Replikace a transkripce DNA i Replikace DNA Replikace (reduplikace) = zdvojování Každé ze dvou mateřských vláken DNA slouží jako templát pro syntézu komplementárních vláken V nových řetězcích se báze řadí na principu komplementarity vůči bažím v templátovém řetězci Probíhá v jádře Replikace DNA. [online], [cit. 2014-07-27]. Dostupné z: http://biologie.webz.cz/www/DNA/replikace.html Obecné rysy replikace u prokaryontů a eukaryontů 3 fáze replikace DNA • Iniciace • Elongace • Spojení a terminace 3 Látkové faktory potřebné k syntéze DNA • dATP, dCTP, dGTP, dTTP •Mg2+ • primer RNA • templát DNA (mateřské vlákno) 4 Enzymy potřebné potřebné pro syntézu DNA (různé u prokaryontů a eukaryontů) Rozplétací enzym (DNA-helikasa) RNA- polymerasa DNA-dependentní DNA-polymerasa DNA-ligasa ATP-asa (topoisomerasa) 5 Chemická reakce syntézy DNA Vlastní syntéza je katalyzována DNA-polymerasami Do reakcí s již vytvořenou DNA (nebo primerem RNA) vstupuje deoxyribonukleotidtrifosfát (dNTP) Odštěpuje se difosfát a dNMP se připojí esterovou vazbou všechny DNA polymerasy navazují nukleotidy na 3'-konec primeru (nová DNA vzniká ve směru 5'—>3') 6 Připojení deoxynukleotidu při elongaci řetězce DNA 5' 3' O — P — o I V-KQHEC CH O — dNTP2 reaguje s 3 'koncem primem uzr O — H MŮVÍ 1É PAlPUJUJ ILI N JKIEOFIU NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 278. 7 5' 3' UZE O— P — O — CHX prodlužování řetězce Vzniká esterová vazba mezi 3'-OH skupinou stávajícího řetězce a 5'-fosfátem vstupujícího nukleotidu + PPi M2I VMD POO NAPOJEhi MLt"HO NOVAK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 278. 8 Replikace probíhá na obou vláknech • dvoušroubovice musí být rozvinuta - enzym helikasa • vytváří se replikační vidlice • reasociaci řetězců zabrání ssb-proteiny (single strain binding protein) • podle matrice obou mateřských vláken probíhá syntéza vláken nových 9 Proteiny podílející se na oddělení řetězců a udržování j ednovláknové struktury NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. K syntéze DNA je potřebný RNA primer RNA-DNA hybrid •DNA polymerasa neumí iniciovat syntézu nových řetězců •Pro svou funkci vyžaduje volnou y-OH skupinu •Tuto skupinu zajišťuje RNA primer (10-20 bází) •RNA primer je syntetizován ve směru 5 '—»3 'účinkem RNA polymerasy (primasy) •Primer je kódován podle odpovídající sekvence templátu RNA-pnlymi-M-..! NOVAK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 279. 11 Po vytvoření primem se na 3' konci RNA syntetizuje DNA působením DNA polymerasy " 3' 5' 3' NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 279. 12 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 279. Oba úseky DNA se spojí DNA-ligasou 13 Syntéza nové DNA probíhá vždy ve směru 5'—» 3' Bez problému tedy proběhne podél řetězce A Mateřský řetězec A 5' 3' Jak bude probíhat podél řetězce B ? Mateřský řetězec B 14 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 280. Terminologie Řetězec A - označuje se jako vedoucí vlákno (leading strand) Řetězec B - opožďující se (otálející) vlákno (lagging strand) Vedoucí vlákno se syntetizuje kontinuálně 15 Na otálejícím řetězci vznikají Okazakiho fragmenty 16 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 280. Při pokračující replikaci jsou úseky RNA v Okazakiho fragmentech odstraněny exonukleasou, polymerasa vyplní prázdná místa a ligasa spojí fragmenty DNA replikace probíhá diskontinuálně 17 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 280. Rozdíly mezi eukaryonty a prokaryonty Iniciace replikace • replikace je prokaryontů i eukaryontů vždy zahájena v počátku • probíhá v obou směrech od každého počátku, vznikají dvě replikační vidlice, které se od sebe vzdalují • vznikají replikační bubliny - replikony REPLIKAČNÍ POČÁTEK Iniciace replikace u prokaryontů Origin of Replication I oriC-počátek replikace (pouze jediný) Další syntéza může začít, i když první cyklus ještě není ukončen 40 min. Replikace začíná v počátku a pokračuje, dokud se obě vidlice nesetkají MBBS Medicine (Humantity First), [online], [cit. 2014-07-27]. Dostupné z: http://medicinembbs.blogspot.cz/2012 08 01 archive.html 19 Iniciace replikace u eukaryontů • eukaryotické chromozomy jsou tvořeny dlouhými molekulami DNA, který nemohou být replikovány kontinuálně. Proto replikace těchto velkých molekul vyžaduje zahájení na několika místech současně. • počátek replikace - až 30 000 míst současně • zahájení je řízeno prostorově i časově, nemusí být zahájeno na všech počátcích současně • rychlost replikace je menší než u prokaryontů • probíhá v S fázi 20 replikační počátek NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 281. 21 Enzymy prokaryontní replikace Polymerasa Funkce Exonukleasová aktivita DNA polymerasa 1 Vyplnění místa o RNA, opravy DNA, odstranění RNA primem 5'_>3- i 3'_>5- DNA polymerasa II Opravy DNA 3'->5' DNA polymerasa III Replikace 3'->5' 22 Enzymy eukaryontní replikace Polymerasa Funkce Exonukleasov á aktivita DNA polymerasa a replikace, opravy DNA V F I F zadna DNA polymerasa p opravy DNA V F I F zadna DNA polymerasa y replikace v mitochondriích DNA polymerasa 5 replikace, opravy DNA DNA polymerasa s replikace 3 '->5' Je známo kolem 9 polymeras 23 Další enzymy podílející se na replikaci Helikasa Oddělují vlákna DNA SSB-proteiny Zabraňují reasociaci vláken DNA topoisomerasy Uvolňují pnutí vyvolané superstáčením Enzymy odstraňující primer (RNA-sy) Hydrolyzují RNAzRNA-DNA hybridů DNAligasy Spojují úseky DNA fosfodiesterovou vazbou Telomerasy úprava 3'konce templátu Sliding clamp (klouzavá svorka) Udržuje DNA polymerasu ve vazbě na DNA Okazakiho fragmenty u ekaryontů a prokaryontů Prokaryonty - 1000-2000 bází Eukaryonty - ~ 200 bází 25 Topoisomerasy (Topologie DNA = trojrozměrná struktura DNA) U dvojité DNA dochází často k superstáčení Superstáčení může být pozitivní (ve stejném směru jako stočení helixu, doleva) nebo negativní (v opačném směru jako helix, doprava) Superstáčení může být odstraněno topoisomerasami DNA topoisomerasy mají řadu funkcí (při replikaci, transkripci, ukládání DNA do buněk, při opravách) 26 Superstáčení při rozvíjení dvojitého helixu DNA L"l"! Pozitivní superstáčení 27 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 283. Topoisomerasa I Reversibilně přerušuje fosfoesterovou vazbu v jednom řetězci, umožní otáčení kolem jednoho řetězce (uvolnění superstočení) a katalyzuje opětné spojení řetězců Nevyžaduje energii. Je u prokaryontů i eukaryontů. Topoisomerasa II Může relaxovat superstočenou DNA nebo superstáčení zavádět. Štěpí oba řetězce. Je u prokaryontů (DNA gyrasa) i eukaryontů. Gyrasa vyžaduje ATR 28 Účinek topoisomerasy I (AJTypal Přerušení fosfoesterové vazby následované rotací kolem druhého vlákna a opětným spojením Nick k Modes of replication, [online], [cit. 2014-07-27]. Dostupne z: http://biosiva.50webs,org/rep2.htm 