys
Fe S
FeS
S Fe
SFe
S
S
S
S
Cys
Cys
Cys
Struktura klastrů Fe-S:
Železo se v klastrech vyskytuje buď ve stavu Fe3+
(oxidovaný stav) nebo Fe2+
(redukovaný stav).
4
Pozn. Je nutné rozlišovat hem (cyklický tetrapyrrol; nízkomolekulární látka) a cytochromy (hemové
proteiny; vysokomolekulární látky)
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 7
Síru rozlišujeme dvou typů: tzv. anorganickou síru (též sulfidovou síru) a organickou síru (tedy
síry –SH skupin cysteinů).
Funkce Fe-S proteinů:
Proteiny se železem a sírou najdeme v dýchacím řetězci v těch místech, kde se vodíky (H) štěpí
na protony (H+
) a elektrony (e–
), přičemž železo z těchto proteinů na sebe váže vždy jen jeden
elektron (mění se oxidační číslo vždy jen jednoho atomu železa!) a přenáší jej v elektrontransportním
řetězci dále.
Koenzym Q (ubichinon)
CH3H3CO
H3CO R
O
O
CH3H3CO
H3CO R
OH
O
CH3H3CO
H3CO R
OH
OH
e+
H+
e+
H+
ubichion
Q
semiubichion
QH
ubichinol
QH2
Koenzym Q je pohyblivá složka DŘ ve vnitřní mitochondriální membráně – R ve vzorečku značí
50 uhlíků dlouhý isoprenoidní řetězec, který zbytku sloučeniny uděluje lipofilní charakter a
umožňuje mu volně se pohybovat v membráně (tedy mezi jednotlivými komplexy i od jedné
strany membrány ke druhé). Díky své volné pohyblivosti slouží jako přenašeč elektronů (je
schopný přijmout dva e)
mezi komplexy I a III nebo II a III, a zároveň slouží jako přenašeč
protonů mezi mitochondriální matrix a mezimembránovým prostorem (podílí se na vzniku
protonového gradientu).
Jak přesně probíhá redukce ubichinonu na ubichinol?
Před tím, než přijme jakékoliv protony a elektrony, jedná se o cyklický diketon (který není
aromatický) označovaný zkratkou Q (ubichinon). Následně je mu předán jeden elektron
z některého z enzymových komplexů (I nebo II). V okamžiku, kdy přijme elektron, chce ale
přijmout i proton, pro který si „odpluje od enzymového komplexu k matrix“5
. Z matrix převezme
proton a stane se z něj semiubichinon (QH), což je derivát benzochinonu (má již vytvořený
aromatický kruh), který má charakter radikálu.
Následně se opět vrátí k některému z enzymových komplexů a převezme od něj druhý elektron,
načež z matrix si sebere další proton6
. Tím se plně redukuje na uchichinol QH2 (má charakter
difenolu) a „odplouvá“ od enzymového komplexu I nebo II, který mu předal elektrony k dalšímu
komplexu (III), kterému je má za úkol předat.
Jeho úkolem je ale předat dalšímu komplexu pouze elektrony. Po té, co předá elektron, se ovšem
uvolní i proton – ale ne do matrix, ze kterého si ho koenzym Q vzal, ale do mezimembránového
prostoru! Tím se koenzym Q podílí na vytváření protonového gradientu.
Poznámka: výše popsaná funkce bude popsaná ještě jednou, velmi podobnými slovy, i při popisu průběhu dýchacího
řetězce.
5
K „odplutí k membráně“ dochází pouze v případě že koenzym Q (QH) „spolupracuje“ s komplexem I,
v případě že „spolupracuje“ s komplexem II, přejímá protony přímo z něj.
6
Viz předchozí poznámka.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 8
Hemy
Hemy jsou součástí cytochromů, vzájemně se od sebe odlišují svými postranními substituenty
(jak v počtu substituentů, tak v jejich typu).
 Hem b (methyl, vinyl, propionát) – jako v hemoglobinu
 Hem c (methyl, ethyl, propionát)
 Hem a (methyl, vinyl, formyl, propionát, polyisopren)
Kromě odlišných substituentů se liší i bílkovinami, ve kterých jsou zakotveny. Vliv těchto bílkovin
nesmíme opomíjet, protože právě ten ovlivňuje redoxní potenciál E°, který je více než důležitý
pro zajištění kontinuity přenosu redukčních ekvivalentů (tzn. vodíků, tzn. elektronů a protonů).
Jako příklad si uvedeme uchycení hemu c a hemu a:
10.6 Redoxní páry dýchacího řetězce
V dýchacím řetězci dochází k postupnému přenosu redukčních ekvivalentů (protonů a elektronů)
z NADH+H+
až na kyslík. Cestou mezi těmito dvěma strukturami projdou redukční ekvivalenty
přes celou řadu jiných struktur, protože kdyby přešly přímo, uvolnilo by se tak velké množství
energie, že by buňka zahynula.
To, že je přenos postupný, je zajištěno díky rozdílným hodnotám redoxního potenciálu E°´. A
proč tomu tak je? Je tím umožněno využít většinu energie elektronů k vytvoření protonového
gradientu (při přenosu elektronů dýchacím řetězcem dochází na některých místech i k přenosu
protonů – k tomuto přenosu dodává energii právě přenos elektronů)
Hem c
V bílkovině je uchycen pomocí dvou
vazeb na cystein.
Železo je napojeno na histidin (jako
u Hb), ale poté i na síru methioninu
(zvláštnost).
Hem a
V bílkovině je uchycen pomocí
isoprenoidního řetězce a dvou
atomů kyslíku.
Železo je napojeno dvakrát na
histidin (jako u Hb).
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 9
Jednotlivé součásti dýchacího řetězce se liší svou ochotou přijímat elektrony (a tak se
redukovat), jinými slovy – jednotlivé části dýchacího řetězce jsou různě silná oxidační/redukční
činidla.
