© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 1
11 – Nukleové kyseliny
Nukleové kyseliny hrají v našem těle velice důležitou roli – molekuly DNA uchovávají genetickou
informaci (využívají k tomu proces zvaný replikace) a molekuly RNA zajišťují vyjádření této
informace (nejprve pomocí přepisu a následně pomocí translace). O jednotlivých procesech se
budeme bavit podrobněji v dalších částech této kapitoly.
Nejprve se ale zaměříme na strukturu nukleových kyselin. Základními stavebními jednotkami
nukleových kyselin jsou nukleotidy. Ty se skládají z pentosy (ribosy nebo deoxyribosy), fosfátu a
báze (purinové nebo pyrimidinové).
11.1 Vznik nukleotidů
Všechny buňky potřebují pro svou činnost nukleosidy, nukleotidy a jejich deriváty (jak pro
replikaci DNA, tak pro syntézu mRNA, rRNA, tRNA…). Jejich příjem potravou je velmi nízký
(špatná resorpce ve střevě, především resorpce purinových a pyrimidinových bází je malá), proto
je potřeba, aby si je tělo umělo samo syntetizovat.
A) Látky potřebné pro syntézu nukleotidů
Pro tuto syntézu jsou velmi důležité tři sloučeniny:
 tetrahydrfolát
 glutamin
 PRPP – fosforibosyldifosfát
Tetrahydrofolát
Tetrahydrofolát tělo získává úpravou kyseliny listové, která je esenciální (je tedy potřeba ji
přijímat potravou např. z listové zeleniny, jater, kvasnic a žloutku).
Přijatý folát prochází dvěma hydrogenacemi, které zajišťují enzymy folátreduktasa a
dihydrofolátreduktasa (kofaktor NADPH+H+
). Při reakci dochází k odstranění dvou dvojných
vazeb:
N
N
N
N
CH2 NH C
O
NH CH
COO
-
CH2
CH2
COO
-
OH
NH2
NADPH+H+
NADP+
FOLÁTREDUKTASA
folát
N
N
N
H
N
CH2 NH C
O
NH CH
COO
-
CH2
CH2
COO
-
OH
NH2
NADPH+H+
NADP+
DIHYDROFOLÁTREDUKTASA
dihydrofolát
N
N
N
H
N
H
CH2 NH C
O
NH CH
COO
-
CH2
CH2
COO
-
OH
NH2
tetrahydrofolát
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 2
Tetrahydrofolát je přenašečem jednouhlíkových zbytků – konkrétně je při syntéze nukleotidů
využit k syntéze thyminu (přenáší methylenovou skupinu –CH2–) a při syntéze purinů (přenáší
formyl –CHO):
N
1
N
3
N
5
N
H
CH2 N
10
C
O
NH CH
COO
-
CH2
CH2
COO
-
OH
NH2
CH2
N-5,N-10-methylen-tetrahydrofolát
N
1
N
3
N
H
5
N
H
CH2 N
10
C
O
NH CH
COO
-
CH2
CH2
COO
-
OH
NH2
C
O H
N-10-formyl-tetrahydrofolát
Enzym (dihydro)folátreduktasa je velice důležitý pro syntézu tetrahydrofolátu a vznikající
tetrahydrofolát je velice důležitý pro syntézu nukleotidů (bez jeho činnosti nevznikají).
Nukleotidy jsou zase potřeba pro syntézu DNA, která je jedním z procesů probíhajících v
buněčném cyklu (S-fáze). Některé léky inhibují činnost tohoto enzymu a tím zabraňují množení
buněk – toho se využívá:
 v protinádorových léčivech (methotrexát)
 v léčivech antibakteriálních (trimethoprim; inhibuje bakteriální dihydroflátreduktasu)
N
N CH2 N C
O
NH CH
COO
-
CH2
CH2
COO
-
NH2
NH2
CH3
methotrexát
N
NH2
NH2
OCH3
OCH3
OCH3trimethoprim
Glutamin
Glutamin je jednou z AK, o jeho metabolismu bylo pojednáno v kapitole 6. Při syntéze nukleotidů
jeho význam tkví v tom, že dodává (tedy je donorem) aminoskupiny pro puriny i pyrimidiny.
C
O
NH2
CH2 CH2 CH COO
-
NH3
+
Dělící se buňky potřebují hodně glutamátu (aby mohly syntetizovat puriny a pyrimidiny).
Přidáním glutaminu do organismu můžeme usnadnit dělení buněk – toho se využívá např.
v případě, potřebujeme-li zvýšit počet imunitních buněk. Ovšem přesně opačné činnosti
(zamezení příjmu glutamátu) se využívá k zastavení dělení buněk.
Podobného principu využívají některé léčiva, která slouží jako inhibitory enzymů, které využívají
glutamin (léčiva jsou glutaminu strukturně podobná, obsadí tak aktivní místa enzymů a
neumožní glutaminu vstoupit do kostry purinu, či pyrimidinu). Příkladem takového látky je
azaserin.
C
O
CH
O CH2 CH COOH
NH2
N
N
azaserin
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 3
Fosforibosyldifosfát (PRPP)
PRPP je nezbytný pro syntézu purinových i pyrimidinových nukleotidů, ale kromě toho také pro
syntézu NAD+
a NADP+
.
Získáme jej reakcí ribosa-5-fosfátu (který jsme získali v pentosovém cyklu) s ATP. ATP předá
molekule ribosa-5-P dva fosfáty a stane se z něj AMP, ribosa-5-P se přemění na PRPP. O PRPP
můžeme říct, že se jedná o aktivovanou pentosu.
Reakci katalyzuje enzym PRPP-synthetasa.
B) Syntéza purinů a pyrimidinů
Syntéza purinů a pyrimidinů probíhá jako puzzle – do molekuly výsledné báze jsou postupně
přidávány kousky z jiných molekul, aby nakonec vytvořily požadovanou strukturu.
Rozdíl v syntéze purinů a pyrimidinů je již v začátku. Při syntéze purinů je nejprve
nasyntetizováno PRPP, na které se následně napojí různé skupiny, které dají základ budoucí bázi,
u syntézy pyrimidinů je nejprve vytvořena báze, na kterou se poté naváže ribosa-5-P z PRPP.
Na jednotlivé kroky syntézy se nyní podíváme podrobněji. Není zcela potřebné vědět, jak probíhá
syntéza heterocyklických kruhů krok za krokem. Velmi důležitá je ale znalost původu
jednotlivých atomů v jejich molekulách.
Syntéza pyrimidinů
Původ atomů:
Jednotlivé kroky syntézy pyrimidinů:
a) V cytoplasmě vznikne karbamoylfosfát z glutaminu (zdroj dusíku) a HCO3
–
. Reakce je
energeticky náročná – pro její průběh je potřeba dodat 2 ATP.
Reakci katalyzuje enzym karbamoylfosfátsynthetasa II1
, která je inhibována pomocí UTP
(„inhibice produktem“) a aktivována pomocí ATP.
1
Enzym karbamoylsynthetasa I se vyskytuje v mitochondriích a účastní se syntézy močoviny.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 4
b) Karbamoylfosfát následně reaguje s aspartátem za vzniku karbamoylaspartátu.
c) Vyloučením vody se uzavře cyklus, který v tom stavu nazýváme dihydroorotát.
d) Dihydrorotát je potřeba dehydrogenovat, aby se vytvořila dvojná vazba, čímž vzniká orotát.
e) Na orotát se napojí PRPP, čímž se vytvoří orotidinmonofosfát.
f) Orotidinmonofosfát následně podlehne dekarboxylaci, čímž se z něj vytvoří UMP –
uridinmonofosfát. Z toho je následně možné vytvořit UTP, CTP i dTMP (bude popsáno dále).
Výše popsané kroky jsou pomocí vzorců znázorněny níže:
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 5
Jak bylo zmíněno v bodě f), dekarboxylací orotidinmonofosfátu vzniká uridinmonofosfát (UMP).
UMP je základ pro další báze – reakcí s dvěma molekulami ATP z něj postupně vzniká UDP a UTP.
Z UTP je následně možné vytvořit CTP (cytidintrifosfát) tím, že na něj přeneseme –NH2 skupinu
z glutaminu (reakce je opět energeticky náročná a vyžaduje spotřebu dalšího ATP).
Poslední pyrimidinovou bází, kterou jsme ještě nezmínili je dTMP (deoxythimidinmonofosfát).
Pro jeho vznik je nutné nejprve vytvořit methylen-tetrahydrofolát. Ten získáme reakcí serinu
s tetrahydrofolátem (serin odevzdá methylenovou skupinu a přemění se na glycin).
Dále je potřeba odstranit jednu –OH skupinu ribosy patřící UDP, čímž vznikne dUMP
(deoxyuridinmonofosfát).
dUMP následně může reagovat s methylen-tetrahydrofolátem za vzniku dTMP. Methylenová
skupina –CH2– se během reakce redukuje na methylovou skupinu –CH3, tetrahydrofolát se mění
na dihydrofolát (poskytne vodíky na redukci methylenové skupiny na methylovou). Reakci
katalyzuje enzym THYMIDYLÁTSYNTHASA.
Dihydrofolát je potřeba následně regenerovat (oxidovat) na tetrahydrofolát. Reakci katalyzuje
enzym DIHYDROFLÁTREDUKTASA (její název byl již zmíněn při vzniku tetrahydrofolátu z folátu), kofaktorem
reakce je NADPH+H+
.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 6
Výše zmíněných kroků syntézy dTMP se účastnily dva enzymy, z nichž oba dva jsou cílem
protinádorové terapie.
Způsob ovlivnění dihydrofolátreduktasy byl popsán již výše – je možné ji inhibovat působením
metotrexátu a dalších léčiv (inhibicí enzymu zabráníme regeneraci dihydrofolátu na
tetrahydrofolát, čímž zabráníme mj. vzniku dTMP).
O funkci tohoto enzymu se ví již velmi dlouho – dihdrofolátreduktasa byla prvním enzymem, na
který se zaměřila protinádorová terapie, poprvé byl pro její inhibici použit aminopterin (váže se
na enzym až 1000x pevněji než folát, čímž enzym vyřadí z funkce jako kompetitivní inhibitor).
Všechny léky, které ovlivňují syntézu purinů a pyrimidinů, poškozují rychle dělící se buňky – to
však nejsou pouze buňky nádorové, ale i buňky kostní dřeně, GI-traktu a např. i buňky vlasových
folikulů.