29 Inhibitory topoisomerasy- zabraňují replikaci protinádorové léky Příklady inhibitorů topoisomerasv kamptothecin - rostlinný produkt antracykliny (daunorubicin) - bakteriální produkty podofyllotoxiny - rostlinné produkty kamptothecin (Camptotheca acuminata) H3CO OCH. OCH podofyllotoxin (PodophyHum peltatum ad.) 31 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 284. Telomery zvláštní sekvence DNA na koncích chromosomů tandemy druhově specifických oligonukleotidů, bohatých na (u člověka TTAGGG až lOOOx) mají ochrannou funkci (před působením enzymů) Při syntéze opožďujícího řetězce vyžaduje replikační aparát přítomnost určité délky templátové DNA za sekvencí, která má být kopírována. Syntéza opožďující se DNA by se zastavila před koncem templátu. © Telomerasa • dokončení syntézy DNA • připojuje preformovaný hexanukleotid na 3'-konec templátového vlákna • je reverzní transkriptasa - ve své struktuře nese RNA templát, ten připojí k 3 'konci templátové DNA a podle něj dosyntetizuje příslušnou komplementární sekvenci DNA 33 Dokončení syntézy DNA na koncích chromozomů replikující se vedoucí řetězec není zakreslen templátový řetězec 3 'konec 1 [ opožďující se řetězec RNA primer http://faculty.plattsburgh.edu/donald.slish/Telomer ase.html telomerasa připojuje sekvence k templátovému řetězci DNA-polymerasa dosyntetizuje opožďující se řetězec 34 1 1 1 1-1 5' replikovaný konec váznoucího řetězce Další funkce telomer: vytváří ochranu před působením DNA-nukleáz na koncích chromozomů 35 ? Délka telomer koreluje se stářím a replikační kapacitou buňky ? • buňky získané od mladších jedinců mají delší telomery a mohou podléhat většímu počtu dělení • snížená aktivita telomerasy pravděpodobně souvisí se stářím organismu • buňky, které se často dělí (zárodečné, kmenové a nádorové) mají vyšší hladinu telomerasy • inhibitory telomerasy mohou být užitečné v terapii nádorů 36 Poškození a opravy DNA. Hrubý odhad počtu poškozujících zásahů do DNA v lidské buňce: ccal04-106/den =^> u dospělého člověka (1012 buněk) se jedná o 1016-1018 opravných kroků za den. 37 Poškození a opravy DNA Typ poškození Příčina Chybějící báze Depurinace (104purinů za den) Změněná báze Ionizační záření, alkylační činidla Nepřesná báze Spontánní deaminace Delece-inserce Interkalační činidla (akridiny) Formace dimerů U V záření Zlomy řetězců Ionizační záření, chemikálie (bleomycin) Mezi řetězové vazby Chemické látky (deriváty psoralenu, mitomycin c) Tvorba tautomerů Spontánní a dočasná 38 Většina buněk má schopnost rozeznat a vystřihnout poškozenou oblast DNA a následně syntetizovat opravenou formu specifické glykosylasy, exonukleasy a endonukleasy DNA polymerasa p nahradí chybějící báze DNA ligasa spojuje úseky 39 Poškozená DNA je v buňkách opravována reparačními enzymy Buňky mají k dispozici opravné systémy : •přímá oprava (zvratem - jen u bakterií) •vystřižení porušené báze („base excision repair") •vystřižení porušeného nukleotidu („nukleotide excision repair") •oprava chybného párování („mismatch repair") •opravy dvojitých zlomů - homologní rekombinace, nehomologní spájení konců •prevence inkorporace porušeného nukleotidu do DNA Mutace, které vzniknou během DNA replikace jsou opravovány zpětnou kontrolu správného zařazení posledního nukleotidu (3'—»5'proofreading) Viz též Poškození a opravy DNA - doplňující text 40 Spontánní reakce, Alkylační oxidační stres, UVzář., Ioniz. Chyby v činidla alkylační činidla, mutageny z záření replikaci ioniz.záření. prostředí O6-MeG Bazická místa, oxidace, deaminace, alkylace, ssDNA zlomy Pyridinové dimery, bulky adducts Dvojité zlomy Chyby při opravách, inserce, delece Přímá oprava Vystřižení báze Vektorová Grafika Zdarma: DNA, Double Helix [online], [cit. 2014-07-27]. Dostupné z: http://pixabav.com/cs/dna-double-helix-v%C4%9Bda-biologie-30518/ Vystřižení nukleotidu Homologní rekombinace, nehomologní spájení konců Oprava chybného párování 41 Příklady oprav vystřižením báze nebo nukleotidu deamination ATGCUGCATTGA TACGGCGTAACT uracil DNA glycosylase ATGC GCATTGA TACGGCGTAACT repair nucleases AT GCATTGA TACGGCGTAACT DNA polymerase fj ATGCCGCATTGA TACGGCGTAACT DNAligase ATGCCGCATTGA TACGGCGTAACT ♦ ♦ ♦ ♦ thymine dime r ATGCUGCATTGATAG TAC GGC GT AACTATC ^ excinuclease ^ AT (~30 nucleotides) AG TAC GGC GT AACTAT C ijŕ DNA polymerase p AT G C C GCATT GAT AG TAC GGC GT AACTAT C DNAligase J AT G C C GCATT GAT AG TAC GGC GT AACTAT C Base excision repair Nucleotide excision repair 42 Syntéza a postranskripční úpravy RNA 43 Transkripce Proces tvorby RNA na podkladu struktury DNA Je přepisován pouze jeden řetězec dvoušroubovice DNA -templátový řetězec Druhý řetězec se nazývá kódující (jeho sekvence bází odpovídá transkriptu, pouze místo U je T) 44 Kódující řetězec 5' _ G G A T C DNA Templátový řetězec 3' - C C T A G RNA G G A U C Syntéza RNA probíhá opět ve směru 5'—> 3' Replikace x transkripce Replikace Transkripce Enzymy: DNA-polymerasy RNA-polymerasy Kde probíhá: na chromosomu v S fázi vybraný segment DNA Zahájení: vyžaduje RNAprimer nevyžaduje primer Průběh: Kontrola: kopírována obě vlákna polymerasa má zpětnou kontrolu správného zařazení posledního nukleotidu kopírováno pouze jedno vlákno polymerasa nemá zpětnou kontrolu správného zařazení posledního nukleotidu Nukleotidy: d ATP, dGTP, dCTP, dTTP ATP, GTP, UTP, CTP 46 Enzym zodpovědný za transkripci je DNA-dependentní RNA polymerasa (transkriptasa) Prokaryonty: 5 podjednotek plus sigma faktor. Přepisuje všechny formy RNA Eukaryonty 4 různé RNA polymerasy 47 RNA polymerasy u eukaryontů RNA pol I - syntéza r RNA (v jadérku) RNA pol II - syntéza mRNA (jádro) RNA pol III - syntéza ťRNA, 5 S RNA Gádro) RNA pol IV - syntéza mitochondriální RNA Mají stejný mechanismus účinku, rozlišují různé promotory 48 Amanitin Inhibitor eukaryontních RNA polymeras (hlavně typu II) HO" H O Detailed Eukaryotic Description: Effects of the Deadly Amanitin Toxin From the Poisonous Amanita phalloides Mushroom, [online], [cit. 2014-07-27]. Dostupne z: http://wwwxhem,uwec,edu/Webpapers2006/sites/zuehlkjt/WebPages/amanitintoxin,html 49 Wikipedie: Alfa-amanitin. [online], [cit. 2014-07-27]. Dostupné z: http ://cs .wikipedia.org/wiki/Alfa-amanitin 3 fáze transkripce • iniciace • elongace • terminace 50 Účinek RNA polymeras • Syntéza nové RNA probíhá ve směru 5 '—»3' • K syntéze jsou potřebné ATP,GTP,CTP,UTP • Každý nukleotid se páruje s komplementární bází na templátovém vlákně • Polymerasa tvoří fosfoesterovou vazbu mezi 3 -OH ribosy na rostoucím RNA vláknu a oc-fosfátem navázaným na 5'OH ribosy vstupujícího nukleotidu • energie polymerace je kryta štěpením NTP NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 288. Terminologie transkripce Promotor - oblast DNA dlouhá asi 40 nukleotidů nacházející se před místem startu od 5 'konce Transkripční jednotka - oblast od