Nejsilnějším redukčním činidlem je NADH+H+
, nejsilnějším oxidačním činidlem je kyslík. NADH+H+
tedy nejsnáze odevzdá elektrony, kyslík je nejsnáze přijme, „ochota“ přijmout elektrony
ostatních částí dýchacího řetězce se nachází mezi těmito dvěma komponentami.
Následující tabulka uvádí jednotlivé součásti dýchacího řetězce, seřazené podle hodnoty
standardních redoxních potenciálů od nejzápornější hodnoty k hodnotě nejkladnější (tedy ve
směru, ve kterém jsou postupně předávány elektrony).
Tabulka 4 - Redoxní páry dýchacího řetězce
Oxidovaná/redukovaná forma E°´ [V]
NAD+
/ NADH+H+
– 0,32
FAD/ FADH2 0,00
Ubichinon (Q)/ Ubichinol (QH2) + 0,10
Cytochrom c1 (Fe3+
/ Fe2+
) + 0,22
Cytochrom c (Fe3+
/ Fe2+
) + 0,24
Cytochrom a3 (Fe3+
/ Fe2+
) + 0,39
O2/ H2O + 0, 82
10.7 Sběrná místa pro redukční ekvivalenty
Jako redukční ekvivalenty označujeme vodíky, které se při průchodů dýchacím řetězcem
rozpadají na elektrony (e)
a protony (H+
).
Redukční ekvivalenty jsou do dýchacího řetězce dodávány přes NADH+H+
, případně FADH2,
některé protony převezme z cytoplazmy přímo koenzym Q.
Místa, kde redukční ekvivalenty vstupují do DŘ jsou znázorněna na následujícím schématu:
Ke schématu:
 Hlavním vstupem redukční ekvivalentů do DŘ je komplex I, na kterém dochází k rozkladu NADH+H+ dle
rovnice: NADH+H+ → NAD+ + 2H+ + 2e
Vedlejšími vstupy jsou flavinové kofaktory, tedy komplex II, FAD účastnící se citrátového cyklu a FAD
účastnící se β-oxidace. Po vzniku FADH2, dochází k jeho rozkladu dle rovnice: FADH2 → FAD + 2H+ + 2e-
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 10
10.8 Enzymové komplexy DŘ
Již párkrát v tomto textu padla slova typu komplex I, komplex II apod. Nyní si přesněji vysvětlíme,
co znamenala.
V dýchacím řetězci se nacházejí 4 enzymové komplexy (komplex I – IV). Mezi těmito komplexy
dochází k postupnému předávání elektronů (případně protonů):
 z komplexu I na komplex III a odtud na komplex IV
 z komplexu II na komplex III a odtud na komplex IV
Jak vyplývá z výše uvedeného, komplex I a II na sebe nenavazují – jedná se o nezávislé vstupy
redukčních ekvivalentů do dýchacího řetězce.
Následující tabulka uvádí jména jednotlivých komplexů, kofaktory, které se v nich nacházejí a
především uvádí i oxidačně-redukční děje, ke kterým na nich dochází!
Tabulka 5 - Komplexy DŘ
Číslo Jméno Kofaktory Oxidace Redukce
I
NADH-Q-oxidoreduktasa
(NADH-dehydrogenasa)
FMN, Fe-S NADH+H+
→ NAD+
Q → QH2
II sukcinát-Q-reduktasa FAD, Fe-S, cyt b FADH2 → FAD Q → QH2
III Q-cytochrom-c-reduktasa Fe-S, cyt b,c1 QH2 → Q cyt cox → cyt cred
IV cytochrom-c-oxidasa cyt a, a3, Cu cyt cred → cyt cox O2 → H2O
10.9 Průběh DŘ
V předchozích kapitolách jsme si popisovali jednotlivé součásti DŘ, u některých jsme se zmínili i o
jejich funkci. Nyní si všechny komponenty spojíme dohromady a podíváme se na to, jak dýchací
řetězce probíhá od začátku do konce.
Komplex I
Na komplexu I dochází k oxidaci NADH+H+ a redukci ubichinonu za účasti flavinového kofaktoru
(FMN) a Fe-S proteinů. Přitom jsou translokovány 4 H+ z matrix do mezimembránového
prostoru (dále MMP).
Ke schématu:
NADH+H+
předá své vodíky na FMN za vzniku FMNH2. V dalším kroku dojde k rozpadu vodíků na
2H+
, které jsou přeneseny do MMP a na 2e–
, které jsou přes Fe-S protein postupně přeneseny na
koenzym Q. Energie získaná z přenosu těchto elektronů navíc poslouží k přenosu dalších 2H+
do
MMP (celkem jsou na komplexu I přeneseny 4H+
).
Postupný přenos elektronů na koenzym Q vypadá následovně: po přijetí prvního elektronu
odpluje koenzym Q k matrix, sebere z ní jeden H+
za vzniku QH•; QH• převezme druhý elektron,
opět odpluje k matrix, sebere z ní druhý H+
a vznikne QH2.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 11
Komplex II
Jak již bylo řečeno, nenavazuje komplex II na komplex I, dochází na něm k oxidaci flavinového
kofaktoru (FAD) a redukci ubichinonu.
Ke schématu:
V citrátovém cyklu dojde k dehydrogenaci sukcinátu na fumarát, čímž se na FAD dostanou dva
vodíky za vzniku FADH2. V dalším kroku se vodíky rozpadnou na 2H+
, které jsou postupně
předány na koenzym Q, a na 2e–
, které jsou postupně přes Fe-S protein a cytochrom b, rovněž
předány na koenzym Q.
K redukci koenzymu Q dochází tedy odlišně než u komplexu I – v tomto případě jsou na něj
předány jak elektrony, tak protony pocházející z FADH2.
Z toho vyplývá, že na komplexu II nedochází k přenosu protonů do MMP, což se vy výsledku
projeví tím, že oxidací FADH2, získáváme méně energie (ATP).
Komplex III
Na komplexu III dochází k oxidaci QH2 (které jsme získali buď z komplexu I nebo komplexu II) a
současné redukci cytochromu c. Dochází k přenosu 4H+
přes vnitřní mitochondriální membránu
do MMP.