Thymidylátsynthasa je inhibována podáváním fluorouracilu. Ten je
v organismu přeměněn na 5-fluorodeoxyuridinmonofosfát, který však nemůže
být dále přeměněn na dTMP. Thymidylátsynthasa je jím proto blokována jako
kompetitivním inhibitorem, což ve výsledku zabrání vzniku dTMP, což se
projeví zpomalením (znemožněním) buněčného dělení.
Druhý způsob vzniku pyrimidinových nukleotidů šetřícím procesem aneb salvage pathway
Syntetizovat všechny nukleotidy de novo by bylo pro buňku velice energeticky náročné. Proto
existuje i druhý, šetřící, způsob, který nesyntetizuje nukleotidy zcela de novo, ale využívá
nukleotidů vzniklých při rozkladu nukleových kyselin.
Lze rozlišit dva kroky salvage pathway:
1) Tvorbu nukleosidů
Molekuly nukleových kyselin jsou rozloženy na nukleotidy, ty na nukleosidy a ty na jednotlivé
báze – v případě pyrimidinových bází se jedná o cytosin, uracil a thymin.
Jednotlivé báze následně reagují:
a) v případě uracilu a cytosinu s ribosa-1-fosfátem za vzniku uridinu a cytidinu
b) V případě thyminu a cytosinu s deoxyribosa-1-fosfátem za vzniku deoxythymidinu a
deoxycytidinu
2) Tvorbu nukleotidů
Nově vzniklé nukleosidy následně reagují s ATP za vzniku potřebných nukleotidů působením
patřičných kináz:
a) cytidin + ATP → CMP + ADP
b) uridin + ATP → UMP + ADP
c) deoxythymidin + ATP → dTMP + ADP
d) deoxycytidin + ATP → dCMP + ADP
Salvage pathway hraje významnou roli především v extrahepatálních tkáních.
Regulace syntézy pyrimidinů
Syntéza pyrimidinů je regulována:
a) allostericky
Allostericky je ovlivňována karbamyolsynthetasa II – inhibici zajišťuje UTP a purinové
nukleotidy; aktivaci zajišťuje PRPP2
(tzn. je-li dost PRPP, může probíhat syntéza)
2
Syntéza samotného PRPP je ale inhibována velice komplikovaným způsobem (jeho popis je nad rámec
tohoto textu)
NH
NH
O
O
F
5-fluorouracil
pro DNA
pro RNA
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 7
b) v závislosti na buněčném cyklu
Syntézu pyrimidinových nukleotidů ovlivňuje i to, ve které fázi buněčného cyklu se
buňka, ve které syntéza probíhá, nachází.
Syntéza nukleotidů musí probíhat v S-fázi (dochází k replikaci DNA). Právě v S-fázi je
enzym karbamoylsynthetasa II méně senzitivní k inihibici pomocí UTP, ale více
senzitivní k aktivaci pomocí PRPP
Odbourávání pyrimidinů
Pyrimidinové báze jsme schopni v našem těle odbourat na jednodušší složky, které je možné
vyloučit močí. Toho nejsme schopni u purinových bází!
Odbourávání pyrimidinů v sobě zahrnuje:
a) odštěpení fosfátu
b) odštěpení cukerné složky
c) štěpení dusíkaté báze
Štěpení dusíkatých bází probíhá dle následujícího schématu:
N
NH
NH2
O
cytosin
DEAMINACE
H2O NH3
NH
NH
O
O
uracil
REDUKCE
NADH+H+ NAD+
NH
NH
O
O
OTEVŘENÍ
CYKLU
H2O
NH2
NH
O
O
OH
ROZKLAD
H2O
HOOC
NH2
CH2
CH2
NH3
CO2
NH
NH
O
O
CH3
thymin
REDUKCE
NADH+H+ NAD+
NH
NH
O
O
CH3 OTEVŘENÍ
CYKLU
H2O
NH2
NH
O
O
OH
CH3
ROZKLAD
H2O
HOOC
NH2
CH
CH2
CH3
NH3
CO2
-alanin
-aminoisobutyrát
Není zcela nutné znát štěpení kruhu krok za krokem. Zásadní je vědět, že:
 odbouráním cytosinu a uracilu vzniká amoniak, oxid uhličitý a β-alanin
 odbouráním thyminu vzniká amoniak, oxid uhličitý a β-aminoisobutyrát
Všechny vzniklé metabolity je možné z těla dobře odstranit (oxid uhličitý lze vydýchat, amoniak
je upraven v močovinovém cyklu na močovinu a vyloučen močí, β-alanin a β-aminoisobutyrát
jsou dobře rozpustné a lze je rovněž vyloučit močí).
Syntéza purinů
Původ atomů:
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 8
K syntéze purinů dochází v cytosolu, převážně v jaterních buňkách. Jednotlivé kroky ještě více
připomínají puzzle – na ribosa-5-fosfát se napojují jednotlivé atomy vznikající báze. Pouze glycin
(krok 3) poskytuje své oba uhlíky a dusík, všechny ostatní sloučeniny poskytují vždy jen jeden
atom uhlíku nebo dusíku.
Podrobněji:
Ke schématu: Nově přidaná část je vždy znázorněna zelenou barvou. Schéma je uvedeno spíše pro zajímavost.
Poznámka: Báze, která se tímto složitým způsobem vytvořila, se nazývá hypoxanthin (od ní odvozený nukleotid má
však název inosinmonofosfát).
Vzniklý IMP je výchozí látkou pro syntézu ostatních purinových bází.
 aminací kyslíku na uhlíku C6 vzniká adenosinmonofosfát (AMP); dusík pochází
z aspartátu a energii dodává GTP
 oxidací uhlíku C2 vzniká XMP (xanthosinmonofosfát), jehož aminací získáme GMP
(guanosinmonofosfát); dusík pro aminaci pochází z glutaminu, energii dodává ATP
Výše popsané znázorňuje schéma na následující stránce:
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 9
Přeměnu IMP na XMP katalyzuje enzym IMP-dehydrogenasa. Tento enzym je možné inhibovat
pomocí kyseliny mykofenolové – jedná se o účinný reversibilní inhibitor, který se používá při
prevenci rejekce transplantátů. Tím, že ve výsledku inhibuje formu GMP, potlačuje proliferaci Ti
B-lymfocytů.
O
CH3
O
O
OH
CH3
OH
O
CH3
kyselina mykofenolová
Samozřejmě i syntéza purinů je cílem protinádorových léčiv.
 syntézu purinů omezují inhibitory dihydrofolátreduktasy (metotrexát…), které zabraňují
regeneraci dihydrofolátu
 jelikož i pro syntézu purinů je potřeba glutamin, jsou jeho analogy, jako
azaserin, účinnými inhibitory příslušných enzymů
 strukturně velice podobnou sloučeninou k IMP je merkaptopurin – místo
kyslíku obsahuje na uhlíku C6 –SH skupinu; používá se jako inhibitor
přeměny IMP na AMP i GMP
Druhý způsob vzniku purinových nukleotidů šetřícím procesem aneb salvage pathway
Stejně jako existovala salvage pathway u pyrimidinových nukleotidů, existuje i u nukleotidů
purinových a význam má opět především v extrahepatálních tkáních.
Reakce obecně probíhají tak, že uvolněné purinové báze (vzniklé při rozkladu nukleových kyselin)
reagují s PRPP za vzniku purinnukleotidmonofosfátů a PPi:
purin + PRPP → purinnukleotidmonofosfát + PPi
Tyto reakce katalyzují enzymy zvané fosforibosyltransferasy, konkrétně:
 vznik AMP katalyzuje adeninfosforibosyltransferasa
 vznik IMP katalyzuje hypoxanthinfosforibosyltransferasa
Jejich úkolem je přenést purinovou bázi na PRPP.
N
N
NH
N
SH
merkaptopurin
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 10
Organismus počítá s tím, že salvage pathway bude probíhat! Pokud dojde k poškození některé
z fosforibosyltransferas, dochází k hromadění purinů v organismu, což se projeví jako
Lesh-Nyhanův syndrom.
Lesh-Nyhanův syndrom je dědičná choroba, při které není možné přeměnit uvolněné purinové
báze na nové nukleotidy. Jsou proto odbourávány na kyselinu močovou, která se následně také
hromadí v organismu, což se projeví jako onemocnění dna. Postižení jedinci trpí mentální
retardací a sebepoškozováním.
Vznik nukleosiddifosfátů a nukleosidtrifosfátů
Doposud jsme popsali pouze způsoby vzniku GMP a AMP. Další fosfáty je možné na tyto
nukleosidmonofosfáty napojit postupnými reakcemi s ATP. Reakce katalyzují příslušné kinázy.
Regulace syntézy purinových nukleotidů
Existují dva způsoby regulace:
a) inhibice enzymu PRPP-glutamylamidotransferasy3
pomocí AMP a GMP (regulace produkty)
b) inhibice přeměny IMP na AMP a IMP na GMP je rovněž inhibována prudukty (AMP inhibuje
svou syntézu, GMP inhibuje svou syntézu)
Odbourávání purinových nukleotidů
K „odbourávání“ purinových nukleotidů dochází v játrech. Z jednotlivých nukleotidů (AMP, GMP,
ale i IMP a XMP) jsou odstraněny fosfáty (vzniká adenosin, guanosin, inosin a xanthosin).
Adenosin obsahuje –NH2 skupinu, kterou je potřeba odstranit a vytvořit z něj inosin, ze kterého
je pak (stejně jako u guanosinu a xanthosinu) odstraněna ribosa, čímž vzniknou samostatné báze
hypoxantin, guanin a xantin.
Zmiňované odstranění aminoskupiny z adenosinu katalyzuje enzym adenosindeaminasa. Má-li
tělo nedostatek tohoto enzymu, dochází k hromadění adenosinu, který je následně přeměňován
na AMP, dAMP, ADP… Hromadění těchto produktů inhibuje enzym ribonukleotid-reduktasu,
který tak nesyntetizuje další nukleotidy, což vede k zatavení syntézy DNA (buňka má jen AMP,
ADP… ale nemá již GMP, GDP…). Deficience tohoto enzymu je jednou z příčin těžkého
kombinovaného imunodeficitu (severe combined imunodeficiency dinase – SCID).