promotoru k terminační oblasti Boxy (elementy): malé sekvence obsažené v oblasti promotoru Cis-působící sekvence: leží na molekule DNA, která je přepisována, v blízkosti genu Trans-působící faktory : proteinové faktory vážící se na DNA (geny řídící jejich syntézy jsou na jiných chromozomech) Primární transkript - RNA produkt nasyntetizovaný ve směru 5'—»3' 52 Rozpoznání templátu - RNA polymerasa (RNAP) vytvoří stabilní komplex s templátovou DNA v místě promotoru V místě promotoru se nachází konvenční sekvence (sekvence, které se obecně najdou v určité oblasti mnoha zkoumaných genů) Promotor u prokaryontů V pozici ~ -10 obsahuje Pribnowův box TATAAT V pozici ~ -35 další sekvence TTGACA Tyto sekvence jsou rozeznány a -faktorem prokaryotické RNA polymerasy Promoter DNA _A_ Coding _35 sequence strand ,-*-s -10 sequence 5'-3'- Template strand Startpoint +1 AAC TG T ATATTA T Transcription 5' RNA 3' •5' 3' S2012 Pearson Education, Inc BIOL2060: Gene Expression: Transcription, [online], [cit. 2014-07-27], Dostupné z: http://www.mun.ca/biologv/desmid/brian/BIOL2060/BIOL2060-21/CB21.html 54 Promotor u eukaryontů (RNA polymerasa III) Transkripce eukaryontních genů je mnohem komplikovanější Je zapojena řada transkripčních faktorů, které se váží k různým úsekům DNA Promotor obsahuje TATA box analogický Pribnowově sekvenci (ATATAA) - určuje pravděpodobně místo startu - vazba bazálních transkripčních faktorů V pozici ~ -100-200 jsou 1-2 další regulační sekvence (CAAT box, GC box) - určuje pravděpodobně frekvenci startu (promotorové proximální sekvence) Vzdálené regulační sekvence (mimo promotor) (též nazývané enhancery, silencery)- vážou specifické transkripční faktory 55 Promotor u eukaryontů Eli kary ote promoter Transcribed sequence Transcription -r Open reading frame • r t -90 -75 r -30 r AT Il- StO p CAAT — GGGCGG-TATAAAA 5 ■1 Animal Genetics - Gene expression, [online], 5.2.2013 [cit. 2014-07-27]. Dostupne z: http://web2.mendelu.cz/af 291 projekty2/vseo/stranka,php?kod=307 Bazálni transkripční faktory u eukaryontů Musí být navázány na RNA polymerasu před startem transkripce a jsou současně asociovány s promotorovými sekvencemi Jsou nezbytné pro rozpoznání promotoru a místa startu Bazálni = jsou potřebné pro transkripci všech genů 57 Bazálni transkripční faktory TFIID - největší z bazálních faktoru transkripce Má celkem 11 podjednotek Jednou podjednotkou je TBP (TATA box binding protein). TBP se váže k TATA boxu, na ni nasedají další podjednotky TXIID. Po té se navazují další TF (TFIIA,B,F,E,H) a RNA polymerasa 58 Bazálni transkripční faktory TFIID TBP T F11F TFIIE T F UM TF IIB T ř IIA RNA-POIYMERASA . u arr u jjjjn ■ d u u u u u V _TATA - BOX_ J TATA-BOX PROMOTOR NOVÁK, Jan. Biochemie L Brno: Muni, 2009, s. 290. 59 Genově specifické regulační proteiny Specifické transkripční faktory - proteiny, které se vážou v regulačních sekvencích mimo promotor, často velmi vzdálených. Působí jako aktivátory nebo represory transkripce příslušného genu. Specifické transkripční faktory interagují s mediátorovými proteiny (koaktivátory, korepresory), které jsou v kontaktu s bazálními transkripčními faktory. Viz následující přednáška 60 Specifické transkripční faktory SPECIFICKÁ REGULAČNÍ SEKVENCE j liji Lo. i; ■ i i p li fítiii-n i SPECIFICKÉ TRANSKRIPČNÍ FAKTORY 61 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 290. Transkripční faktory a zahájení transkripce Transkripce je zahájena teprve po navázání všech transkripčních faktorů RNA polymerasa se váže k transkripčním faktorům a DNA Dvojitý helix DNA se rozvíjí a polymerasa je „sunuta" k místu startu Je zahájena transkripce Po zahájení transkripce se většina transkripčních faktorů oddělí 62 Elongace Je zahájena navázáním RNA-polymerasy v místě startu RNA-polymerasa nevyžaduje primer Využívá ATP,GTP, CTP a UTP, uvolňuje PPi RNA-polymerasa má rozplétací aktivitu, dochází rovněž k superstáčení Účast topoisomeras při uvolňování superstáčení 63 Terminace Proces elongace je ukončen při dosažení terminačního signálu U prokaryontů je terminace závislá na p faktoru nezávislá na p faktoru U eukaryontů je o terminaci málo známo 5', 3' Coding Strand .......................................3 Template Strand Wikibooks: An Introduction to Molecular Biology/Transcription of RNA and its modification, [online]. [cit. 2014-07-27]. Dostupne z: http://en.wikibooks.org/wiki/An Introduction to Molecular Biology/Transcription of RNA and its mo dification RNA polymerázy dělají jednu chybu na 104 nukleotidů, protože nevlastní nukleolytickou korigující (proofreading) aktivitu (začínají řetězec RNA bez potřeby primem). Toto chybění korekce (proofreading) odráží skutečnost, že transkripce nemusí být tak přesná jako DNA replikace, protože RNA není používána jako trvalá zásobní forma genetické informace. Úprava primárních transkriptů Primární transkript je přesnou kopií transkripční jednotky Primární transkripty tRNA a rRNA u prokaryontů i eukaryontů jsou posttranskripčně modifikovány ribonukleasami Prokaryontní mRNA je prakticky identická s primárním transkriptem (k translaci slouží ještě před ukončením syntézy) Eukaryontní RNA podléhá rozsáhlým následným modifikacím - probíhají kotranskripčně 66 Úprava eukaryontní mRNA Primární transkript je hnRNA Je přepisem strukturního genu, v němž jsou kódující sekvence (exony) střídány sekvencemi nekódujícími (introny nebo intervenujícími sekvencemi) E XON i E XON 1 EXON 3 EXON 4 INTRO NI INTR0N2 intron3 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 294. nekódující sekvence musí být odstraněny z primární RNA během úprav (processingu) 67 r __ Úprava hnRNA v jádře • Chemická modifikace (navázání 5' čapky) - na ni se váže komplex proteinů, které chrání před působením 5'exonukleas a pomáhají při zavádění RNA přes nukleární póry do cytoplasmy • Sestřih (odstranění sekvencí odpovídajích intronům) • Polyadenylace (adice 3' polyA) - brání účinku 3 'exonukleas 68 Sestřih hnRNA - splicing Probíhá působením jaderných enzymových komplexů - splicesomů Splicesomy obsahují pět malých RNAs (Ul? U2„U4,U5 a U6) Jsou asociovány s proteiny a tvoří snRNPs (small nuclear ribonucleoprotein particles). Sekvence AGGU určují hranice mezi intronem a exonem ODSTRANIT 5'------AG C- 3U----3' EXON 1 INTRON1 EXON 2 69 NOVAK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 294. Mechanismus sestřihu Snurps Ul-U se vážou k intronu Ul se váže v blízkosti spojení exonl-intron a U2 se váže v oblasti, kde je obsažen adeninový nukleotid Vytváří se smyčka - fosfát vázaný ke G na 5'-konci intronu tvoří vazbu 2'-5's 2'-OH skupinou adeninového nukleotidu Na konci exonu 1 proběhne štěpení mezi AG na 3 'konci exonu a GU na 5 'konci intronu Pak následuje štěpení na 3 'konci intronu v místě AG sekvence Exony se spojí, intron je uvolněn a degradován na nukleotidy 71 