Ke schématu:
QH2 dopluje od komplexu I nebo komplexu II ke komplexu III. Zde předá své redukční ekvivalenty
(zoxiduje se) k dalším reakcím. 2H+
se přenesou do MMP, 2e–
projdou přes komplex III až na
cytochrom c, který zredukují. Při přenosu elektronů dojde ještě k přenosu dalších 2H+
přes vnitřní
mitochondriální membránu do MMP, celkem se tedy na komplexu III přenášejí 4H+
.
Cytochrom c obsahuje ve své molekule hem v jehož středu se nachází ion železa Fe3+
. Po přijetí
prvního elektronu dojde k redukci na Fe2+
. Po té cytochrom c odpluje ke komplexu IV
(cytochrom c je stejně jako ubichinon mobilní element, který není umístěný v membráně, ale na
ní), elektron předá (zoxiduje se zpět na Fe3+
) a vrátí se pro druhý, který přenese stejným
způsobem.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 12
Komplex IV
Na komplexu IV dochází k oxidaci cytochromu c a současné redukci monokyslíku pomocí dvou
elektronů (které jsme na něj doposud přenesli).
Ke schématu:
Cytochrom c postupně předal oba elektrony komplexu IV (čímž se sám zoxidoval). Elektrony jsou
přes další cytochromy přeneseny až na monokyslík (½ O2), který reaguje se dvěma protony
z matrix za vzniku vody.
Energie přenášených elektronů je využita k transportu 2H+
do MMP.
Ve skutečnosti na komplexu IV neprobíhá dvouelektronová redukce monokyslíku, ale
čtyřelektronová redukce dikyslíku O2. Cytochrom c musí přenést na komplex IV celkem čtyři
elektrony, které reagují s kyslíkem dle rovnice:
O2 + 4e–
+ 4H+
→ 2 H2O
A jelikož při dvouelektronové redukci monokyslíku docházelo k přenosu 2H+
do MMP, dochází
logicky při čtyřelektronové redukci dikyslíku k přenosu 4H+
do MMP. Kdybychom tento fakt chtěli
vyjádřit rovnicí, zapsali bychom ji následovně:
O2 + 4 cyt-Fe2+
+ 8H+
matrix → 2 H2O + 4 cyt-Fe3+
+ 4 H+
MMP
10.10 Protonový gradient (protonmotivní síla)
Ve výše popsaném dýchacím řetězci došlo třikrát k přenosu protonů z matrix do MMP:
 na komplexu I
 na komplexu III
 na komplexu IV
Tímto přenosem protonů se mezi matrix a MMP vytváří protonový gradient, též zvaný
protonmotivní síla, která má dvě složky:
 složku chemickou (rozdíl pH; též nazýván složka koncentrační)
 složku elektrickou (rozdíl membránových potenciálů)
Postupné vybíjení protonového gradientu je v organismu spojeno s uvolněním energie, která je
využita na:
a) syntézu ATP
b) tvorbu tepla (zejména v hnědé tukové tkáni)
c) aktivní transport metabolitů přes VMM
Na jednotlivá využití se nyní podíváme podrobněji.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 13
A) Syntéza ATP
Syntéza ATP probíhá na enzymovém komplexu zvaném ATP-synthasa. Jedná se o integrální
membránový protein složený z několika částí (viz dále), které svým uspořádáním vytvářejí kanál,
kterým se mohou protony vracet z MMP do matrix mitochondrie. Při tomto návratu „roztáčejí“
některé z podjednotek tohoto proteinu, čímž dochází ke vzniku ATP (podrobněji dále).
Struktura ATP-synthasy
ATP-synthasa má tři hlavní části, všechny složené z několika podjednotek:
Část FO je zanořena v membráně a skládá se z několika jednotek c, které vytvářejí kanál, na který
je napojena jednotka γ, tvořící „stopku“. Tyto části jsou při průchodu protonů roztáčeny!
Komplex jednotek a, b, b a δ tvoří jakési „kotvící zařízení“ které brání v rotaci části F1.
Část F1 je tvořena podjednotkami α a β (celkem 3x α a 3x β; střídavě). Kvůli „kotvícímu zařízení“
nemůže rotovat, avšak uvnitř ní rotuje „stopka“ tvořená jednotkou γ.
Rotační energie je využita k syntéze ATP.
Jak probíhá syntéza ATP?
V současnosti je zastáván názor, že při jedné otočce ATP-synthasy vznikají 3 ATP.
Jedná se o postupný proces, který se odehrává na podjednotkách α části F1. V části F1 se tyto
podjednotky nacházejí celkem tři – tvoří tedy tři vazebná místa, ne kterých může docházet k
syntéze ATP (proto vznikají 3 ATP na jednu otočku).
V průběhu otáčení γ-podjednotky, se mění konformace těchto vazebných míst. Vazebná místa
mohou zaujmout tři různé konformace:
a) první konforamce má vysokou afinitu k ADP a fosfátu (ADP a fosfát z matrix se do
vazebného místa navážou)
b) druhá konformace má vysokou afinitu k ATP, ale tím, že je ve vazebném místě již
napojeno ADP a fosfát, dochází k jejich spojení dle rovnice: ADP + Pi → ATP7
c) třetí konformace nemá afinitu ani k ATP ani k ADP a fosfátu – dochází tedy k uvolnění
vzniklého ATP
Tím, jak se γ-podjednotka otáčí, mění postupně konformaci jednotlivých vazebných míst,
přičemž dále platí, že v jednu chvíli:
 se na jedné α-podjednotce vždy napojuje ADP a fosfát
 se na druhé α-podjedtoce vždy tvoří ATP
 se na třetí α-podjednotce vždy uvolňuje ATP
Takto je zajištěna kontinuálnost tvorby ATP.
Platí, že oxidací 1 mol NADH+H+
vznikají 3 mol ATP, z oxidace 1 mol FADH2 pak jen 2 mol ATP8
.