3
Tento enzym katalyzuje napojení prvního dusíku na PRPP, tedy první krok syntézy purinových nukleotidů
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 11
Uvolněné purinové báze tělo neumí odbourat na jednodušší sloučeniny! Jediný možný způsob,
jak se jich zbavit, je hydroxylace na kyselinu močovou. Denně jí vznikne okolo 400 – 600 mg a ve
výsledku je vyloučena potem, částečně i močí…
N
NH
NH
N
O
hypoxantin
O2
H2O H2O2
XANTHINOXIDASA
N
H
NH
NH
N
O
O
xantin
O2
H2O H2O2
XANTHINOXIDASA
N
H
NH
NH
N
H
O
O
O
kyselina močová
GUANASA
N
NH
NH
N
NH2
O
guanin
Dna
Jedná se o onemocnění související s poruchami v metabolismu purinů, jehož projevem je
zvýšená produkce kyseliny močové a následné ukládání jejích krystalů ve tkáních. Příčiny
vysoké koncentrace kyseliny močové mohou být
 porucha v šetřícím procesu (deficit hypoxathin-guaninfosforibosyltransferasy (HGPRT) vede
k zastavení reakce hypoxatin + PRPP → IMP + PP; což vede k hromadění hypoxanthinu a jeho
přeměně na kyselinu močovu)
 snížená clearance v ledvinách
Jelikož přeměnu hypoxantinu i xantinu na kyselinu močovou katalyzuje enzym xanthinoxidasa, je
právě tento enzym cílem léků proti dně, např. allopurinolu. Allopurinol je v těle přeměněn na
oxypurinol, který je inhibitorem xanthinoxidasy.
N
N
N
N
H
OH
N
N
N
N
H
OH
OH
allopurinol oxopurinol
Tím nedochází k přeměnám xantinu a hypoxantinu na kyselinu močovou; xantin a hypoxatin jsou
rozpustnější a jsou tak snadněji vylučovány z organismu (navíc může hypoxanthin – pokud není
porušena funkce HGPRT – vstoupit do salvage pathway).
C) Vznik 2-deoxyribonukleotidů
Doposud jsme se bavili především o vzniku nukleotidů (pouze u dTMP jsme se zmínili o tom, že
je potřeba odstranit jednu –OH skupinu z ribosy). Na to, jak dochází k tomuto „odstranění“ –OH
skupiny se podíváme nyní.
Při vzniku 2-deoxynukleotidů vycházíme z přeměny nukleosiddifosfátu na
2-deoxynukleosiddifosfát. Hydroxylová skupina na druhém uhlíku je redukována
(deoxygenována) na vodík.
Reakce se účastní thioredoxin, thioredoxinreduktasa, NADPH+H+
a ribonukleotidreduktasa.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 12
Enzym ribonukleotidreduktasu inhibuje hydroxyurea (hydroxymočovina). Tím, že ji inhibuje,
zabrání syntéze deoxyribonukleotidů, což může pomoci při léčbě některých druhů rakoviny.
C
NH2
O
NH
OH
hydroxymočovina
11.2 Replikace DNA
Replikace znamená zdvojování. Jedná se o semikonzervativní proces, při kterém dochází
k rozpletení dvoušroubovice DNA a každý uvolněný řetězec slouží jako templát pro syntézu
nových komplementárních vláken (proto mluvíme o semikonzervativním procesu – do každé
nové molekuly se vždy dostane část staré). V nových řetězcích se řadí báze podle principu
komplementarity (A-T, C-G).
K replikaci DNA dochází v jádře.
Obecně můžeme replikaci u eukaryontů i prokaryotnů rozlišit do tří fází:
a) iniciace
b) elongace
c) spojení a terminace
Ke zdárnému průběhu potřebujeme řadu látek:
 deoxynukleotidy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP )
 Mg2+
 primer RNA
 templát DNA (mateřské vlákno)
A kromě uvedených látek i řadu enzymů:
 rozplétací enzym (DNA-helikasa)
 RNA-polymerasa
 DNA-dependentní-DNA-polymerasa
 DNA-ligasa
 ATP-asa
 (topoisomerasa)
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 13
Před tím, než se podíváme na celý průběh replikace DNA a vysvětlíme si roli jednotlivých látek a
enzymů, zaměříme se na vlastní reakci syntézy DNA, tedy na to, jak přesně dochází ke
spojování nukleotidů.
Do reakce vstupuje již vytvořená DNA (nebo primer RNA), se kterou reaguje dNTP
(deoxynukleotidtrifosfát). Při reakci se odštěpí difosfát a dNMT (deoxynukleotidmonofosfát) se
na stávající DNA připojí pomocí esterové vazby. Do reakce vstupuje vždy 3‘-konec stávající DNA
(primeru), k prodlužování (napojování nových nukleotidů) dochází ve směru 5‘ → 3‘.
Ke schématu:
Na stávající řetězec DNA (znázorněn pouze poslední nukleotid na 3‘-konci; černě) se připojuje nový trinukleotid. Při
reakce dojde k odštěpení difosfátu (této reakce se účastní Mg2+ ionty, které difosfát komplexují!) a ke vzdiku
fosfodiesterové vazby mezi původním a novým nukleotidem.
Když nyní víme, jak se po chemické stránce napojují nové nukleotidy, může se podívat na to, jak
probíhá celá replikace.
A) Rozpletení řetězce
Replikace probíhá současně na obou vláknech DNA. Dvoušroubovice musí být před zahájením
rozvinuta, což má za úkol rozplétací enzym DNA-helikasa. Její činností vzniká tzv. replikační
vidlice.
Aby nedošlo ke zpětné reasociaci řetězců, napojují se na rozpletenou DNA ssb-proteiny (single
strand binding proteins). Jejich úkolem je stabilizovat jednovláknovou strukturu.
Ještě jednou zopakujme, že oba řetězce DNA slouží jako templář pro vznik nové DNA.
Enzym ATP-dependentní-DNA-helikasa za
spotřeby ATP rozplétá dvoušroubovici DNA.
SSB-proteiny zabraňují reasociaci řetězců.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 14
B) Vznik primeru
Enzym DNA-polymerasa, která katalyzuje napojování nukleotidů, neumí iniciovat syntézu zcela
nových řetězců („neumí nasednout na rozpletenou DNA a začít přidávat nukleotidy“). Pro svou
funkci potřebuje primer, který obsahuje volný 3´-konec.
Tento primer vytvoří enzym RNA-polymerasa (primasa). Nasedne na rozpletené vlákno DNA a
nesyntetizuje cca 10-20 párů bází dlouhý řetězec RNA (primer). Syntetizuje ve směru 5´→3´,
vytvořený primer je komplementární k původní DNA4
.
C) Nástup DNA-polymerasy
Vzniklý primer RNA obsahuje volný 3‘-konec. Jakmile je dostatečně dlouhý, RNA-polymerasa se
od DNA odpojí a na její místo nasedá DNA-polymerasa, která syntetizuje komplementární vlákno
DNA.
D) Odbourání primeru
Jakmile je syntetizované vláknou DNA dostatečně dlouhé, dojde k odbourání primeru pomocí
exonukleasy a volné místo je zaplněno pomocí DNA-polymerasy.
4
Jelikož nyní máme v jednom řetězci i DNA i RNA, mluvíme o tzv. DNA-RNA hybridu.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 15
E) Spojení jednotlivých úseku pomocí DNA-ligasy
DNA-polymerasa umí napojovat jednotlivé nukleotidy, ale není schopna spojit k sobě dvě části již
existují DNA. Tuto úlohu má enzym DNA-ligasa.
Okazakiho fragmenty
Syntéza DNA je semikonzervativní, probíhá tedy podél obou řetězců zároveň. Výše popisovaný
postup je „bezproblémový“ pouze u mateřského řetězce, který se syntetizuje od svého 3´konce
(nový řetězec tedy vzniká ve směru 5´→3´); tento mateřský řetězec označujeme jako vedoucí
vlákno (leading strand) a jeho syntéza je kontinuální.
Drobné „problémy“ nastávají v okamžiku, kdy se začne replikovat i druhý řetězec – orientace
mateřského vlákna je 5´→3´ a nový řetězec by se měl syntetizovat ve směru 3‘→5´, což není
možné, protože reaktivní –OH skupina se nachází na 3´konci. Syntéza na tomto mateřském
vlákně, které označujeme jako opožďující se vlákno (též otálejícíc nebo laggins strand), probíhá
diskontinuálně po menších úsecích zvaných jako Okazakiho fragmenty.
Vznik každého Okazakiho fragmentu probíhá způsobem popsaným v bodech B-E. Nejprve
vznikne krátký primer RNA, na ten se napojí nová DNA, primer je odbourán, nahrazen novou
DNA a jednotlivé úseky DNA jsou spojeny DNA ligasou.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 16
Nyní již známe obecný průběh replikace DNA. Existují však jisté rozdíly v replikaci DNA mezi
eukaryonty a prokaryonty, a ve skutečnosti nevzniká pouze „replikační vidlice“ ale „replikační
bublina“. O těchto věcech si povíme nyní.
Rozdíly mezi eukaryonty a prokaryonty
1) Rozdíly v iniciaci
U eukaryontů o prokaryontů dochází ke vzniku replikačního počátku, od něj se syntéza nové
DNA šíří v obou směrech – tzn. vznikají dvě replikační vidlice (=tvoří „replikační bublinu“
nazývanou replikon).
U prokaryontů je jediný replikační počátek, nazývaný ori-C. Replikace v něm začne a rozbíhá se
na oba konce kružnicové molekuly DNA. Jedná se o rychlý proces, který je dokončen zhruba za
40 minut a je možné, aby začala nová replikace ještě v okamžiku, kdy stará nebyla dokončena.
U eukaryontů je replikace složitější. Jejich chromozomy nejsou tvořeny jedinou kruhovou
molekulou, ale dlouhými molekulami DNA, které nemohou být replikovány kontinuálně. Na
jedné molekule DNA se tak vytváří asi 30 000 replikačních počátku, přičemž celý proces je
prostorově i časově precizně řízen (např. ne na všech počátcích musí replikace začít ve stejnou
dobu). Rychlost replikace je navíc menší (i proto máme více počátků – chceme DNA replikovat
rychle).
Replikace DNA probíhá v S-fázi buněčného cyklu.
Replikace u eukaryontů Replikace u prokaryontů
Poznámka: Fialové šipky naznačují počátek a směr replikace.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 17
2) Rozdíly v DNA-polymerasách
Enzym DNA-polymerasa je esenciální pro replikaci DNA. U prokaryontů nacházíme její tři typu, u
eukaryontů je známo 9 typů. Pro přehlednost je uvedeme v tabulce.
Tabulka 1 - DNA-polymerasy u prokaryontů
Polymerasa Funkce Exonukleasová aktivita
DNA polymerasa I odstranění RNA primerů,
vyplnění místa po RNA,
opravy DNA
5‘→3‘
3‘→5‘
DNA polymerasa II opravy dna 3‘→5‘
DNA polymerasa III replikace 3‘→5‘
Poznámka: exonukleosová aktivita souvisí se schopností daného typu enzymu opravovat chyby při replikaci – zjistí-li
DNA-polymerasa, která má exonukleoasovou aktivitu, že byl do nového řetězce zařazen špatný nukleotid, vyštěpí tento
nukleotid a nahradí jej správným nukleotidem.