Alternativní sestřih Při typickém sestřihu jsou všechny exony primárního RNA transkriptu spojeny dohromady za vzniku mRNA pro syntézu specifického proteinu Alternativní sestřih - různé skupiny exonů z jednoho genu tvoří různé mRNA vedoucí k syntéze různých proteinů i. XON 1 EXOIM 2 E XON I E XON 4 inj T RON 1 INTR0N2 INTRON3 ALTERNATIVNÍ SESTŘIH EXON 1 E KON 2 E XON 3 í_1_Í_ EXON1 E XON 2 —_i_ E XON 4 PRGTEtN A PROTEIN 72 NOVAK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 294. Alternativní sestřih mRNA 5*1 31 a-tropomyosin gene exons introns TRANSCRIPTION + SPLICING 5' 5' 3' 5' DNA striated muscle smooth muscle fibroblast mRNA fibroblast mRNA brain mRNA Architekturabuněčnéhojádraanemoc. [online], [cit. 2014-07-27]. Dostupné z: http://lge.lfl.cuni.cz/heslo/priklady/files/abjan.html 73 Poruchy sestřihu Vedou ke genetickým chorobám Př. p - thalasemie: p-podjednotka hemoglobinu se netvoří v normálním množství G na 5 'sekvenci sestřihu je mutován na A a proto je primární transkript sestřižen nesprávně 74 Přeskupování exonů (exon shuffling) • Přítomnost početných intronů v DNA zvyšuje pravděpodobnost genetické rekombinace mezi exony rozdílných genů. • Mnoho proteinů u současných buněk připomíná složeniny vzniklé ze společných sad kusů proteinů, které se nazývají proteinové domény. • Přeskupování exonů - evoluční proces, při němž vznikají nové geny spojením dříve oddělených genů kombinací, které kódovaly různé proteinové domény 75 Syntéza eukaryontní rRNA 76 Syntéza eukaryontní rRNA Jadérko: 45 S RNA je syntetizována ve formě prekursoru preRNA komplexace s proteiny - tvorba ribonukleoproteinů Methylace a zkrácení 5S RNA syntetizována mimo jadérko, migruje do jadérka a připojuje se k ribonukleoproteinovým částicím Transport zkrácených RNA do nukleoplasmy a přes jaderné póry do cytoplasmy. Tvorba ribosomů. 77 Úpravy 45 S eukaryontní rRNA J_L ^15 s ZKRÁCENI AIS 20S I I ■III 32 S 18 s odstranění intronü s,as J les NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 295. 78 Syntéza eukaryontní tRNA Syntéza ve formě pre t-RNA v jádře Odštěpení intronů Modifikace bází: • methylace uracilu na thymin • dehydrogenace uracilu • vznik pseudouridinu (vazba C-C mezi uracilem a ribosou) • deaminace adenosinu na inosin a další Připojení CCA sekvence na 3 'konci Migrace do cytoplasmy 79 © Syntéza proteinů 80 Syntéza proteinů - translace Kde: v buňkách obsahujících jadernou DNA Kde v buňce: ribosomy (volné nebo vázané na ER, mitochondrie) • prokaryonty: transkripce, úpravy transkriptu a translace nejsou prostorově odděleny • eukaryonty: translace probíhá až je zralá mRNA dopravena do cytoplazmy 81 Které molekuly jsou potřebné pro syntézu proteinů? Aminokyseliny v Rada enzymů Bílkovinné faktory ATP a GTP Anorganické ionty (Mg2+, K+) 82 Genetický kód Proteiny - 20 AK RNA - 4 báze Každá aminokyselina je charakterizována tripletem bází v mRNA - kodonem Celkem 64 kodonů —> 61 kóduje aminokyseliny 3 jsou STOP kodony (UAA,UAG, UGA) Nierenberg (1961) -poly(U) sekvence mRNA je předlohou pro syntézu polyfenylalaninu sekvence UUU je kódem pro Genetický kód První báze 5' U Druhá báze Třetí báze U C A G 3' Phe Ser Tyr Cys U Phe Ser Tyr Cys c Leu Ser Stop Stop A Leu Ser Stop Trp G Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gin Arg A Leu Pro Gin Arg G lie Thr Asn Ser U lie Thr Asn Ser C lie Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G Vlastnosti genetického kódu: • degenerovaný (jedna aminokyselina může mít více než jeden kodon) • jednoznačný (každý kodon specifikuje pouze jednu aminokyselinu) • „kolísavý" (třetí báze tripletu může být zaměněna) • téměř universální (všechny organismy mají stejný genetický kód, je jen několik výjimek : např. v lidské mitochondriální mRNA triplet UGA kóduje trp namísto stop-kodonu, AUA kóduje methionin místo leucinu) • nepřekrývající se (každý kodon je čten jen jedenkrát) • nepřerušovaný (kodony nejsou odděleny, triplety na sebe navazuj í) 85 Vztah mezi mRNA a proteinem Sekvence bází v mRNA je roztříděna do kodonů Startovací kodon zahajuje čtení úseku Pořadí kodonů v mRNA určuje pořadí, ve kterém jsou aminokyseliny připojovány v rostoucím polypeptidovém řetězci - čtení je určeno čtecím rámcem AU G|CAC^G U G GAG U U 86 Efekt mutací Mutace jsou výsledkem poškození nukleotidů v DNA nebo neopravených chyb během replikace. Mohou být přepsány do mRNA Translací chybné báze může v proteinu vzniknout abnormální sekvence AK 87 © Typy mutací 1. bodové * výměna jediné báze a) mírné - neovlivní sekvenci AK v proteinu např. CGA^CGG (obě sekvence kódují Arg) b) měnící smysl - jedna AK je zaměněna jinou např. GCA^CCA vyvolá záměnu arg prolinem c) nesmyslné - vyvolají předčasnou terminaci řetězce např. CGA -^UGA, kodon pro Arg je nahrazen stop-kodonem 88 Typy mutací (pokr.) 2. inserce - vložení jednoho nebo více nukleotidů 3. delece - vypuštění jednoho nebo více nukleotidů Porucha záleží na počtu vypuštěných nebo vložených nukleotidů Jsou-li vypuštěny tři nukleotidy, nebo více trojic nukleotidů při zachování čtecího rámce, dojde k tvorbě polypeptidu s chybějícími AK Je-li vypuštěn jeden nebo dva nukleotidy, dojde ke změně čtecího rámce a vznikají zkomolené sekvence AK, nesmyslné kodony atd. 89 Příklad bodové mutace Bodové mutace v genech pro hemoglobin: Je známo asi 800 strukturních variant lidského hemoglobinu Většina je způsobena bodovou mutací a je neškodná. Některé však vyvolávají choroby. Methemoglobinemie - např. nahrazení jednoho histidinu tyrosinem^bílkovina je nepřístupná pro působení methemoglobin reduktasy, zvyšuje se methemoglobin v krvi Srpková hemoglobinemie - nahrazení glutamátu valinem v pozici 6 P-řetězce =^> řetězec je méně rozpustný, dochází k řetězení =^> srpkovitý tvar erytrocytu 90 Syntéza proteinů podle kodonů: Aminokyseliny nemohou přímo reagovat s bázemi „adaptérem jsou tRNA molekuly" • každá molekula tRNA obsahuje antikodon • antikodon je triplet bází komplementárních ke kodonu mRNA • každá tRNA může vázat specifickou AK na svém 3 konci 91 Struktura tRNA 3' KONEC D-SMYČKA 5' KONEC P — —OH AKCEPTOROVA STOPKA připojení AK esterovou vazbou k 3-OH ribosy T-SMYČKA (TlľC) VARIABILNÍ SMYČKA Vazba na povrch ribosomu ANTIKODON NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 298. 