7
Dalo by se říci, že ADP a fosfát jsou k sobě „násilně“ přitlačeny a donuceny se spojit
8
Nejnovější odhady jsou poněkud skeptičtější a předpokládají, že z 1 mol NADH+H+
vzniká pouze 2,5 mol
ATP a z 1 mol FADH2 pak pouze 1,5 mol ATP.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 14
B) Tvorba tepla + rozpojovače
Kromě výše popsaného způsobu tvorby ATP, kdy protony procházejí přes ATP-synthasu a
vytvářejí tak energii, existují ve vnitřní mitochondriální membráně i další bílkovinné (i
nebílkovinné) struktury, které umožňují přechod protonů zpět do matrix a vybíjejí tak
protonový gradient, aniž by vznikala energie.
Obecně takovéto látky nazýváme rozpojovače, neboť rozpojují dva za normálních podmínek
úzce související procesy – dýchací řetězec a aerobní fosforylaci.
Za normálních podmínek je vnitřní mitochondriální membrána pro protony nepropustná a
jedinou cestou, jak vrátit protony zpět do matrix je průchod přes ATP-synthasu. Rozpojovače9
vytvářejí ve vnitřní mitochondriální membráně „tunely“, kterými mohou protony procházet,
přičemž jejich energii se uvolňuje ve formě tepla.
Tímto rozpojením je narušena aerobní fosforylace (probíhá méně nebo vůbec), avšak dýchací
řetězec (při kterém vzniká protonový gradient) není nikterak narušen a probíhá nadále.
Fyziologickým rozpojovačem je bílkovina thermogenin. Jedná se o bílkovinu, která obsahuje
kanál pro protony a vyskytuje se ve zvýšené míře v hnědé tukové tkáni10
, jejímž úkolem je
tvorba tepla. V mitochondriích této tkáně probíhá normální DŘ, vytváří se protonový gradient a
pomocí thermogeninu je vybíjen za tvorby tepla.
Význam hnědé tukové tkáně je především u novorozenců a u zimních spáčů (tj. hibernujících
zvířat).
Rozpojovače obecně můžeme rozdělit na pravé a nepravé.
Pravé rozpojovače jsou takové, které zároveň vybíjejí obě složky protonmotivní síly – tedy
odčerpávají H+
(tím vybíjí elektrickou i chemickou složku).
Příkladem pravého rozpojovače je 2,4-dinitrofenol. Jedná se o velice nebezpečnou látku
(smrtelná dávka se pohybuje okolo 1g), po jejímž pozření dochází ke zvýšení tělesné teploty,
horečce, pocení a zrychlenému dechu (tělo potřebuje více kyslíku, aby ukojilo rychleji probíhající
DŘ, avšak nedostává se mu, i přes veškerou snahu energie, protože protony jsou „bez užitku“
přenášeny přes VMM za vzniku dalšího tepla).
V letech 1920-1930 se užíval v dávce 2,5 mg/kg jako zázračný prostředek na hubnutí – zázračný
opravdu byl, lidé po něm hubnuli, ale po té, co jistá část pacientů zemřela, se přestal užívat.
9
Obecně lze tedy říci, že rozpojovače jsou látky, které mají schopnost vázat protony a přecházet přes
VMM v protonizovaném i neprotonizovaném stavu
10
Hnědá tuková tkáň je hnědá mj. proto, že buňky v ní obsahují mnoho mitochondrií, které obsahují
hodně cytochromů, které obsahují hodně hemu (ten je červený, avšak z různých fyzikálních důvodů nám
připadá výsledná barva buněk jako hnědá).
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 15
Nepravé rozpojovače jsou takové, které vybíjejí pouze jednu ze složek protonmotivní síly
(přenášejí např. pouze kationty, čímž vybíjejí elektrickou složku).
C) Aktivní přenos látek přes VMM
Základní vlastností VMM je, že je nepropustná pro celou řadu substrátů.
Jako přes většinu buněčných membrán přes ni projdou malé nenabité molekuly (jako kyslík, oxid
uhličitý…). Díky karnitinu je možné přes ni transportovat mastné kyseliny s delším řetězcem (MK
s kratším řetězcem procházejí samostatně).
Pro přenos dalších látek se využívá vzniklého vodíkového gradientu – substráty jsou přes VMM
transportovány systémem antiportů (tedy vždy „jde něco dovnitř a něco ven“), případně
symportů („něco jde spolu s H+
do matrix), který funguje právě díky protonovému gradientu.
Pro vysvětlení: některé látky jsou transportovány antiportem přímo za H+ (tedy H+ se vrátí do matrix a jiná látka se
z matrix dostane ven). Tato látka se tudíž hromadí v cytosolu, čímž vzniká její gradient. Tento nově vzniklý gradient
může sloužit k přenosu dalších látek (které opět mohou vytvářet gradient, který může být opět použit k vytvoření
nového gradientu a tak stále dokola).
Následující schéma uvádí několik příkladů přenosu látek přes VMM:
Jako další příklady bychom mohli uvést:
 symport H+
a pyruvátu
 antiport OH–
a pyruvátu
 aspartát malátový člunek (do něhož patří i výměna 2-oxoglutarátu za glutamát)
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 16
10.11 Inhibitory dýchacího řetězce
V předchozích deseti částech této kapitoly jsme řešili, jak je možné, že dýchací řetězec vůbec
funguje a jak je využíván. Je zřejmé, že je dýchací řetězec pro buňku (a celý organismus) velice
důležitý a jakékoliv narušení jeho funkce, může mít fatální následky.
Následující tabulka uvádí přehled vybraných inhibitorů jednotlivých komplexů:
Tabulka 6 - Inhibitory DŘ
Komplex dýchacího řetězce Inhibitor
KOMPLEX I BARBITURÁTY
KOMPLEX II MALONÁT
KOMPLEX III ANTIMYCIN A, DIMERKAPROL
KOMPLEX IV H2S, CO, CN–
TRANSPORT ATP/ADP ATRAKTYLOSID, KYSELINA BONGKREKOVÁ
ATP-SYNTHASA11
OLIGOMYCIN
Uvědomme si, že existuje jistý rozdíl mezi působením inhibitorů a rozpojovačů.