Má-li enzym exonukleasovou aktivitu 5‘→3‘, může vyštěpit nukleotid ve směru ve kterém probíhá replikace (tedy
rovnou opravit nově vzniklou molekulu).
Exonukleasová aktivita 3‘→5‘ se označuje jako proof-reading a slouží ke kontrole pořadí nukleotidů.
Tabulka 2 - DNA-polymerasy u eukaryontů
Polymerasa Funkce Exonukleasová aktivita
DNA polymerasa α
replikace DNA
opravy DNA
žádná
DNA polymerasa β opravy DNA žádná
DNA polymerasa γ replikace DNA v mitochondriích 3‘→5‘
DNA polymerasa δ
replikace DNA
opravy DNA
3‘→5‘
DNA polmyerasa ε replikace 3‘→5‘
V eukaryontním jádře jsou nejaktivnějšími polymerasami DNA-polymerasa α a δ,
v mitochondriích se uplatňuje DNA-polymerasa γ.
3) Rozdíl v délce Okazakiho fragmentů
U prokaryontů mají Okazakiho fragmenty délku 1000 – 2000 bází.
U eukaryontů mají Okazakiho fragmenty délku cca 200 bází.
Lze tedy říci, že prokaryonti mají delší Okazakiho fragmenty a mají jich tudíž méně, eukaryonti
mají kratší Okazakiho fragmenty a mají jich tudíž více.
Přehled enzymů účastnících se replikace DNA
Nyní již víme, jak funguje většina enzymů replikace DNA a jaký je rozdíl mezi replikací eukaryontů
a prokaryontů. V tabulce na následující stránce je uveden přehled funkce jednotlivých enzymů,
které se replikace účastní, přičemž podrobněji bude o funkci některých z nich pojednáno dále.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 18
Tabulka 3 - Enzymy podílející se na replikaci DNA
Enzym Funkce
DNA-helikasa rozplétá dvoušroubovici
DNA-polymerasa připojování nukleotidů, opravy DNA
RNA-polymerasa tvorba primerů
RNA-sy (enzymy odstraňující primer) hydrolyzují RNA z DNA-RNA hybridů
DNA-ligasa spojování jednotlivých fragmentů DNA
SSB-proteiny zabraňují reasociaci vláken DNA
topoisomerasy uvolňují pnutí vyvolané superstáčením
telomerasy upravují 3‘ konce templátových řetězců
sliding clamp (klouzavá svorka) udržuje DNA polymerasu ve vazbě na DNA
Topoisomerasy
Název odvozen od „topologie DNA“, tedy od „trojrozměrné struktury DNA“.
Při rozplétání dvojité šroubovice dochází často k superstáčení (představme si, že máme smotána
dvě lana, uprostřed je chytneme a chceme je rozmotat – jak je od sebe postupně uvolňujeme,
smyčky na okrajích jsou stále menší a je jich více na menší délce).
U DNA může být superstáčení:
 pozitivní (ve stejném směru jako točení helixu, tedy doleva)
 negativní (v opačném směru než je točení helixu, tedy doprava)
Topoisomerasy mají za úkol superstáčení odstranit. Existují jejich dva typy, každý typ užívá jiný
způsob:
a) Topoisomerasa I
Je schopná reversibilně přerušit fosfodiesterovou vazbu v jednořetězci. Tím umožní otáčení
kolem jednoho řetězce a dojde u uvolnění superstočení. Následně katalyzuje zpětné spojení
rozštěpení vazby.
Nevyžaduje ATP a nacházíme ji u prokaryontů i eukaryontů.
b) Topoisomerasa II
Umí odstranit pnutí, ale dokáže jej i vytvořit. Pracuje tak, že rozštěpí fosfodiesterovou
vazbu na obou řetězcích, které se tak mohou několikrát „odtočit“ a odstranit tak
superstočení.
Pro následné spojení řetězců vyžaduje ATP.
Nacházíme ji u prokaryontů (akorát se jmenuje DNA-gyrasa) i u eukaryontů, existují jisté
rozdíly ve specifitě.
Inhibitory lidské topoisomerasy zabraňují replikaci a užívají se proto jako protinádorová léčiva.
Např. kamptothecin (rostlinný produkt), antracykliny (př. daunorubicin; bakteriální produkty),
podofyllotoxiny (rostlinné produkty).
Jelikož se topoisomerasy nacházejí i u bakterií (prokaryontů) a jelikož mají jinou specifitu je
možné inhibovat pouze jejich činnost. Antibakteriální léky na bázi chinolinů (norfloxacin)
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 19
zabraňují dělení bakterií právě tím, že inhibuje DNA-gyrasu a nepůsobí na lidskou
topoisomerasu.
N
N
+
O
OOH
C2H5
kamptothecin
(Camptotheca acuminata)
OH
O
O
O
O
H3CO
OCH3
OCH3
podofyllotoxin
(Podophyllum peltatum ad.)
Telomerasa
Na 3‘-konci DNA se nachází zvláštní sekvence DNA – jedná se o tandemy druhově specifických
oligonukleotidů bohatých na G (u člověka konkrétně TTAGGG, opakováno až 1000x). Jejich
funkce je ochranná (brání DNA před působením enzymů a umožňují replikaci) a nesou název
telomery.
Při syntéze opožďujícího se řetězce vyžaduje replikační aparát přítomnost určité délky
templátové DNA za sekvenci, která je kopírována – kdyby neexistovaly telomery, zastavila by se
syntéza DNA před koncem templátu.
Enzym telomerasa dokončí syntézu DNA tím, že dosyntetizuje telomery na templátové vlákno.
Jedná se o enzym ze skupiny reverzních transkriptáz, který ve své molekule obsahuje RNA (tedy
i RNA může působit jako enzym!). RNA se napojí na konec templátové DNA a dle své sekvence
dosyntetizuje telomery.
Telomerasa se napojí na sekvenci GGG
nacházející se na konci templátového řetězce.
Telomerasa dosyntetizuje část DNA. Všiměněme
si, že na konci je opět sekvence GGG.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 20
Telomery (a telomerasa) tedy zabraňují ztrátě genetické informace, ke které by mohlo při
syntéze dojít.
Kromě toho mají telomery význam pro ochranu DNA – brání ji před účinkem DNA-nukleáz.
Můžeme si představit, že tvoří jakousi značku, která říká DNA-nukleázám „toto je naše DNA,
neštěpit.“
V poslední době se provádí řada výzkumů, které se zabývají tím, jak délka telomer koreluje se
stářím a replikační kapacitou buňky:
 buňky získané od mladých jedinců mají delší telomery a podléhají většímu počtu dělení
 některé somatické buňky neobsahují telomerasu – jejich telomery se postupně (při
každém dělení) zkracují a jakmile jsou moc krátké, buňka se již dále nemůže dělit
 u starších jedinců je nižší aktivita telomerasy – její aktivita teda pravděpodobně souvisí
se stářím organismu
 buňky, které se často dělí (kmenové buňky, zárodečné buňky, nádorové buňky) mají
vysokou hladinu telomerasy
Telomerasa se tedy studuje nejen kvůli jejímu možnému vlivu na stárnutí, ale i kvůli možnosti
využití v protinádorové terapii (její inhibitory by mohly zabránit nádorovému bujení).
Poškození a opravy DNA
Během jediného dne vznikají desetitisíce až miliony poškození DNA v jediné buňce. U dospělého
člověka, jehož organismus se skládá cca z 1012
buněk, se jedná o 1016
–1018
chyb, které je potřeba
opravit!
Chyby vznikají při replikaci, transkripci i jindy (např. vlivem vnějších faktorů). Příklady poškození,
které mohou nastat, uvádí následující tabulka:
Tabulka 4 - Poškození DNA
Typ poškození Příčina
chybějí báze depurinace (za den až 104
purinů)
změněná báze ionizační záření, alkylační činidla
nepřesná báze spontánní deamince
delece-inzerce interkalační činidla (akridiny)
formace dimerů UV záření
zlomy řetězců ionizační záření, chemikálie (bleomycin)
meziřetězcové vazby chemické látky (deriváty psoralenu, mitymycin c)
tvorba tautomerů spontánní a dočasná
Většina buněk má schopnost rozeznat a vystřihnout poškozenou oblast DNA – pro tyto činnosti
existují specifické glykosylasy, exonukleasy a endonukleasy. Následně pak umí buňky
nasyntetizovat opravenou formu pomocí např. DNA-polymerasy β. Nově opravené úseky jsou
následně pospojovány s původními řetězci pomocí DNA-ligasy.
Pro opravy různých chyb existují různé postupy:
 přímá oprava zvratem (možné jen u bakterií)
 vystřižení porušené báze („base excision repair“)
Celý proces se opakuje dokud není
telomera dost slouhá.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 21
 vystřižení postiženého nukleotidu („nucleotide excision repair“)
 oprava chybného párování („mismatch repair“)
 opravy dvojitých zlomů (homologní rekombinace, nehomoloví spájení konců)
 prevence inkorporace porušnéhé nukleotidu do DNA (3‘→5‘ proofreading)
11.3 Transkripce DNA (= syntéza RNA)
Transkripce (česky přepis) je proces tvorby RNA podle matrice DNA.
Vždy dochází k přepisování jen jednoho řetězce, který nazýváme templátový. Druhý řetězec,
který se nepoužívá pro přepis, se označuje jako kódující, neboť sekvence jeho bází přesně
odpovídá sekvencím bází v transkriptu (pouze místo uracilu je thymin).
Př. 5´ GGATC 3´ kódující řetězec DNA
3´ CCTAG 5‘ templátový řetězec DNA
5´ GGAUC 3´ transkript RNA
Syntéza RNA probíhá stejně jako replikace ve směru 5´→3‘, jako templátový řetězec tedy bude
sloužit řetězec s orientací 3‘→5‘.
Rozdíly mezi replikací a transkripcí uvádí následujíc tabulka:
Tabulka 5 - Replikace x transkripce
Replikace Transkripce
Enzymy DNA-polymerasy RNA-polymerasy
Kde probíhá na chromozomech v S-fázi na vybraném segmentu DNA
Zahájení vyžaduje primer RNA nevyžaduje primer
Průběh kopírována obě vlákna přepisováno jedno vlákno
Kontrola
proof-reading
(DNA-polymerasa zkontroluje, zda
správně zařadila nukleotid)
RNA-polymerasa nemá zpětnou
vazbu správného zařazení nukleotidu
Nukleotidy dATP, dGTP, dCTP, dTTP ATP, GTP, UTP, CTP
RNA-polymerasa
RNA-polymerasa je enzym zodpovědný za transkripci.