92 Tvorba aminoacyl-tRNA • aminokyselina je nejprve aktivována reakcí s ATP aminoacyl-AMP • aktivovaná AK je přenášena na 2nebo 3OH skupinu ribosy na 3 'konci tRNA • reakce je katalyzována specifickými enzymy (aminoacyl-tRNA synthetasy) • reakce vyžaduje dodání energie * tRNA s navázanou AK se nazývá „ nabitá " (charged) tRNA Aktivace AK aminokyselina R-CH— O \ - OH O OVO .11 II * II o—p—o—p—O PO o" o" o" ATP N- < N' OH OH NH- 1 " PP; aminoacyl-AMP (aktivovaná AK) OH OH (smíšený anhydrid) NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 300. Přenos AK na 3'-konec transferové RNA t-RNA Esterová vazba mezi -COOH aminokyseliny a 3-OH ribosy aminokyselina Fáze translace A. Inciace B. Elongace C. Terminace Probíhají v cytoplazmě, ve vazbě na ribosomy Ribosomy NOVAK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 299. Ribonukleoproteinové částice - složené z RNA a proteinů Tvořeny velkou a malou podjednotkou V inaktivním stavu podjednotky odděleny, při zahájení proteosyntézy agregují. Na větší podjednotce tři vazebná místa pro molekuly tRNA - P, A, E P-peptidyl-tRNA A-aminoacyl-tRNA E-volná tRNA (exit) 97 Prokaryotické X eukaryotické ribosomy Vlastnost Bakteriální Lidský Sedimentační konstanty: 70S 80S kompletní ribosom 30S 40S Menší podjednotka 50S 60S Větší podjednotka 65% 50% Obsah RNA 16S 18S RNA-menší podjednotka 5S 23S 5S 5,8S 28S RNA-větší podjednotka Volně v cytoplazmě Volně v Umístění v buňce nebo vázané na cytoplazmě nebo plazmatickou vázané na membránu membrány ER 98 Iniciace Tvorba iniciačního komplexu. Rozdíly mezi eukaryonty a prokaryonty Děj Eukaryonty prokaryonty Vazba mRNA k menší ribosomální podjednotce První AK Iniciační faktory Čapka na 5'konci mRNA váže IFs a 40S podjednotku obsahující t-RNAmet. mRNA je skenována po AUG Methionin elFs(12 a více) Shine-Dalgarno sekvence nad iniciačním AUG se váže ke komplementární sekvenci v 16S RNA Formyl-methionin IFs (3) 99 Iniciace Velká ribosomální podjednotka O H H2N-C-C-0 tRNA antikodon Malá ribosomální podjednotka 5' -e 5-P-P-P-5-- Guaninová čapka Iniciační faktory mRNA 100 Navázání faktorů eIF3 a elFlA na menší podjednotku Vazba aktivovaného Met na tRNAMet Vazba GTP k eIF2 Vazba komplexu GTP-eIF2 k t-RNAMet Na čepičku na 5 'konci mRNA se váže CBP (cap binding protein) Součástí CPB je několik dalších iniciačních faktorů (elFs) 5' Šle -P-P-P-5'- ACAUGUUGCC m-RNA 104 Vazba komplexu Met-tRNAMet, elFs a GTP k menší ribosomální podjednotce 40S Vazba m-RNA k preiniciačnímu komplexu (J|J^5-P-P-P-5 - ACCGUAACAUGUUGCCG O H2N-C-C-0' Met Komplex skenuje mRNA od 5 konce, dokud nenarazí na sekvenci AUG Iniciační komplex 80S • GTP je hydrolyzováno • elFs se oddělí • připojí se větší ribosomální podjednotka 107 Rozdíly v iniciaci u prokaryontů a eukaryontů eukaryonty prokaryonty Vazba mRNA k malé ribos.podj. Cap na 5'konci mRNA váže 40s rib.podjednotku obsahující tRNA, mRNA je skenována na AUG kodon Nemá cap, Shin-Dalgarno sekvence nad iniciačním AUG se váže na komplementární sekvenci v 16s rRNA První AK methionin formylmethionin Iniciační faktory 12 a více 3 ribosomy 80s (40s a 60s) 70s (30s a 50s) 108 Faktor eIF2 zásadní význam pro zahájení translace jeho fosforylovaná forma je neaktivní Příklad regulace syntézy proteinu: Syntéza globinu v retikulocytech • Při nepřítomnosti hernu v retikulocytu je elF fosforylován : =^> neaktivní • Přítomnost hernu inhibuje kinasu, která fosforyluje eIF2 => ► syntéza probíhá Kinasa eIF2 je aktivována také při virových infekcích, hladovění. 109 Elongace peptidového řetězce • tvorba další aminoacyl-tRNA • vazba aminoacyl-tRNA do místa A ribosomu • tvorba peptidové vazby • translokace peptidyl-tRNA do místa P no Která další AK bude připojena? Lev. Další kodon je UUG G G G Vu G U V f \ GTP Antikodon je A AC Aminokyselinou je leucin 111 NOVAK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 303. Tvorba Leu-tRNA 1. Aktivace leucinu reakcí s ATP —» leuciny laděny lát 2. tvorba leu-tRNA 3. + vazba GTP a EFla 112 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 303. Komplex Leu-tRNA+GTP+EFla se váže do místa A, GTP je hydro lyžováno na GDP + Pi, komplex GDP-EFla se uvolní Proces elongace je u prokaryotů a eukaryontů velmi podobný (odlišné kofaktory elongace) NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 304. 113 Tvorba peptidové vazby (transpeptidace) Peptidyltransferasa katalyzuje odštěpení methioninu od tRNA a přenesení na leucin za vzniku peptidové vazby Vazebné místo na 3'-konci tRNA^ je volné VGS'PPP Leu " Syntéza proteinu začíná N-koncem 114 NOVAK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 304. Uvolnění tRNA + EF2 + GTP (k ribosomu se váže EF2 a GTP) GTP je p hydrolyzováno. 6 G G tu 5-G-5-P^PS* EF2 se opět uvolní tRNAMet se přesouvá do místa E? P místo se + + GDP+Pi uvolní 115 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 304. Translokace TRANSIOKACE tRNA 2 MtSTA A DO MISTA P GDP + Pi 1 Přesun peptidyl-tRNA na místo P GTP -> GDP + Pi 1 4 ATP Na syntézu jedné peptidové vazby je potřeba 4 ATP. Další energie je potřebná pro iniciaci a syntézu nukleotidů. 120 Rychlost proteosyntézy U prokaryontů - 1 peptidová vazba/ -setiny sekundy U eukaryontů -100 peptidových vazeb/min Polysomy Simultání translace mRNA na více ribosomech Dl f 'i 1 NOVAK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 305. Zatímco jeden ribosom se pohybuje podél mRNA a produkuje polypeptidový řetězec, další ribosom se může vázat do prázdného místa na 5'-konci. Současně může na jedné mRNA působit mnoho ribosomů (s odstupem cca 80 nukleotidů = polyribosom (polysom) 122 Syntéza proteinů v mitochondriích •Mitochondrie obsahují 2-10 kopií uzavřené kruhové, dvouvláknové DNA •Velikost kolísá v závislosti od druhu •Živočišná mitochondriální DNA - Mr~ 107 •Kóduje rRNA, sadu tRNA a mRNA pro několik proteinů •Proteiny syntetizované v mitochodriích jsou nepatrnou frakcí proteinů vnitřní mitochondriální membrány, jsou však esenciální pro průběh oxidatívni fosfory lace (část komplexů 1,111,1 V a ATP synthasy) •Syntéza proteinů v mitochodriích má řadu rysů shodných se syntézou u prokaryontů (iniciace formylmethioninem, citlivost k antibiotikům atd.) 123 Bakteriální mRNA je často polycistronická Obsahuje nukleotidové sekvence pro více než jeden protein Proteiny jsou často metabolický spřažené (např. mRNA obsahuje deset cistronů kódujících 10 enzymů potřebných pro syntézu histidinu) Polycistronická mRNA obsahuje nepřekládané úseky na obou koncích a mezi každým úsekem kódujícím jednu bílkovinu U eukaryontů nejsou polycistronická mRNA Cistron je u bakterií jednotkou genetické exprese 124 Některá antibiotika inhibují syntézu proteinů • Při působení antibiotik jsou využívány rozdíly v mechanismu proteosyntézy u eukaryontů a prokaryontů • Některá antibiotika reagují specificky s proteiny bakteriálních ribosomů • Výsledkem je zastavení proteosyntézy a smrt bakterie • Některá antibiotika mohou působit na eukaryontní mitochondriální proteosyntézu r Účinky antibiotik na proteosyntézu prokaryontů Antibiotikum Účinek Streptomycin Váže se k 30S ribosomální podjednotce, inhibuje tvorbu iniciačního komplexu.Vyvolává chyby ve čtení mRNA. Tet racy kl in Váže se k 30S ribosomální podjednotce a inhibuje vazbu aminoacyl-tRNAdo místa A Chloramfenikol Váže se k 50S ribosomální podjednotce a inhibuje peptidyltransferasu Erytromycin Váže se k 50S ribosomální podjednotce a inhibuje translokaci