Rozpojovače od sebe oddělí dýchací řetězec a syntézu ATP. Tedy působením rozpojovače se sníží
tvorba ATP, ale intenzita dýchacího řetězce se nemění (nebo se zvyšuje).
Inhibitory působí na jednotlivé komplexy dýchacího řetězce, respektive na komplexy sloužící pro
tvorbu ATP. Inhibujeme-li některý z komplexů DŘ, sníží se jeho intenzita a sníží se tím i intenzita
tvorby ATP (děje jsou stále spřaženy!). Inhibujeme-li tvorbu ATP, sníží se produkce ATP, což může
zvýšit intenzitu DŘ („buňka si myslí, že má málo ATP, tak urychlí DŘ).
Podrobněji se můžeme zaměřit na případ otravy kyanidy
Kyanidové ionty (CN–
) jsou malé molekuly, které inhibují cytochrom-c-oxidasu (komplex III). Do těla se
mohou dostat v podobě kyanidu sodného (NaCN) nebo kyanidu draselného (KCN) označovaného též jako
cyankáli (velmi účinný jed). Tyto látky se vyskytují v běžných laboratorních činidlech, užívají se při
galvanizaci, či těžbě zlata, přírodním zdrojem je látka amygdalin (vyskytující se v hořkých mandlích a
peckách meruněk). Letální dávka se pohybuje okolo 250 mg.
Při otravě začne postižený pociťovat závratě, křeče, začne rychleji dýchat (tělo se snaží zintenzivnit
zpomalený dýchací řetězec)… velmi rychle přichází smrt.
Účinek kyanidů se odvíjí od mnoha faktorů – od velikosti dávky, rychlosti podání protijedu, od pH
žaludeční šťávy postiženého a též od stáří kyanidu12
.
Při otravě je možné postupovat následovně:
 podáním hydroxykobalaminu (naváže na sebe CN–
ionty, čímž vznikne kyanokobalamin – tedy
vitamin B12)
 podáním dusitanu sodného (natrii nitris, NaNO2) vyvoláme terapeutickou methemoglobinemii
(dusitan sodný zoxiduje železo v hemoglobinu na Fe3+
; hem, který ve svém středu obsahuje Fe3+
pevně
naváže kyanid, čímž se zabrání inhibici cytochrom-c-oxidasy)
 podáním thiosíranu sodného (natrii thiosulfas; Na2S2O3) vyvoláme konjugaci této látky s kyanidovými
ionty za vzniku thiokyanátu: CN–
+ S2O3
2–
→ SCN–
+ SO3
2–
11
Bavili jsme se o tom, že ATP-synthasa má tři hlavní části. Jedna z částí se jmenovala FO, přičemž index u
písemka f neznamená „nula“, nýbrž „O“, které znamená „oligomycinsenzitivní“.
12
Stojí-li KCN „na vzduchu“ nebo dlouhou dobu na světle, dochází k rekci KCN + ½ O2 → KOCN, čímž vzniká
kyanát draselný. Ten je působením vzdušné vlhkosti přeměněn na uhličitan amonno-draselný (dle rovnice
KOCN + 2 H2O → NH4KCO3), což je látka s podobnými účinky jako má prášek do pečiva…
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 17
10.12 Respirační kontrola
Rychlost respirace je ovlivňována především:
 koncentrací ADP (tedy spotřebou ATP)
 koncentrací kyslíku
 dostatkem živin (redukovaných kofaktorů)
 přítomností inhibitorů
S koncentrací ADP a koncentrací kyslíku souvisí tzv. P/O kvocient.
)e(22Ospotreba
ADP)(neboiPspotreba
kvocientP/O 
10.13 Reaktivní formy kyslíku v organismu
Kyslík hraje v našem organismu nezastupitelnou roli především jako akceptor elektronů
v dýchacím řetězci. Plní ale i další funkce – např. se účastní hydroxylačních reakcí. V jiných
reakcích mohou vznikat tzv. reaktivní formy kyslíku, které mohou být v organismu využity, nebo
mu mohou škodit.
Tabulka 7 - Reaktivní formy kyslíku
Radikály Neutrální molekuly, anionty, kationty
SUPEROXID ·O2
–
PEROXID VODÍKU HOOH
HYDROXYLOVÝ RADIKÁL ·OH PEROXIDY LIPIDŮ ROOH
PEROXYLOVÝ RADIKÁL ROO· KYSELINA CHLORNÁ HClO
ALKOXYLOVÝ RADIKÁL RO· SINGLETOVÝ KYSLÍK 1
O2
HYDROXYPEROXYLOVÝ RADIKÁL HOO· PEROXYNITRIT ONOO–
OXID DUSNATÝ NO· NITRONIUM NO2
+
A) SUPEROXIDOVÝ ANION-RADIKÁL ·O2
–
Vzniká při jednoelektronové13
redukci dikyslíku: O2 + e–
→ ·O2
–
Název by mohl klamat – jedná se o poměrně málo reaktivní formu kyslíku.
V těle vzniká:
 při respiračním vzplanutí leukocytů
Respirační vzplanutí je jedna ze strategií, kterými se organismus brání před bakteriemi.
Dochází při něm k reakci:
2 O2 + NADPH → 2 ·O2
–
+ NADP+
+ H+
Reakce se účastní enzym NADPH-OXIDASA.
 při spontánní oxidaci hemoproteinů
Při této spontánní oxidaci se železo v hemu oxiduje z Fe2+
na Fe3+
. K této reakci dochází
nejčastěji na Hb (vzniká tak metHb, jehož hladina v těle se pohybuje ve fyziologickém
rozmezí 0,5-1,5% Hb).
13
Při čtyřelektronové redukci dikyslíku v DŘ vzniká voda a při dvouelektronové redukci dikyslíku vzniká
peroxid vodíku (O2 + 2e–
+ 2H+
→ H2O2)
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 18
hem-Fe2+
+ O2 → ·O2
–
+ hem-Fe3+
B) HYDROXYLOVÝ RADIKÁL14
·OH
Hydroxylový radikál vzniká ze superoxidového radikálu a jedná se o nejreaktivnější
z reaktivních forem kyslíku.