Celý název zní DNA dependentní-RNA-polymerasa, někdy je též označována jako transkriptasa.
U prokaryontů se vyskytuje jediný typ RNA-polymerasy, která je tvořena 5 podjednotkami a tzv.
sigma-faktorem. Tato RNA-polymerasa se podílí na vzniku všech typů RNA.
U eukaryontů jsou známy 4 různé typy RNA-polymerasy. Mají stejný mechanismus účinku, avšak
rozlišují různé promotory (tzn. ví, kam mají na DNA nasednout, aby přepsaly tu její část, kterou
mají).
Tabulka 6 - Eukaryontní RNA-polymerasy
Typ polymerasy Transkript (a kde)
RNA-polymerasa I syntéza rRNA (jadérko)
RNA-polymerasa II syntéza mRNA (jádro)
RNA-polymerasa III syntéza tRNA a 5S RNA (jádro)
RNA-polymerasa IV syntéza mitochondriální RNA (mitochondrie)
N
H
O
O
NH
CH3
CH3
N
H
S
O
N
H
O
O
NH
NH
O
CH3
OH
OH
N
O
OH
O
O
NHNH2
O
amanitin
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 22
Inhibitorem eukaryotních typů RNA-polymerasy je látky amanitin. Jedná se o přírodní látku,
která se nachází např. v muchomůrce. Jedná se o jed.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 23
Průběh transkripce
Stejně jako u replikace, můžeme rozlišit tři fáze:
a) iniciaci
b) elongaci
c) terminaci
Pro úspěšný průběh transkripce potřebujeme:
 nukleotidy (ATP, GTP, CTP a UTP)
 Mg2+
 templátové vlákno DNA
 řadu enzymů (viz dále)
Hlavní enzym, který provádí transkripci je RNA-polymerasa. Nové vlákno syntetizuje ve směru
5‘ → 3‘ (stejně jako DNA-polymerasa). Postupně dochází k vytváření fosfodiesterovoých vazeb
mezi jednotlivými nukleotidy, energii k tomuto procesu dodává štěpení těchto nukleotidů.
Než se podíváme na vlastní průběh transkripce, uděláme si pořádek v terminologii:
 promotor
Oblast DNA dlouhá asi 40 nukleotidů nacházející se před místem startu od 5‘ konce
(předchází tedy přepisované sekvenci)
 transkripční jednotka
Oblast od promotoru k terminační oblasti.
 boxy (elementy)
Malé sekvence DNA obsažené v oblasti promotoru.
 cis-působící sekvence
Sekvence ležící v blízkosti genu na molekule DNA, která je přepisována.
 trans-působící faktory
Proteinové faktory vážící se na DNA (geny, které řídí jejich syntézu, se nacházejí na jiných
chromozomech)
 primární transkript
RNA produkt nesyntetizovaný ve směru 5‘ → 3‘ (tedy RNA se všemi introny a exony, nikterak
nesestříhaná)
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 24
Rozpoznání templátu a zahájení transkripce
Na začátku replikace musí RNA-polymerasa (dále RNAP) najít místo, kde transkripce začne. Tímto
místem je promotor, kde RNAP vytvoří stabilní komplex s templářovou DNA.
V místě promotoru najdeme tzv. konvenční sekvence, což jsou sekvence DNA, které najdeme
v oblasti promotoru u velkého množství genů. Označujeme je jako boxy a jsou poněkud odlišné
u prokaryontů a eukaryontů:
A) U prokaryontů nalézáme:
 v pozici cca -10 tzv. Pribnowův box TATAAT
 v pozici cca -35 sekvenci TTGACA
Tyto sekvence umí rozpoznat σ-faktor prokaryotické RNAP.
B) U eukaryontů nalézáme:
 v oblasti promotoru:
o TATA box (pravděpodobně určuje místo startu, na které se váží bazální
transkripční faktory)
o CAAT box
o GC box
 ve vzdálenějších oblastech od místa startu:
o specifické regulační sekvence (též nazývané enhancery a silencery; váží se na ně
specifické transkripční faktory)
Jak vidíme, je u eukaryontů situace poněkud složitější.
Na boxy v promotoru se váže nejprve řada bazálních transkripčních faktorů, některé
transkripční faktory (specifické) se váží mimo ně do tzv. specifických regulačních sekvencí
(enhancery, silencery). RNAP je před vlastní transkripcí spojena s bazálními faktory.
Dokud nejsou všechny faktory na svém místě, nemůže transkripce začít!
Bazální5
transkripční faktory (eukaryontů)
Před začátkem transkripce se tyto proteiny váží na RNAP a současně jsou již asociovány
s promotorovými sekvencemi. Pokud nejsou na promotor navázány, nepozná RNAP6
místo
startu.
Nejprve se na DNA do oblasti TATA boxu navazuje TFIID [čti té-ef-dva-dé], což je největší bazální
transkripční faktor, který se skládá z 11 podjednotek (jednou z nich je jednotka TBP – TATA-box
binding protein – která se váže jako první na zmíněný TATA-box, ostatní jednotky se váží na ni).
Po napojení TFIID se napojují další transkripční faktory (TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH)
5
Bazální znamená, že jsou potřebné pro transkripci všech genů.
6
Nyní se budeme bavit o transkripci kterou katalyzuje RNA-polymerasa II. Proto všechny transkripční
faktory (TF) ponesou v názvu i číslo II.
Nacházejí se v pozici – 100 až – 200. Pravděpodobně určují frekvenci
startu. Označujeme je jako promotorové proximální sekvence.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 25
Specifické regulační proteiny a specifické regulační sekvence
Kromě bazálních transkripčních faktorů existují i specifické transkripční faktory. Jedná se rovněž
o proteiny, které se však vážou mimo oblast promotoru, velmi často do poměrně vzdálených
sekvencí DNA.
Specifické regulační faktory působí jako aktivátory nebo represory transkripce příslušného genu.
Po napojení na příslušnou sekvenci DNA se na ně napojí mediátorový protein (dříve označován
jako koaktivátor nebo korepresor), který je již v kontaktu s bazálními transkripčními faktory a
může tak transkripci ovlivnit.
Typické geny obsahují na DNA celou řadu specifických regulačních sekvencí, kam se tyto
specifické regulační faktory vážou. Tyto sekvence se ve starší literatuře označovaly jako
enhancery, silencery či jako HRE (hormon response element). Mohou se nacházet „upstream“
nebo „downstream“ od místa počátku transkripce a jak již bylo zmíněno – mohou se nacházet
poblíž promotoru, ale i ve velmi vzdálených oblastech.
Poznámka:
Protože se v současnosti využívají jak slova ze staré, tak z nové terminologie, uvádí následující
tabulka hlavní rozdíly mezi nimi:
Terminologie Pojmy
Stará enhancer, silencer,HRE aktivátor, represor
korepresor,
koaktivátor
Nová regulační sekvence DNA
specifický transkripční faktor
(aktivátor, represor)
mediátorový
protein
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 26
Přičemž:
 enhancery: regulační sekvence v DNA, které vážou aktivátory, na které se vážou koaktivátory
 silencery: regulační sekvence v DNA, které vážou represory, na které se vážou korepresory
 HRE: regulační sekvence v DNA, na které se vážou „hormony spojené s intracelulárním
receptorem“
Jako specifické transkripční faktory mohou sloužit jaderné receptory proteinů (jak bylo
zmíněno u definice HRE).
Tyto jaderné receptory se nacházejí ve své neaktivní formě buď v jádře, nebo v cytoplazmě,
přičemž v neaktivní formě jsou často udržovány pomocí inhibičního proteinu (často tzv. heat
shock proteinu). Po té, co hormon pronikne do buňky, naváže se specificky na svůj jaderný
receptor (vzniká komplex hormon-receptor), čímž dojde ke změně konformace a oddělení
inhibičního proteinu. Vznikl-li komplex hormon-receptor v cytoplazmě, je následně translokován
do jádra.
V jádře komplex hormon-receptor funguje jako specifický transkripční faktor a váže se na DNA
v místě specifické regulační sekvence (=HRE). Na komplex se může samozřejmě navázat i
mediátorový protein (koaktivátor/korepresor), díky kterému se komplex dostává do kontaktu
s bazálními transkripčními faktory.
Tímto způsobem hormony „vypínají“ nebo „zapínají“ transkripci genů.
Všechny jaderné receptory tvoří rodinu vzdáleně příbuzných regulačních proteinů, které jsou
zodpovědné za modulaci genové exprese. Existuje jich celá řada typů, na některé z nich se nyní
podrobněji podíváme:
Glukokortikoidový receptor (GR)
Nachází se v cytoplazmě. Po navázání kortisolu se změní jeho konformace a na povrchu se
vystaví signál pro směřování do jádra. Receptor s hormonem se translokuje do jádra, tam se
naváže na glukokortikoid-HRE (GRE) v regulační oblasti genu. Na aktivátorovou oblast receptoru
(tzv. transaktivační doména) se váže mediátorový protein a tím vyvolá transkripci příslušných
genů a inhibici genů jiných.
Tento receptor je exprimován prakticky ve všech tkáních a genů, které jsou pomocí GR řízeny, je
mnoho (některé jsou regulovány pozitivně, jiné negativně). Transkripční aktivita GR závisí i na:
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 27
 přítomnosti mediátorových proteinů (koaktivátorů/korepresorů)
 na fosforylaci pomocí kináz
 na rychlosti odbourávání receptoru v komplexu ubikvitin-proteazom
Receptor thyroidních hormonů
Tento receptor vytváří dimery s receptorem následujícím (retinoidním). Vzniklé dimery se vážou
k thyroidnímu HRE a ke korepresoru, čímž inhibují transkripci příslušného genu.
Navázání thyroidního hormonu vyvolá konformační změnu v HRE a v korepresoru a dojde
k iniciaci transkripce.
Retinoidní receptor (RXR)
Retinoidní receptor RXR tvoří dimer s již zmíněnými receptory thyroidních hormonů, ale i
s dalšími asi 8 jadernými receptory. Každý dimer má jinou vazebnou specifitu k DNA.
RXR (váže na sebe cis-retinovou kyselinu) se podílí na regulaci exprese řady genů.