Puromycin Obsazuje A-místo ribosomu a vyvolává předčasnou terminaci 126 Skládání proteinů (folding) Nascentní polypeptidový řetězec je transportován skrze ribosomy Postupně se dostává mimo „chráněnou" oblast ribosomu a nastává jeho prostorové skládání Skládání (folding) je zprostředkováno zvláštními proteiny - chaperony (heat shock proteins) Poruchy ve skládání - Alzeimerova choroba, BSE? cystická fíbróza ad. 127 Posttranslační modifikace proteinů •Odstranění methioninového zbytku •Změna délky molekuly (odštěpení části polypeptidového řetězce) •Glykosylace •Acetylace •Karboxylace •Methylace •Prenylace • Hydroxylace •Sulfatace ad. Glykosylace proteinů Glykoproteiny Ar-glykosidové 6>-glykosidové Liší se obsahem sacharidů a způsobem syntézy Syntéza N-glykoproteinů Syntéza cukerné složky se odehrává mimo bílkovinu Základem je polyisopren dolichol (viz syntéza cholesterolu) CH3 CH3 H-[CH2-C=CH-CH2]n-CH2-CH-CH2-CH2OH n= 18-20 Dolichol ve formě difosfátu je vázán v membráně ER, na koncový fosfát se postupně napojují aktivované monosacharidy. Hotový oligosacharid se přenese na bílkovinu, je vázán přes asparagin N-glykosidovou vazbou. Ve vazbě na bílkovinu proběhnou konečné úpravy oligosacharidové složky. 130 Glykosylace dolicholu Dolichol-P UDP-GlcNAc UMP Dolichol-P-P-GlcNAc UDP-GlcNAc Enzymy glykosyltransferasy UDP Dolichol-P-P-GlcNAcGlcNAc 9 GDP-Man, 3 UDP-Glc 12 UDP Dolichol-P-P-GlcNAc2Man9Glc3 Dolichol-P-P GlcNAc2Man9Glc3 .AsnXSer. .AsnXSer. Oligosacharidový prekursor vázaný na dolichol MarTI Man Í Man lvi-an GIcNAc Gl chl Ať __ OOUCHOtOlFOSFÁT NOVÁK, Jan. BiochemieI. Brno: Muni, 2009, s. 305. 132 Kotranslační glykosylace cytoplasma ER dolichol Konečné úpravy glykosidové složky v GA 133 Syntéza O-glykoproteinu Probíhá v ER a v Golgiho aparátu OH UDP-monosach. UDP O-monosacharid ser................ .........ser Aktivované monosacharidy se postupně připojují O-glykosidovou vazbou 134 Transport bílkovin do subcelulárních a extracehilárních prostorů (targeting) Syntéza proteinů na volných ribosomech Proteiny zůstávají v cytoplazmě nebojsou transportovány do organel (jádro, mitochondrie). Obsahují sekvenci AK? která směruje jejich transport Syntéza proteinů na RER Transport do lyzosomů, ER, Golgiho komplexu nebo do membrán, sekrece z buňky 135 © Transport proteinů syntetizovaných na RER Signal-recognition particle Ribosome ( "tr ansl o con" ) chai n http://nobelprize.Drg/medicine/ I aureat es/199 9/ill pre s/protein.html 136 Transport proteinů syntetizovaných na RER 1. Translace začíná v cytosolu 2. Jakmile signální peptid opustí ribosom, naváže se na něj signál-rozpoznávající částice (signal recognition particle-SRP). Současně se váže k ribosomu a inhibuje další syntézu 3. SRP částice se váže k SRP receptoru v RER membráně a připoutá ribosom k RER 4. SRP se uvolní a syntéza pokračuje 5. Jakmile signální peptid proniká do RER, signální peptidasajej odstraní 6. Syntéza nascentního proteinu pokračuje a kompletní protein je uvolněn do RER Transport proteinů syntetizovaných na RER-pokr. secretory protein KDEL receptor protein soluble ER resident protein _ Golgi üoigi Figure 13-24b network network StudyBlue: Elashcards - Molecular Exam 3. [online], [cit. 2014-08-15]. Dostupné z: http://www.studvblue.eom/notes/i-iote/n/molecular-exam-3/deck/2630328 138 Transport proteinů syntetizovaných na RER-pokr. • Proteiny syntetizované na RER jsou formou vesiklů transportovány do cis-části Golgiho aparátu • Zde je třídící centrum - strukturní rysy určují, kam bude protein směřován (sorting) • Některé zůstanou v Golgiho aparátu, jiné se vracejí do RER • Další putují ve formě vesiklů do trans části Golgiho aparátu • Zde se oddělují lyzosomy a sekreční váčky • Obsah sekrečních váčků je uvolněn extracelulárně • Hydrofobní proteiny zabudované v membránách váčků se stávají membránovými proteiny 139 Principy intracelulárního třídění (sorting) Příklad 1: proteiny určené pro lyzosomy jsou označeny N-vázanými oligosacharidy zakončenými mannosa-6-P „adresa" je rozpoznána specifickými membránovými receptory v Golgiho aparátu, který protein zabuduje do klathrinem pokrytého vesiklu Clairefontaine - obálka - C6, obyčejná: Activa. [online], [cit. 2014-08-15]. Dostupné z: https://obchod.activa.cz/produkt/clairefontaine-obalka-c6-obycejna-16028/ Principy intracelulárního třídění Příklad 2: Proteiny určené pro ER mají na karboxylovem konci sekvenci Lys-Asp-Glu-Leu Proteiny jsou z Golgiho aparátu transportovány zpět do ER Clairefontaine - obálka - C6, obyčejná: Activa. [online], [cit. 2014-08-15]. Dostupné z: https://obchod.activa.cz/produkt/clairefontaine-obalka-c6-obycejna-16028/ © Příklad posttranslační úpravy: syntéza insulinu PREPROINZULIN PROINZULIN C-PEPTID C-PEPTID VODÍCÍ PEPTID [23AK) NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 309. Na ribosomech RER se syntetizuje preproinsulin Po vstupu do ER se odstraní vodící peptid Vytvoří se dva disulfidové můstky Proinsulin putuje do Golgiho aparátu, zde začíná proteolýza a ukládání do sekrečních granul Granula putují cytoplazmou k plazmatické membráně Po stimulaci fúzují s membránou a inzulin se vylévá do extracelulárního prostoru 142 Výsledná struktura insulinu INZULÍN NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 310. Na ribosomech RER se syntetizuje preproinsulinu Po vstupu do ER se odstraní vodící peptid Vytvoří se dva disulfidové můstky Pro insulin putuje do Golgiho aparátu, zde začíná proteolýza a ukládání do sekrečních granul Granula putují cytoplazmou k plazmatické membráně Po stimulaci fúzují s membránou a inzulín se vylévá do extracelulárního prostoru 143 Regulace genové exprese Genová exprese - tvorba proteinů nebo RNA produktů Obvykle je v daném čase exprimována jen malá část genů přítomných v buňce Genová exprese je regulována rozdílně u prokaryontů a eukaryontů Základní rysy genové exprese u prokaryontu NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 311. Jediná kruhová DNA v buňce DNA není komplexována s histony Jádro není odděleno od cytoplazmy Transkripty genů neobsahují introny Translace a transkripce probíhají simultánně 145 Regulace genové exprese u prokaryontů Jednodušší regulační mechanismy než u eukaryontů Regulace probíhá na úrovni iniciace transkripce 146 Operonová teorie Strukturní geny u bakterií jsou často sdružovány do operonů OPERON r 1 PROMOTOR CENÍ GEN 2 GEN 3 l i í 1 1 r 1 1 j 1 i DNA RNA PROTEIN 1 PROTEIN 1 PROTEIN 3 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 311. 147 Operon •Zahrnuje strukturní geny pro proteiny metabolický spřažené •Geny v operonu jsou většinou exprimovány koordinovaně (jsou buď všechny „vypnuly'\ nebo všechny „zapnuty") •Produktem transkripce je polycistronická mRNA •Transkripce je regulována jediným promotorem 148 Regulace RNA polymerasy represorem - negativní kontrola s\s\/\/\s\/\ DPEft.