·O2
–
+ H2O2 → O2 + OH–
+ ·OH
Výše uvedenou reakci katalyzují redukované ionty kovů (Fe2+
/Cu2+
) – nazýváme ji reakcí
Fentonovou.
C) SINGLETOVÝ KYSLÍK 1
O2
Singletový kyslík představuje excitovaný stav tripletového kyslíku (3
O2), ze kterého vzniká po
absorpci světla některými pigmenty, např. porfyriny.
3
O2 → 1
O2
Tripletový a singletový kyslík se od sebe liší svou elektronovou konfigurací:
TRIPLETOVÝ KYSLÍK SINGLETOVÝ KYSLÍK
D) PEROXID VODÍKU
Peroxid vodíku je poměrně nestálá sloučenina, která se velmi snadno rozkládá na vodu a kyslík.
V organismu vzniká mj. při deaminaci aminokyselin, které se jí účastní FADH2, které se
regeneruje v přímé reakci s kyslíkem:
R CH COOH
NH2
D-aminokyselina
FAD FADH2
O2 H2O2
katalasa 1
/2 O2H2O +
R C COOH
NH
iminokyselina
R C COOH
O
2-oxokyselina
+ H2O
- NH3
Může vstupovat do Fentonovy reakce, v níž produkuje hydroxylový radikál ·OH, případně může
oxidovat –SH skupiny enzymů.
14
Poznámka ohledně čtení: anion OH–
= hydroxid; radikál ·OH nebo skupina –OH = hydroxyl; v názvech
organických sloučenin se používá předpona hydroxy (např. 2-hydroxypropan); v názvosloví komplexníxh
sloučenin se používá předpona ligandu OH–
hydroxo.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 19
E) Kyselina chlorná HClO
Kyelina chlorná vzniká v neutrofilních granulocytech reakcí peroxidu vodíku a chloridovým
aniontem:
H2O2 + Cl–
+ H+
→ HClO + H2O
Reakci katalyzuje enzym myeloperoxidasa. Vznikající kyselina chlorná má silné oxidační a
baktericidní účinky.
F) Oxid dusnatý
Oxid dusnatý má volný elektron a má proto charakter radikálu. Do těla se může dostávat
z vnějších zdrojů, kterými jsou především léčiva (vazodilatancia15
), fyziologicky vzniká
z argininu:
V organismu poskytuje oxid dusnatý další reaktivní metabolity:
Oxid dusnatý (NO) může být dále uvolňován z následujících sloučenin:
Vzorec Název Poznámky
H2C
HC
H2C
O
O
O
NO2
NO2
NO2
glycerol-trinitrát
(glyceroli trinitras)
Nažloutlá olejovitá kapalina, která se
užívá jako vasodilatans (klasické
léčivo, působí rychle, užívá se ve
formě sublinguálních tablet, spreje,
či náplasti)
Na2[Fe(CN)5NO]
nitroprusid sodný
(natrii nitroprussias
pentakyanonitrosylželezitandisodný)
Rubínově červené krystaly, extrémně
účinný, podává se intravenósně
Mj. slouží jako analytické činidlo pro
důkaz ketolátek
O
O
OO2N
O NO2
isosorbid dinitrát
(isosorbidi dinitras)
Působí jako obě předchozí, ale má
výhodnější farmaceutické vlastnosti.
CH3
CH
CH3
CH2 CH2 O N O
amyl-nitrit
(amylis nitris) Těkavá kapalina → inhalační aplikace
15
Oxid dusnatý se naváže na guanylátcyklasu, která iniciuje vznik cyklického camp, který zajistí relaxaci
hladké svaloviny především cév, ale má i další účinky.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 20
CH3
CH
CH3
CH2 O N O isobutyl-nitrit Těkavá kapalina, nová droga
ÚČINKY KYSLÍKOVÝCH RADIKÁLŮ
Kyslíkové radikály mají řadu pozitivních účinků:
 jedná se o meziprodukty oxidasových a oxygenasových reakcí (cyt-P450), bez nich by tyto
reakce nemohly probíhat (navíc jsou během nich vázány na enzymy a tudíž nepoškozují
ostatní struktury)
 mají baktericidní účinek (respirační vzplanutí fagocytů)
 slouží jako signální molekuly (první poslové; jednoznačně je tento fakt prokázán pouze u
NO, ale předpokládá se podobné působení ostatních radikálů)
Každé pozitivum má i svá negativa, stejně tak i kyslíkové radikály mají své negativní účinky:
 poškozují PUFA (ničí dvojné vazby, vznikají aldehydy a ROO•, což se projeví jako změna
propustnosti membrán a může dojít i k poškození membránových enzymů)
 poškozují proteiny (způsobují agregaci, síťování, fragmentaci, štěpení; modifikují –SH
skupiny a fenylové skupiny…to se projeví ve změně aktivity enzymů, v případě
membránových proteinů dochází ke vstupu Ca2+
do buněk)
 poškozují DNA (štěpí deoxyribosu, modifikují báze a lámou řetězce…to se projeví jako
mutace, translační chyby a inhibici proteosyntézy)
Jelikož, jak bylo uvedeno, jsou kyslíkové radikály velice škodlivé, je potřeba, aby se v organismu
vyskytovaly určité obranné systémy, které se pokusí jejich vzniku předcházet, případně
omezovat negativní následky jejich působení. Takovéto systémy existují a zajišťují je některé
enzymy a antioxidanty, o kterých pojedná poslední část této kapitoly.