Nyní již víme, že existují bazální a specifické transkripční faktory, a že roli specifických
transkripčních faktorů mohou hrát i jaderné receptory pro hormony. Všechny uvedené faktory
mají něco společného – jedná se o bílkoviny, které jsou schopné se vázat na DNA. Tuto vazbu na
DNA jim umožňují určité strukturní motivy, které se objevují u většiny z nich:
 helix-smyčka-helix
 helix-otočka-helix
 zinkový prst
 leucinový zip
 …
Transkripční faktory jsou poměrně velké molekuly, avšak za kontakt s DNA je zodpovědná jen
malá část molekuly, reprezentovaná některým výše uvedeným strukturním motivem (nejčastěji
kontakt zprostředkovává α-helix). Zbytek molekuly, který se neúčastní vazby na DNA, má za
úkol udržovat správnou konformaci vazebného místa.
K napojení na DNA dochází nejčastěji v oblasti velkého žlábku (major groove).
Př. Zinkový prst
Zinkový prst se nachází v doménách receptorů pro steroidní hormony. Zinek je ve formě Zn2+
nelatován ve čtyřech pozicích buď histidinem, nebo cysteinem a je zodpovědný za udržování
terciární struktury domény.
V okolí Zn2+
se nachází oblast NRS (nucleotide response singal), což je α-helix obsahující sekvenci
aminokyselin, která slouží k rozpoznání specifické regulační sekvence v DNA (a tento α-helix se
do DNA následně zanořuje).
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 28
Závěr k části „Rozpoznání templátu a zahájení transkripce“:
Transkripce je zahájena až po té, co jsou navázány všechny transkripční faktory. RNA polymerasa
je napojena jak na ně, tak na DNA. DNA se začne rozvíjet a RNAP je sunuta k místu startu, čímž je
zahájena transkripce. Po zahájení se většina transkripčních faktorů oddělí.
Elongace
RNAP byla v předchozím kroku napojena, nyní se sune po DNA a vytváří k ní komplementární
vlákno RNA. Oproti DNA-polymerase nevyžaduje RNAP primer a oproti DNA-polymerase má
RNAP rozplétá aktivitu (rozplétá si DNA).
Stejně jako u replikace i při transkripci dochází k superstáčení, které je povolováno účinkem
topoisomeras.
V průběhu elongace by mohlo dojít k tomu, že by některé enzymy (5‘ exonukleasy) nově
syntetizovanou RNA mohly považovat za nepřátelskou a začaly by ji odbourávat. Proto se na 5´
konci objevuje guaninová „čapka“ (vytvoří se fosfoanhydridová vazba mezi 5´ koncem RNA a
methylovaným guaninem a navíc dojde k metylaci předpoledního nukleotidu). Na takto
vytvořenou čapku nasedají proteiny, které RNA chrání a pomáhají s přesunem přes jaderné póly
do cytoplazmy. Tento proces se označuje jako capping.
Terminace
Terminace ukončuje proces elongace. RNA polymerasa při svém sunutí po DNA narazí na
terminační signál a transkripci přeruší.
U prokaryontů rozlišujeme dva druhy terminace:
 závislou na ρ-faktoru
 nezávislou na ρ-faktoru
U eukaryontů není proces terminace zatím podrobně prozkoumán.
Během replikace dělá RNA-polymerasa jednu chybu na 104
nukleotidů, protože nemá
proofreading aktivitu. Chybění této aktivity odráží skutečnost, že transkripce nemusí být tak
přesná jako replikace DNA, jelikož RNA není používána jako trvalá zásobní forma genetické
informace.
11.4 Úprava primárních transkriptů
Při transkripci vzniká tzv. primární transkript, který je přesnou kopií transkripční jednotky.
Primární transkripty tRNA a rRNA u prokaryontů i eukaryontů jsou posttranskripčně
modifikovány pomocí ribonukleas.
Avšak primární transkripty pro mRNA:
 jsou u prokaryontů téměř stejné s výslednou mRNA a již primární transkript (který ani
není dosyntetizovaný) může sloužit k translaci
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 29
 jsou u eukaryontů rozsáhle posttranskripčně modifikovány, k některým modifikacím
dochází již během transkripce (např. capping)
Úprava eukaryontní mRNA
Primárním transkriptem vedoucím k mRNA je hnRNA. Jedná se o přepis strukturního genu, ve
kterém se nacházejí kódující sekvence (exony)7
, jež jsou střídány sekvencemi nekódujícími
(introny). Nekódující sekvence musí být odstraněny!
V jádře dochází k následujícím úpravám hnRNA:
 capping (viz výše)
 sestřih (splicing; viz dále)
 polyadenylace (na 3‘ konec vytvořené RNA se připojí polyA-část, která chrání RNA před
účinkem 3‘ exonukleas)
Sestřih hnRNA (splicing)
Sestřihu se účastní jaderné enzymové komplexy zvané splicesomy. Ty obsahují ve své molekule
pět malých RNA (U1, U2, U4, U5, U6), které jsou asociovány s proteiny a tvoří snRNPs (small
nuclear ribonucleoprotein particles).
snRNPs rozpoznávají sekvenci AGGU, která určuje hranici mezi exonem a intronem:
Přesnému mechanismu RNA-splicing se v tomto textu věnovat nebudeme, byl probrán
v podzimním semestru v Lékařské chemii.
Alternativní sestřih
Při typickém sestřihu dochází k tomu, že jsou všechny exony z hnRNA spojeny dohromady a
vzniká mRNA sloužící pro syntézu specifického proteinu.
Při alternativním sestřihu dochází k tomu, že různé skupiny exonů tvoří různé mRNA vedoucí
k syntéze různých proteinů:
7
Pro lepší zapamatování: exony se dostanou ven z jádra (ex) a mohou plnit svou funkci; introny jsou
vystřiženy a zůstávají nepoužity v jádře (in).
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 30
Poruchy sestřihu vedou ke genetickým chorobám, např. k β-thalasémii. Jedná se o onemocnění,
kdy se β-podjednotka hemoglobinu netvoří v dostatečném množství (dáno tím, že G je na 5‘
sekvenci sestřihu mutován na A, a proto je transkript sestřižen nesprávně).
Přeskupování exonů (exon shuffling)
Přítomnost velkého množství intronů v DNA zvyšuje pravděpodobnsot genetické rekombinace
mezi exony rozdílných genů. Mnoho proteinů u současných buněk připomíná složeniny vzniklé
ze společných sad kusů proteinů, které se nazývají proteinové domény.
Přeskupování exonů je evoluční proces, při němž vznikají nové geny (a tím i proteiny) spojením
dříve oddělených genů, z nichž každý kódoval jinou proteinovou doménu.
Syntéza a úprava rRNA a tRNA
Výše popsané děje se týkaly především mRNA. Nyní se ve stručnosti zaměříme na syntézu
ostatních druhů RNA.
Eukaryontní rRNA
Je syntetizována v jadérku i mimo jadérko.
Mimo jadérko je syntetizována 5SRNA (výše popsaným způsobem transkripce). Po své syntéze
putuje do jadérka a připojuje s k ostatní RNA.
V jadérku je podle templátu DNA vytvořena pre45S-RNA, která se následně komplexuje
s proteiny a 5S RNA a vytvoří ribonukleoproteiny. Ty jsou následně methylovány a zkráceny na
41S RNA, která je rozštěpena na 20S RNA a 32S RNA. Z těchto dvou jsou odstraněny introny a
vzniká finální 18S RNA, 5,8S RNA a 28S RNA.
Tyto jsou následně transportovány z jadérka do jádra a z jádra přes jaderné póry do cytoplazmy,
kde tvoří ribozomy.
Eukaryontní tRNA
Je syntetizována v jádře.
Nejprve je vytvořena pre-tRNA, ze které jsou následně vystřiženy introny.
Úpravy vzniklé tRNA pak pokračují rozsáhlými modifikacemi bází. např.:
 methylací uracilu na thymin
 dehydrogenací uracilu
 vznikem pseudouridinu
 deaminací adenosinu na inosin
 …
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 31
V závěru je na 3‘ konec připojena sekvence CCA a hotová tRNA je transportována do cytoplazmy.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 32
11.5 Syntéza proteinů
Syntéza proteinů je děj, více méně navazují na syntézu mRNA. Probíhá ve všech buňkách, které
mají jadernou DNA (tedy např. ne v erytrocytech), konkrétně na ribozomech (volných
v cytoplasmě nebo vázaných na endoplazmatickém retikulu) a v mitochondriích.
Probíhá odlišně u prokaryont a eukaryont:
 u prokaryont probíhá transkripce, úpravy transkriptu i translace na jednom místě a
dokonce souběžně
 u eukaryot probíhá translace až po té, co je primární transkript upraven do podoby zralé
mRNA, která musí být dopravena do cytoplazmy z jádra (transkripce a translace jsou od
sebe tedy časově i prostorově odděleny)
Pro zdárný průběh translace potřebujeme:
 aminokyseliny (pro výstavbu řetězce bílkoviny)
 řadu enzymů
 bílkovinné faktory (pomáhají průběhu syntézy)
 ATP a GTP
 anorganické ionty (Mg2+
a K+
)
Genetický kód
Informace o struktuře proteinů je v DNA uchovávána pomocí tzv. genetického kódu.
DNA je složena ze čtyř bází, které vytvářejí trojice (triplety/kodony), podle nichž se do
bílkovinného řetězce zařazují kódované aminokyseliny, kterých je 20 (resp. 21).
Celkem existuje 64 kodonů, z nichž 61 kóduje aminokyseliny a 3 kodony jsou tzv. STOP-kodony
(UAA, UAG, UGA).
Obecně o genetickém kódu můžeme říci, že má tyto vlastnosti:
 je degenerovaný (jedna aminokyselina může být kódována více než jedním kodonem)
 je jednoznačný (jeden kodon vždy specifikuje pouze jednu danou aminokyselinu)
 je kolísavý (třetí báze v tripletu může být často změněna; př. UUU i UUC kódují fenylalanin)
 je téměř universální (všechny organismy mají stejný genetický kód, až na pár výjimek;
např. v lidské mitochodríniální mRNA kóduje triplet UGA tryptofan místo STOP-kodonu a
triplet AUA kóduje methionin místo leucinu)
 je nepřekrývající se (každý kodon je vždy čten jen jedenkrát)
 je nepřerušovaný (kodony od sebe nejsou nikterak odděleny, triplety na sebe navazují)
Sekvence bazí v mRNA je (jak bylo řečeno) rozdělena do kodonů. Startovací kodon zahajuje čtení
úseku. Pořadí kodonů určuje pořadí, ve kterém se do bílkovinného řetězce připojují jednotlivé
AK. Čtení je dáno čtecím rámcem (proteosyntetický aparát se jednoznačně napojí na triplet AUG
a dále čte každý triplet tak jak následuje, nemůže přečíst AUG, jeden nukleotid přeskočit a začít
číst až po té).