-.TŮR GEN 1 GEN 2 GEN í NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 312. Represor je kódován regulačním genem Po syntéze represor difunduje k promotoru a váže se v oblasti nazývané operátor (většinou součást promotoru) Represor blokuje vazbu RNA-polymerasy k promotoru Syntéza mRNA neprobíhá 149 Represor je kontrolován dvěma mechanismy Indukce Induktor je malá molekula, která se váže k represoru, mění jeho konformaci a vyvolá odpojení od operátoru Transkripce může začít Induktory: malé molekuly živin nebo jejich metabolity Koreprese Represor není aktivní, pokud se na něj neváže korepresor. Komplex represor-korepresor se váže na DNA a brání navázání RNA-polymerasy Transkripce neprobíhá Korepresory: malé molekuly živin nebo jejich metabolity 150 Příklad indukce Indukce lac operonu laktosou u E.coli Enzymy pro metabolismus glukosy glykolýzou jsou u E.coli produkovány konstitutivně Je-li přidána laktosa, buňky se adaptují a začnou produkovat další enzymy kódované lac operonem Jako induktor slouží allolaktosa (isomer laktosy, vznikající spontánně), váže se k represoru a inaktivuje jej. RNA polymerasa se může vázat k promotoru a přepisuje strukturní geny v lac operonu a produkuje polycistronickou RNA, která kóduje tři další enzymy (p-galaktosidasu, permeasu a transacetylasu) * Děj probíhá, pokud je v buňce nedostatek glukosy (viz obr.68) 151 Příklad koreprese Koreprese trp operonu (syntéza tryptofanu u E.coli) Geny pro enzymy syntézy tryptofanu (celkem 5 enzymů) jsou soustředěny v trp operonu Tryptofan je korepresorem, váže se k inaktivnímu represoru, mění jeho konformaci. Komplex tryptofan-represor inhibuje transkripci operonu. 152 Stimulace RNA polymerasy - pozitivní kontrola Regulační proteiny se vážou k promotoru a stimulují navázání RNA-polymerasy regulační protein je aktivován na základě přítomno st i/nepřítomno st i molekuly živiny (nebo jejího metabolitu) v buňce 153 Příklad pozitivní kontroly Vliv přítomnosti glukosy na lac operon u E.coli Transkripce lac operonu může být indukována allolaktosou (obr.65) pouze v nepřítomnosti glukosy Pokles hladiny glukosy v buňce vyvolá zvýšení hladiny cAMP (není známo proč) cAMP se váže ke svému receptoru v buňce (cAMP-receptor CRP) cAMP-CRP komplex se váže do regulační oblasti lac operonu, stimuluje vazbu RNA polymerasy k promotoru a transkripci genů pro metabolismus laktosy —> buňka metabolizuje laktosu, pouze pokud nemá k dispozici glukosu 54 Atenuace transkripce Předčasná terminace změnou sekundární struktury mRNA Součástí operonu je sekvence zvaná atenuátor (zpomalovač) Současně s transkripcí probíhá i translace Rychlost translace ovlivňuje tvorbu smyček na mRNA 155 Atenuace transkripce - trp operon E.coli 5' mRNA 1 Nízká konc.Trp Ribosom je zpomalen Vysoká konc.trp Rychle se pohybující ribosom Sekvence 1 obsahuje kodony pro Trp 156 Atenuace • mRNA je přepisována a současně ribosomy začínají syntetizovat protein. • RNA polymerasa je následována pohybujícím se ribosomem • Blízko 5'konce transkriptu je řada kodonů pro trp. • Na počátku je koncentrace trp vysoká, je vysoká i koncentrace trp-tRNA a probíhá rychlá translace (ribosom se pohybuje rychle). • Rychlý pohyb ribosomu vytvoří v mRNA smyčku, která slouží jako terminační signál pro RNA polymerasy a transkripce končí. • Jsou-li koncentrace trp nízké, hladiny trp-tRNA jsou nízké, ribosom se zpomalí, RNA polymerasa může dokončit transkripci operonu •Úroveň transkripce je nastavena podle hladiny trp v buňce 157 Regulace exprese v eukaryontních buňkách Základní rysy genové exprese u eukaryontů (rozdíly od prokaryontů): • DNA je organizována v nukleosomech • gen se při expresi dostává do aktivní formy • nejsou přítomny operony • geny kódující metabolický spřažené děje (dráhy) leží na různých chromozomech • každý gen má svůj vlastní promotor • transkripce a translace jsou odděleny 158 © Úrovně regulace genové exprese u eukaryontů •A) ovlivnění na úrovni DNA a chromozomů •B) ovlivnění transkripce •C) úprava transkriptů •D) ovlivnění iniciace translace 159 Regulace dostupnosti genu pro transkripci V buňkách diferencovaných tkání se projevují jen ty geny, které v dané buňce mají nějakou úlohu Kondenzovaný (heterochromatin) - geny j sou neaktivní Difuzní (euchromatin)- geny produkují mRNA Během vývoje dochází ke změnám v aktivitě genů, chromatin přechází z kondenzované formy do difuzní a naopak. 160 Chromatin v jádře: A) Příklady ovlivnění genové exprese na úrovni struktury chromosomu > remodelace chromatinu > methylace DNA > přeskupení genové DNA > genová amplifíkace > delece genu 161 Remodelace chromatinu - změna stavu chromatinu, která vede k aktivaci transkripce —» uvolnění nukleosomu z chromatinu Mechanismy remodelace: • Rozvinutí určitého úseku DNA z nukleosomu s využitím štěpení ATP • Kovalentní modifikace histonových konců acetylací (acetylace s -aminoskupiny v postranním řetězce lysinu na N-koncích histonů H2A,H2B,H3 a H4). 162 Methylace DNA Methylace cytosinových zbytků v DNA —» 5-methylcytosin Probíhá často v oblastech bohatých na GC-sekvence v blízkosti promotorové oblasti genu (postsyntetická modifikace DNA - enzym methylasa) Geny, které jsou methylovány jsou často méně snadno transkribovány Př.: geny pro globin jsou methylovány v neerythroidních buňkách (syntéza hemoglobinu zde neprobíhá), v erytroblastech a retikulocytech (prekursory erytrocytů) tyto geny methylovány nejsou 163 Přeskupení genů Segmenty DNA se mohou v rámci genomu přeskupovat a asociovat s jinými geny Př.: Přeskupení genů v buňkách produkujících protilátky (imunoglobuliny) (viz Imunologie) 164 Amplifikace genu Při genové amplifíkaci určitá oblast chromosomu podléhá opakovaným cyklům DNA replikace Nově syntetizovaná DNA je vystřižena a tvoří malé, nestabilní chromosomy (double minutes) Ty se integrují do jiných chromosomu a příslušný gen je tak amplifíkován Normálně je amplifikace vyvolána chybami při DNA replikaci a buněčném dělení - za určitých okolností mohou být v genomu zakódovány Př.: U pacientů léčených methotrexátem (inhibitor dihydrofolátreduktasy) se vyvinula resistence na lék (lék přestal být účinný). Příčinou je zvýšení počtu genů pro dihydrofolátreduktasu v důsledku amplifikace. 