10.14 Antioxidační systémy organismu
Obecně můžeme antioxidační systémy rozdělit:
A) Enzymy (endogenní původ)
 superoxiddismutasa
 katalasa
 glutathionperoxidasa
B) Vysokomolekulární antioxidanty (endogenní původ)
 transferrin
 ferritin vážou volné ionty kovů
 ceruloplazmin
C) Nízkomolekulární antioxidanty (endogenní i exogenní původ)
 redukující látky s fenolovým hydroxylem (tokoferol, flavonoidy, urát)
 redukující látky s enolovým hydroxylem (askorbát)
 redukující látky s –SH skupinou (glutathion, dihydrolipoát)
 látky s rozsáhlým systémem konjugovaných dvojných vazeb (karotenoidy)
Na vybrané skupiny (a příklady) antioxidačních systémů se nyní podíváme podrobněji.
SUPEROXIDDISMUTASA
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 21
Enzym obsažený v každé buňce, je vývojově (fylogeneticky) velice starý. Katalyzuje disputaci
superoxidu:
2 ·O2
–
+ 2 H+
→ O2 + H2O2
Vidíme, že v reakci dochází k disputaci – superoxidový anion s oxidačním číslem –½ se oxiduje
na kyslík s oxidačním číslem nula a zároveň se redukuje na peroxid s oxidačním číslem minus
jedna.
Známe dvě izoformy enzymu superoxiddisutasy (SOD):
 SOD1 (obsahuje Cu a Zn; nachází se v cytosolu)
 SOD2 (obsahuje Mn, nachází se v mitochondriích)
KATALASA A GLUTATHIONPEROXIDASA
Oba uvedené enzymy mají společné to, že rozkládají peroxid vodíku, glutathionperoxidasa je ale
univerzálnější a likviduje nejen peroxid vodíku (H-O-O-H), ale i hydroperoxidy lipidy (R-O-O-H),
což katalasa neumí.
Katalasa se vyskytuje v erytrocytech a provádí disproporcionaci H2O2 na vodu a kyslík:
H2O2 → ½ O2 + H2O
Glutathionperoxidasa je enzym obsahující ve své molekule selenocystein. Do reakce odstranění
peroxidů zapojuje glutation (G-SH) následujícími způsoby:
 redukce peroxidu vodíku: 2 G-SH + H-O-O-H → G-S-S-G + 2 H2O
 redukce hydroperoxidů: 2 G-SH + R-O-O-H → G-S-S-G + R-OH + H2O
VYSOKOMOLEKULÁRNÍ ANTIOXIDANTY
V přehledu na začátku kapitoly byly uvedeny enzymy jako transferrin, ferritin a ceruloplazmin.
Jejich hlavní úlohou je vazba a přenos (případně skladování) volných iontů kovů.
Antioxidační působení spočívá v prevenci: vychytáním volných iontů omezují průběh např.
Fentonovy reakce a tím brání vzniku radikálů.
NÍZKOMOLEKULÁRNÍ ANTIOIDANTY
Nízkomolekulární antioxidanty můžeme rozdělit podle rozpustnosti na lipofilní a hydrofilní.
Mezi lipofilní antioxidanty řadíme tokoferol, karoteny (lykopen, lutein…) a ubichinol*.
Mezi hydrofilní antioxidanty řadíme L-askorbát, flavonoidy, dihydrolipoát*, glutation*, kyselinu
močovou*16
.
Tokoferol
Díky své lipofilnosti je tokoferol důležitým antioxidantem buněčných membrán a lipoproteinů.
Redukuje peroxylové radikály fosfolipidů na hydroperoxidy, které jsou dále redukovány pomocí
GSH.
Ve své molekule obsahuje fenolový hydroxyl, jehož vodík je využit ke stabilizaci (např.)
peroxylového radikálu, přičemž tokoferol samotný se přeměňuje na radikál, který je ale velmi
stabilní a tudíž neškodný:
PUFA-O-O· + Toc-OH → PUFA-O-O-H + Toc-O·
16
Všechny látky označení „*“ vznikají v těle a jsou tedy endogenního původu.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 22
K regeneraci tokoferolu dochází částečně reakcí s askorbátem (k reakci dochází na fázovém
rozhraní, protože askorbát je hydrofilní a nemůže proto vstoupit do membrány za tokoferolem):
Toc-O· + askorbát → Toc-OH + semihydroaskorbát
Karotenoidy
Karotenoidy jsou velkou skupinou rostlinných látek, které chemicky řadíme mezi
polyisoprenoidní uhlovodíky (tetraterpeny).
Odstraňují peroxylové radikály, přičemž sami se přeměňují na stabilní karotenové radikály,
jednou z jejích schopností je neexcitovat (zhášet) singletový kyslík.
Nejúčinnějším antioxidantem je lykopen17
, který se vyskytuje především v rajčatech a výrobcích
z nich vyrobených (kečupy, protlaky…), výhodou je, že při zpracování se nepoškodí, neboť je
termicky stabilní.
lykopen
V ohledu přijímání karotenů platí, že vařená zelenina je zdravější, než syrová. Karotenoidy jsou
v zelenině vázány na vlákninu. Mechanickým zpracováním a rozvařením se vazba s vráninou
zruší a přidáním oleje dojde k rozpuštění karotenoidů, což usnadní vstřebávání.
Pro zajímavost se podíváme na výskyt lykopenu ve vybraných potravinách:
Tabulka 8 - Obsah lykopenu v potravinách
Potravina Obsah lykopenu (mg/100g)
rajský protlak 10 – 150
kečup 10 – 14
rajská šťáva/omáčka 5 – 12
meloun 2 – 7
čerstvá papája 2 – 5
čerstvá rajčata 1 – 4
meruňkový kompot ≈ 0,06
čerstvé meruňky ≈ 0,01
Zdroji dalších karotenoidů jsou listová zelenina a pak obecně červeně, žlutě a oranžově
zbarvená zelenina.
17
Lykopen nemůže sloužit (oproti β-karotenu) jako prekurzor retinolu (vitaminu A), neboť neobsahuje ve
své molekule β-jonový kruh:
-karoten
OH
2
retinol
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 23
Xanthofily
Xanthofily jsou kyslíkaté deriváty karotenoidů, které se vyskytují především v zelené listové
zelenině. Hlavním zástupcem je lutein, který se mj. nachází ve žluté skrvně (macula lutea),
kterou chrání před degenerací.