… … … … … … A U G C A C A G U G G A G U U … … … … … …
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 33
Se čtecím rámcem úzce souvisí tematika mutací. Mutace jsou výsledkem poškození nebo
záměny nukleotidů v DNA nebo neopravených chyb v průběhu replikace. Mohou se snadno
přepsat do RNA, což se promítne do struktury proteinu např. tak, že je zařazena nesprávná AK.
Mutace můžeme rozdělit:
1. Bodové8
(dochází k výměně jedné báze)
1.1.Mírné (mutace neovlivní sekvenci AK v proteinu; např. mutace CGA→CGG je mírná,
neboť oba triplety kódují arginin)
1.2.Měnící smysl (mutace ovlivní sekvenci AK – jedna AK je zaměněna za jinou, což může ve
výsledku změnit vlastnosti proteinu; např. CGA→CCA vymění arginin za prolin)
1.3.Nesmyslné (mutace ovlivní ukončení čtení – dojde k předčasnému ukončení řetězce,
protože vznikl STOP-kodon; např. CGA→UGA)
2. Inserce (vložení jednoho nebo více nukleotidů)
3. Delece (vypuštění jednoho nebo více nukleotidů)
U inzercí a delecí záleží na tom, kolik nukleotidů se přidá, resp. ztratí:
 přidají-li se (ztratí-li se) tři nukleotidy nebo více trojic nukleotidů, je zachován čtecí
rámec, akorát se v proteinu vyskytnou navíc nebo ubudou některé AK
 přidají-li se (ztratí-li se) jeden nebo dva nukleotidy, dochází ke změně čtecího rámce, což
vede ke vzniku tzv. zkomolených sekvencí AK
tRNA
Každý kodon v mRNA má k sobě kompatibilní antikodon, který se nachází v molekule tRNA. tRNA
slouží jako jakýsi adaptér mezi bázemi v mRNA a aminokyselinami.
Každá tRNA obsahuje pouze jeden antikodon a k danému antikodonu přísluší vždy jen jedna
aminokyselina, která je navázána na 3‘ konci příslušné tRNA.
8
Příkladem bodové mutace mohou být mutace v genech pro hemoglobin – je známo asi 800 strukturních
variant lidského hemoglobinu, většina z nich nevyvolává mutace a Hb plní svou funkci. O některých
opačných případech (kdy změněná AK neumožňuje funkci) jsme se bavili v kapitole 2 o hemoglobinu.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 34
Ribozomy
Ribozomy jsou ribonukleoproteinové častice složené z rRNA a proteinů. Skládají se z velké a
malé podjednotky, přičemž tyto podjednotky jsou od sebe v inaktivním stavu odděleny a spojují
se až při zahájení syntézy.
Na větší z podjednotek můžeme rozlišit tři vazebná místa:
 A (pro vazbu aminoacyl-tRNA)
 P (pro vazbu peptidyl-tRNA)
 E (pro vazbu volné tRNA; místo pro exit)
Ribosomy u prokaryontních a eukaryontních organismů se trochu odlišují, zásadní rozdíly
vystihuje následující tabulka:
Tabulka 7 - Eukaryotické vs. prokaryotické ribosomy
Vlastnost Prokaryotické organismy Eukaryotické organismy
Sedimentační konstanty
kompletní ribozom
menší podjednotka
větší podjednotka
70S
30S
50S
80S
40S
60S
Obsah RNA
RNA-menší podjednotka
RNA-větší podjednotka
65%
16S
5S; 23S
50%
18S
5S; 5,8S; 28S
Umístění v buňce
volně v cytoplazmě nebo
vázáné na cytoplazmatickou
membránu
volně v cytoplazmě nebo
vázána na membránu ER
Průběh translace
Translace je poměrně složitý proces, ve kterém můžeme rozlišit (jako u replikace a transkripce)
tři fáze:
1. Iniciace
2. Elongace
3. Terminace
Všechny tři fáze se odehrávají v cytoplazmě ve vazbě na ribozomy.
Ještě před proběhnutím těchto tří fází, je ale potřeba, aby byly vytvořeny aminoacyl-tRNA
molekuly (tedy molekuly tRNa s navázanou aminokyselinou).
A) TVORBA AMINOACYL-tRNA
Aminokyselina je nejprve aktivována reakcí s ATP na aminoacyl-AMP. Aktivovaná AK je pak
přenesena na 2‘ nebo 3‘ –OH skupinu ribosy nacházející se na 3‘ konci tRNA. tRNA s navázanou
AK (tzn. aminoacyl-tRNA) označujeme jako nabitou tRNA (charged tRNA).
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 35
Reakci katalyzují specifické enzymy, obecně nazývané aminoacyl-tRNA synthetasy.
Aktivace aminokyseliny:
R CH C
NH2
O
OH
aminokyselina
+
N
O
O
OHOH
P
O
O
-
P
O
O
O
-
O
-
O
-
O
O
P N
N
N
NH2
ATP
PPi
N
O
O
OHOH
P
O
O
O
N
N
N
NH2
R CH C
NH2
O
aminoacyl-AMP
(aktivovaná AK)
Vazba AK na tRNA:
B) INICIACE
Ve fázi iniciace se vytváří tzv. iniciační komplex. Přesněji dochází k:
a) vazbě iniciačních faktorů na menší ribozomální podjednotku
b) vazbě iniciačního faktoru eIF2 na nabitou tRNA (eIF2 je předtím potřeba napojit na GTP)
c) vazbě iniciačních faktorů na 5‘ konec mRNA (na „čapku“)
d) vazbě tRNA k menší ribozomální podjednotce
e) vazbě mRNA k menší ribozomální podjednotce (na které je již připojena tRNA)
f) připojení velké ribozomální podjednotky k doposud vytvořenému preiniačnímu komplexu,
odpojení iniciačních faktorů
Výše naznačený průběh odpovídá tvorbě iniciačního komplexu u eukaryontů, u prokaryontů se
vyskytují jisté odlišnosti:
 Iniciační faktory se neváží na čapku (bod c), protože prokaryonty čapku nemají. Místo
toho dochází k vazbě tzv. Shine-Dalgarnovy sekvence na 5‘ konci mRNA k 16S RNA
v ribozomu.
 První aminokyselinou v řetězci je formyl-methionin
 Iniciační faktory (IFs) jsou pouze 3
Na jednotlivé kroky iniciace u eukaryontů se nyní podíváme podrobněji. Pro úspěšné dokončení
tohoto procesu potřebujeme eIFS (eukaryontní iniciační faktory), obě podjednotky ribozomů,
tRNAmethionin
a mRNA.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 36
ADa) Vazba iniciačních faktorů na menší podjednotku
Na menší ribozomální podjednotku (40S) se naváží iniciační faktory eIF3 a eIF1A:
ADb) Vazba iniciačních faktorů na tRNAmethionin
Na tRNAmethionin
se specificky váže faktor eIF2 (váže se pouze na tRNA nesoucí methionin!).
Předtím, než se na ni napojí, je potřeba jej aktivovat reakcí s GTP.
Povšimněme si, že tRNAmethionin má antikodon UAC, komplementární s kodonem AUG pro methionin.
ADc) Vazba iniciační faktorů na 5‘ konec mRNA
Na 5‘ konec mRNA, který obsahuje čapku, se váže CBP (cap binding protein), jehož součástí je
několik dalších iniciačních faktorů.
ADd) Vazba tRNAmethionin
k menší ribozomální podjednotce
tRNAmethionin
spolu s GTP a všemi svými iniciačními faktory se napojí na menší ribozomální
podjednotku (na které jsou rovněž navázány iniciační faktory) a vytvoří preiniciační komplex.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 37
ADe) Vazba mRNA k preiniciačnímu komplexu
Preiniciační komplex skenuje mRNA od 5‘ konce tak dlouho, dokud nenarazí na kodon pro
methionin.
Při skenování je spotřebováváno ATP, které slouží k rozvíjení vlásenkovité struktury mRNA
(mRNA sice netvoří dvoušroubovici, ale občas se může lokálně spojit sama se sebou vodíkovými
můstky).
ADf) Připojení velké ribozomální podjednotky, uvolnění iniciačních faktorů.
V okamžiku, kdy neiniciační komplex narazí na kodon pro methionin, odpojí se GTP (je
hydrolyzováno) a jednotlivé eIF a připojí se větší ribozomální podjednotka, čímž se vytvoří
iniciační komplex.
V nově vzniklém iniciačním komplexu se tRNA pro methionin nachází v místě P větší ribozomální
podjednotky.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 38
Pár slov na závěr k iniciaci
U eukaryontů má pro zahájení translace velký význam iniciační faktor eIF2. Je komplementární
pouze s tRNA pro methionin, při elongaci se uplatňují jiné iniciační faktory, které opět pasují jen
k tRNA pro určitou aminokyselinu.
Faktor eIF2 je aktivní v nefosforylované formě – jeho fosforylace a defosforylace jsou jedním ze
způsobů regulace jeho činnosti.
Př1. Nachází-li se v retikulocytech (které syntetizují globin) dostatek hemu, tak hem inhibuje
kinasu, čímž jí zabrání ve fosforylaci eIF2 a syntéza globinu může probíhat. Pokud v buňce hem
není, je kinasa aktivní a eIF2 je fosforylován, tudíž se globin zbytečně nesyntetizuje.
Př2. Fosforylace eIF2 je jedním ze způsobů obrany proti virovým onemocněním (v případě
virového onemocnění dojde k aktivaci kinasy, která fosforyluje faktor eIF2 a ten je proto
neaktivní, tudíž neprobíhá translace).
C) ELONGACE
Elongace navazuje na iniciaci. Na iniciačním komplexu je již navázány tRNAmethionin
v místě P větší
ribozomální podjednotky.
Aby mohla probíhat elognace, musí se vytvořit tRNAaminokyselina
, která nese aminokyselinu, jež je
kódována v mRNA. V našem případě se jedná o leucin, tudíž je potřeba vytvořit tRNAleucin
.
To v sobě obsahuje již popsané reakce:
 aktivaci leucinu na leucinyl-AMP (leucinyladenylát)
leucin + ATP → leucinyl-AMP + PPi spotřeba energie: 2 ATP
 tvorba tRNAleucin
leucinyl-AMP + tRNA → tRNAleucin
 vazba GPT a iniciačního faktoru (v tomto případě EF1α) na tRNAleucin
spotřeba energie: 1 ATP
Vzniklá tRNAleucin
(spolu s GTP a iniciačním faktorem) se váže do A místa větší ribozomální
podjednotky. Po navázání se GTP hydrolyzuje a oddělí, oddělí se i iniciační faktor.