165 B) Regulace na úrovni transkripce Základní regulace transkripce (společná všem genům) Regulace složkami „bazálního transkripčního komplexu" (RNA polymerasa vážící se k TATA boxu, TATA vážící se proteiny a další „bazálni" transkripční faktory vážící se s RNA-polymerasou nebo v oblasti promotoru) Geny regulované pouze tímto způsobem : Konstitutivně exprimované geny Specifické ovlivnění genové exprese: Prostřednictvím regulační sekvence v DNA a specifických transkripčních faktorů. Promotor u eukaryontů Eli karyote promoter Transcribed sequence 5 1-h Open reading frame f f I I ATG Stop -90 -75 -30 +1 / i \ CAAT — GGGCGG-TATAAAA ■1 KrTůmá±Ufbůfí2013 Animal Genetics - Gene exoression. [online], [cit. 2014-08-15]. Dostupné z: http://web2.mendelu.cz/af 291 projekty2/vseo/stranka,php?kod=307 Vazba bazálních transkripčních faktorů 167 Terminologie Starší terminologie : Enhancery - regulační sekvence v DNA, které vážou transaktivátory Transaktivátory vážou koaktivátory Silencery - regulační sekvence, které vážou korepresor Hormony se vážou k intracelulárnímu receptoru a ten se váže k hormon-response elementu Tyto termíny jsou stále užívány. Jsou postupně nahrazovány termíny: regulační sekvence v DNA (enhancer, silencer, hormon response element) specifické transkripční faktory (odlišné od bazálních transkripčních faktorů) mediátorové proteiny (koaktivátory) 168 Regulační sekvence genu HRE enhancer *............................... Specifické ^............................................................."Iranskripční faktory ...................]^^Mediátorové * : proteiny HR - receptor hormonu HRE - hormon responsible element promotor RNA-polymerasa Bazálni transkripční faktory 169 Genově specifické regulační proteiny (komentář k předchozímu obrázku) Regulační oblasti na DNA jsou tvořeny oblastí promotoru a dalších regulačních sekvencí. V oblasti promotoru se vážou bazálni transkripční faktory. Bazálni transkripční komplex - obsahuje RNA polymerasu a bazálni transkripční faktory. Specifické transkripční faktory - proteiny, které se vážou v regulačních sekvencích mimo promotor, často velmi vzdálených. Působí jako aktivátory nebo represory transkripce příslušného genu. Specifické transkripční faktory interagují s mediátorovýnmi proteiny (koaktivátory, korepresory), které jsou v kontaktu s bazálními transkripčními faktory. 170 Transkripční faktory, které jsou jadernými receptory hormonů (receptory steroidních a thyroidních hormonů) •Receptory těchto hormonů jsou specifickými transkripčními faktory. Vážou se s navázaným hormonem v regulační oblasti DNA (tato oblast se nazývá hormon response element HRE) •Receptor s hormonem navázaný na DNA reaguje rovněž s koaktivátorem (mediátorový protein), který je v kontaktu s bazálním transkripčním komplexem. Tím se vypíná nebo zapíná proces transkripce 171 Jaderné receptory •Rodina vzdáleně příbuzných regulačních proteinů odpovědných za modulaci genové exprese •Hlavní skupinou jsou steroidní-thyreoidní receptory • Androstanový receptor AR •Estrogenový receptor ER •Progesteronový receptor PR •Glukokortikoidní receptor GR •Mineralokortikoidní receptor MR Př.l: Glukokortikoidový receptor (GR) GR se nachází v cytoplazmě Po navázání kortisolu se zmení jeho konformace a na povrchu se vystaví signál pro směřování do jádra (adresa) Receptor s hormonem se přesouvá (translokuje) do jádra, kde se váže na glukokortikoid-HRE v regulační oblasti daného genu (GRE) Transaktivační doména receptoru se váže k mediátorovým proteinům a tím vyvolá aktivaci transkripce příslušných genů (a inhibici transkripce genů jiných). 173 giukokortikoid Posttranskripční a negenomové účinky glukokortikoidů: Remedia. [online], [cit. 2014-08-15]. Dostupné z: http://www.remedia.cz/Okruhv-temat/Farmakologie/Posttranskripcni-a-negenomove-ucinkv-glukokortikoidu/8-10-Oo.magarticle.aspx 174 GR receptory GR je exprimován prakticky ve všech tkáních Spektrum genů řízených GR je velmi široké Některé jsou regulovány positivně, jiné negativně Transkripční aktivita GR závisí také na koaktivátorech a může být též ovlivněna fosforylací kinázami Degradace receptoru ubiquitin/proteasomem - její rychlost rovněž ovlivňuje transkripční aktivitu 175 Př.2 Receptor thyroidních hormonů tvoří dimer s receptorem retinoidním (RXR) Vážou se k thyroidnímu HRE a ke korepresou Tím je inhibována exprese příslušného genu Po navázání thyroidního hormonu vyvolají konformační změny HRE a korepresoru iniciaci transkripce 176 © Př.3 Retinoidní receptor RXR (váže cis-retinovou kyselinu) tvoří dimer s nejméně 8 dalšími jadernými receptory Každý z dimerů má jinou vazebnou specifítu k DNA RXR se tak podílí na regulaci exprese řady genů 177 Struktura proteinů vážících se na DNA U specifických transkripčních faktorů bylo identifikováno několik strukturních motivů: helix-smyčka-helix, helix-otočka-helix, zinkový prst, leucinový zip. Uvedené strukturní motivy zprostředkují specifickou vazbu proteinu k DNA. Za kontakt je odpovědná pouze malá část molekuly (obvykle oc-helix), často se jedná o dvě blízká místa v molekule, zbytek molekuly zajišťuje správnou informaci. Kontakt obvykle probíhá v oblasti tzv. major groove ve struktuře DNA. Princip interakce : „.....regulační protein se váže, když je instruován, že se má vázat......„ 178 Př.: Zinkový prst (zinc finger) Oblast sloužící k vnoření do dvoušroubovice DNA 180 Zinkový prst Nachází se v DNA vazebných doménách receptorů pro steroidní hormony. Zn2+je chelatován ve 4 pozicích buď histidinem nebo cysteinem Zn2+ udržuje terciární strukturu domény NRS (nucleotide recognition signal) - a-helix obsahující sekvenci aminokyselin, která slouží k rozpoznání specifické sekvence v major groove DNA 181 Regulace (ovlivnění) působení transkripcních faktorů Down(up)-regulace tvorby Modulace působení vazbou stimulačních a inhibičních ligandů Vzájemná kooperace transkripcních faktorů Fosforylace/ defosforylace transkripcních faktorů řízená růstovými faktory, cytokiny, peptidovými hormony atd. 182 C) Regulace genové exprese úpravou transkriptů Alternativní sestřih Alternativní sestřih a variace místa polyadenylace na 3'konci způsobuje, že jediný gen může produkovat různé proteiny (viz předchozí přednáška) Editace RNA V některých případech může být RNA po transkripci editována. Primární transkript (hnRNA) je shodný, po transkripci dojde k záměně bazí nebo přidání (odstranění) nukleotidu 183 Editace RNA Syntéza apoB v hepatocytech a enterocytech CAA Gen apoB CAA transkript hepatocyt enterocyt mRNA- CAA 'UAA- translace Jaterní apoB -4563 AK Intestinální apoB - 2152 AK 184 Syntéza apoB v hepatocytech a enterocytech (je součástí chylomikronů a VLDL) Komentář k předchozímu obrázku: Gen apoB produkuje v játrech protein obsahující 4563 AK Tentýž gen v enterocytech produkuje apoB obsahující jen 2152 AK Konverze C(cytosin) na U (uracil) deaminací v RNA transkriptu generuje stop-kodón v intestinální mRNA. Tak protein produkovaný v enterocytu má pouze 48 % délky proteinu hepatálního 185 D) Regulace proteosyntézy na úrovni translace Ovlivnění aktivity eukaryotických iniciačních faktoru (EIFs) Př. Syntéza globinu v retikulocytech Faktor EIF2 je aktivní ve fosforylované formě, neaktivní v defosforylované formě. Přítomnost hernu zabraňuje fosforylaci EIF2. —> pokud je v buňce přítomen hem, EIF2 je nefosforylován, je aktivní a syntéza globinu probíhá. Není-li v buňce hem, EIF2 je neaktivní, syntéza globinu neprobíhá 186