OH
OH lutein
Ubichinol (QH2)
Ubichinol se vyskytuje ve všech membránách (ve zvýšené míře ve vnitřní mitochondriální
membráně, kde plní funkci přenašeče elektronů).
Naše tělo si jej umí samo syntetizovat s pomocí střevní mikroflóry z tyrosinu a farnesyldifosfátu
(ten vzniká při biosyntéze cholesterolu).
Zdroji v potravě jsou klíčkový olej, játra a maso.
QH2 se podobně jako askorbát účastní regenerace tokoferolu:
Toc-O· + QH2 → Toc-OH + ·QH
L-askorbát (vitamin C)
Kyselina askorbová obsahuje ve své molekule enolové hydroxyly. Do reakcí v těle může
vstupovat buď jako dvojsytná kyselina (může disociovat do dvou stupňů), nebo jako redukční
činidlo.
O
O
OH OH
C
CH2OH
OHH
O
O
OH O
-
C
CH2OH
OHH
O
O
O
-
O
-
C
CH2OH
OHH
kyselina askorbová hydrogenaskorbát askorbát
KONJUGOVANÝ PÁR 1
KONJUGOVANÝ PÁR 2
pKA1 = 4,2 pKA2 = 11,6
O
O
OH OH
C
CH2OH
OHH
kyselina askorbová
(oxidovaná forma)
DEHYDROGENACE
HYDROGENACE
O
O
O O
C
CH2OH
OHH
dehydroaskorbová kyselina
(redukovaná forma)
kyselina askorbová jako dvojsytná kyselina kyselina askorbová jako redukční činidlo
Kyselina askorbová se v těle účastní několika důležitých reakcí:
 hydroxylace prolinu při syntéze kolagenu (působí jako kofaktor)
 hydroxylace dopaminu na noradrenalin (působí jako kofaktor-reduktant)
 působí jako silné redukční činidlo, redukuje např. železité (Fe3+
→ Fe2+
) a měďnaté ionty
(Cu2+
→ Cu+
)
 redukuje radikály ·OH, ·O2
–
, HO2·, ROO· a další
 regeneruje radikál tokoferolu
Další roli hraje při vstřebávání železa z potravy.
Kromě výše uvedených výhod má askorbová kyselina i svou nevýhodu – odbourává se na oxalát,
což může vést ke vzniku kamenů a v nadbytku má prooxidační účinky.
Flavonoidy a další polyfenoly
Ubikvitárně rozšířeny v rostlinách, v naší stravě se jedná o nejzastoupenější redukční
sloučeniny. Během dne přijmeme cca 1g, především ze zeleniny (cibule), ovoce (jablka, citrusy,
hrozny), čaje (zeleného a černého), kakaa, čokolády, olivového oleje a červeného vína.
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 24
Jedná se o deriváty chromanu (benzopyranu), které obsahují mnoho fenolových hydroxylů.
Hlavní představitelem této skupiny je kvercetin.
OH
OOH
OH O
OH
OH
kvercetin
Jejich úkolem je redukovat volné radikály, přičemž v reakcích se přeměňují na málo škodlivé
fenoxylové radikály. Kromě toho mohou nelatovat ionty kovů (Fe2+
a Cu+
), čímž zabraňují jejich
účasti ve Fentonově reakci.
Glutathion (GSH)
Glutathion je tripeptid, systematickým názvem γ-glutamylcysteinylglycin.
HOOC

NH2

 N
N COOH
O
H
H
O
CH2
SH
Glu
Cys
Gly
Tvoří se ve všech buňkách, kde pak působí jako redukční činidlo (obsahuje –SH skupinu). Je
schopný redukovat H-O-O-H i R-O-O-H (s pomocí glutathionperoxidasy). Kromě toho je schopen
redukovat různé kyslíkové radikály a regeneruje –SH skupiny jiných látek (především proteinů a
koenzymu A), tokoferol a askorbát.
Sám je regenerován reakcí s glutathionreduktasou, které jako kofaktor slouží NADPH+H+
. Velký
význam má tato reakce v erytrocytech:
G-S-S-G + NADPH+H+
→ 2 G-SH + NADP+
Zdrojem NADPH+H+
pro regeneraci glutathionu je pentosový cyklus (případně reakce jablečného
enzymu).
Dihydrolipoát
Dihydrolipoát je málo prozkoumanou látkou. Víme, že působí jako kofaktor v oxidační
dekarboxylaci pyruvátu a 2-oxoglutarátu a víme, že redukuje mnoho radikálů. U odbourávání
radikálů však neznáme přesný mechanismus reakce. Podílí se též na regeneraci tokoferolu.
Využívá se v medicíně jako acidum thiocticum (diabetické neropatie).
SH SH
COOH
S S
COOHDEHYDROGENACE
HYDROGENACE
lipoát
(oxidovaná forma)
dihydrolipoát
(redukovaná forma)
Kyselina močová
© JN 2009 Kapitola 10 – Respirační řetězec, reaktivní formy kyslíku, antioxidanty 25
Jedná se o dvojsytnou kyselinu, která má výrazné redukční účinky (redukuje např. radikály RO·),
váže na sebe kationty železa a mědi.
Stejně jako na askorbát musíme i na močovou kyselinu nahlížet jako na kyselinu a jako na
redukční činidlo:
N
N
N
N
H
OH
OH
OH
N
N
N
N
H
OH
OH
O
-
N
N
N
N
H
OH
O
-
O
kyselina
močová
(2,6,8-trihydroxypurin)
hydrogenurát urát
pKA1 = 5,4 pKA2 = 10,3
kyselina močová jako kyselina
redukční účinky kyseliny močové18
Kyselina močová vzniká jako konečný katabolit purinových bází (z 90% se v ledvinných tubulech
resorbuje) a tvoří hlavní antioxidant krevní plazmy (150-400 µmol/l).
18
Kyselina močová odštěpí jeden elektron, který reaguje s protonem (H+
) a radikálem (R·) a vzniku RH.
Jako radikál si můžeme představit ·OH, superoxid a jiné.