Následuje vytvoření peptidové vazby mezi methioninem a leucinem, které katalyzuje enzym
transpeptidasa. Ta vytvoří peptidovou vazbu následovně:
 odštěpí methionin od tRNA
 přenese ho na leucin
 vytvoří mezi nimi peptidovou vazbu
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 39
Methionin je tedy první AK ve vznikajícím řetězci, důležité je zmínit, že má volný N-konec.
Syntéza proteinů tedy začíná od jejich N-konce.
Po vytvoření peptidové vazby dojde k uvolnění volné tRNA, která předtím nesla methionin –
přesune se do místa E (čímž uvolní místo P) a odpadne.
Reakce se účastní EF2 a GTP (po přesunu a odpadnutí se oba uvolní, GTP hydrolyzuje).
Po odpadnutí tRNA, která nesla methionin, dojde k translokaci tRNA, na které je navázán nově
vzniklý dipeptid do místa P a současně dochází k posunu ribozomu o jeden kodon.
Následuje vytvoření další tRNAaminokyselina
(v našem případě tRNAprolin
), ke které se připojí GTP a
příslušný iniciační faktor. Vzniklý komplex tRNA-GTP-iniciační faktor se naváže do místa A, vytvoří
se peptidová vazba… atd.
D) TERMINACE
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 40
Elongace pokračuje tak dlouho, dokud se ribozom nedostane k terminačnímu kodonu (ten se
octne na místě A větší ribozomální podjednotky). Pro STOP-kodon neexistuje žádná tRNA, která
by na sobě nesla příslušný antikodon, proto se k ribozomu napojí uvolňovací faktory (releasing
factors).
Vzniklý peptid (protein) je pomocí peptidyltransferasy oddělen od tRNA (hydrolýza) a následně
od ribozomu.
Ribozom disociuje na podjednotky, mRNA se uvolní.
Energetická bilance
Proces Reakce Ekvivalent ATP
Vznik aminoacyl-tRNA ATP → AMP + PPi 2
Vazba aminoacyl-tRNA do místa A GTP → GDP + Pi 1
Přesun peptidyl-tRNA na místo P GTP → GDP + Pi 1
CELKEM 4 ATP
Jak vidíme, je na vznik jedné peptidové vazby potřeba 4 ATP! Avšak uvědomme si, že další ATP
je potřeba pro iniciaci a syntézu nukleotidů.
Rychlost proteosyntézy
Proteosyntéza probíhá:
 u prokaryontů rychlostí cca 100 peptidových vazeb za sekundu
 u eukaryontů rychlostí cca 100 peptidových vazeb za minutu
Aby se efektivita translace zvýšila, vytvářejí se polysomy (polyribosomy). V podstatě se jedná o
to, že na jednu mRNA nasedne ribosom a začne vytvářet protein. Po té, co část vytvoří a
dostatečně se posune od místa startu, se na místo startu napojí další ribosom a začne
produkovat ten stejný protein a tak dále…
Rozestup mezi jednotlivými ribosomy je asi 80 nukleotidů.
11.6 Syntéza proteinů v mitochondriích
Mitochondrie obsahují 2-10 kopií uzavřené kružnicové dvouvláknové DNA, jejíž velikost kolísá
v závislosti na druhu (u živočichů má mitDNA cca Mr=107
).
mitDNA kóduje rRNA, tRNA a mRNA pro několik proteinů. Proteiny, které jsou v mitochondriích
kódovány, jsou jen nepatrnou frakcí proteinů vnitřní mitochondriální membrány, avšak jsou
esenciální pro průběh oxidativní fosforylace!!! (kódují např. část komplexů I, III a IV a
ATP-synthasy).
Syntéza proteinů v mitochondriích má podobné rysy jako syntéza u prokaryontů (iniciace pomocí
formylmethioninu, citlivost k antibiotikům apod.)
Když už mluvíme o podobnosti s prokaryonty, měli bychom zmínit, že mRNA bakterií je často
polycistronická, tzn. jedna molekula mRNA kóduje více proteinů. Tyto proteiny jsou často
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 41
metabolicky spřažené (např. mRNA kóduje 10 proteinů, přičemž všech 10 je potřeba pro syntézu
histidinu).
V polycistronické mRNA se nacházejí úseky, které se nepřekládají na začátku, na konci a mezi
každým úsekem pro určitou bílkovinu. S tímto jevem se u eukaryontů nesetkáme.
11.7 Účinky antibiotik na proteosyntézu
Proteosyntéza eukaryontů a prokaryontů je natolik rozdílná, že je možné tyto rozdíly využít při
výrobě antibiotik. Některá antibiotika mohou specifiky reagovat s proteiny bakteriálních
ribozomů, jiná mohou působit na eukaryontní mitochondriální proteosyntézu.
Princip účinku je jasný: zastavená proteosyntézy neumožní bakterii syntetizovat strukturní ani
signální proteiny, což brzy vede k jejímu zániku.
Tabulka na následující stránce uvádí některé příklady antibiotik a jejich vliv na proteosyntézu u
prokaryontů.
Tabulka 8 - Antibiotika působící na syntézu prokaryontů
Antibiotikum Účinek
Streptomycin Váže se k 30S ribozomální podjedtnoce, inhibuje tvorbu iniciačního
komplexu a vyvolá chyby ve čtení mRNA.
Tetracyklin Váže se k 30S ribozomální podjednotce a inhibuje vazbu aminoacyl-tRNA
do místa A
Chloramfenikol Váže se k 50S ribozomální podjednotce a inhibuje peptidyltransferasu
Erytromycin Váže se k 50S ribozomální pojednotce a inhibuje translokaci
Puromycin Obsazuje A-místo ribozomu a vyvolává předčasnou terminaci
11.8 Úpravy proteinů
Proteiny během a především po své syntéze procházejí celou řadou různých úprav.
A) Skládání proteinů
Během syntézy nejprve prostupuje nově vznikající polypeptidový řetězec skrze ribozom, po té jej
však opustí a dostane se do kontaktu s vnějším prostředím. Stává se tak nechráněným a nástává
jeho prostorové skládání (folding).
Tohoto skládání se účastní proteiny chaperony (heat shock proteiny) a jeho výsledkem je
vytvoření správné terciární struktury.
Poruchy ve skládání se projeví jako některé choroby, např. Alzheimerova choroba, BSE, cystická
fibróza ad.
B) Posttranslační úpravy proteinů a jejich transport
Posttranslační úpravy probíhají především na ER nebo v GA. Obsahují především:
 odstranění methinového zbytku
 změnu délky molekuly (odštěpení části řetězce)
 glykosylaci
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 42
Dalšími úpravami, kterými mohou proteiny posttranslačně procházet, jsou např. acetylace,
karboxylace, methylace, prenylace, hydroxylace, sulfatace ad. Těmto úpravám se však
podrobněji věnovat nebudeme.
Na uvedená místa (ER, GA) je potřeba proteiny dopravit. Proto se v této části jedenácté kapitoly
budeme věnovat nejen uvedeným úpravám, ale i transportu a třídění proteinů.
Transport bílkovin do subcelulárních a extracelulárních prostor (targeting)
Je-li protein syntetizován na volném ribozomu, jedná se o protein pro vlastní potřebu buňky
(nějčastěji). Zůstává proto v cytoplazmě, nebo je translokován do některé z buněčných organel.
Je-li protein syntetizován na ribozomu připoutanému k ER, jedná se o protein „určený na
export“. Je transportován do ER, GA, lysozomů, do membrán nebo je sekretován z buňky.
To, že jsou proteiny poslány tam, kam patří, zajišťuje sekvence AK, která je jejich součástí
(můžeme ji považovat za jakousi adresu).
Nyní se zaměříme na druhý případ, tedy na transport proteinů, které jsou syntetizovány na
ribozomech připojených k ER.
Translace těchto proteinů začíná v cytosolu. Syntetizovaý peptid obsahuje na začátku tzv. vodící
sekvenci (též signální peptid), na kterou se naváže SRP (signál rozpoznávající částice; signal
recognizing particle). SRP se naváže nejen na peptid, ale i na ribozom a dočasně inhibuje syntézu
proteinu.
SRP částice dopraví ribozom i s peptidem k membráně ER, kde se naváže na svůj receptor. Po
navázání na receptor dojde k navázání ribozomu na membránu ER. Následně se SRP uvolní, což
umožní pokračování proteosyntézy.
Signální peptid se prodlužuje a proniká dovnitř ER. Zde je odstraněn signální peptidasou. Syntéza
proteinu pak pokračuje až do konce – při terminaci dochází k jeho uvolnění do ER.
Proteiny, které se výše popsaným způsobem nesyntetizovaly na ER, jsou následně ve formě
vesiklů přenášeny na cis-stranu Golgiho aparátu.
V Golgiho aparátu se nachází třídící centrum – strukturní rysy proteinů určují, kam bude protein
nadále směřován (tzv. sorting):
 některé proteiny zůstanou v GA
 některé proteiny se vrátí do ER
 některé proteiny projdou přes GA až jeho trans-straně, kde jsou odděleny ve formě
lysozomů nebo sekrečních váčků váčků
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 43
Příklady intracelulárního třídění (sorting):
Př. 1: Proteinym, které jsou určené pro lysozomy, jsou označeny N-vázánými oligosacharidy
zakončenými mannosa-6-P.
Tuto „adresu“ poznají membránové proteiny na GA a ten se pak postará o to, aby byl protein
zabudován do klathrinem pokrytého veziklu.
Př. 2: Proteiny, určené pro vrácení se do ER, mají na karboxylovém konci proteinů sekvenci
Lys-Asp-Glu-Leu.
Glykosylace proteinů
Glykosylací proteinů (připojením cukerné složky) vznikají glykoproteiny. Rozlišujeme dva typy:
 N-glykosidové (oligosacharid se připojuje na amidovou skupinu asparaginu)
 O-glykosidové (oligosacharid se připojuje na –OH skupinu serinu nebo threoninu)
Tyto dvě skupiny se od sebe liší jak obsahem sacharidů, tak způsobem vzniku.
N-glykoproteiny
Nejprve dojde mimo bílkovinu k syntéze cukerné složky, která se až po té napojí na –NH2
skupinu argininu.
Významnou roli hraje polyisopren dolichol (známe jej např. ze syntézy cholesterolu).
CH2 C
CH3
H CH CH2 CH2 CH CH2 CH2 OH
CH3
16-19
dolichol
Dolichol se v podobě dolicholdifosfátu vyskytuje na membráně ER. Na jeho koncový fosfát se
mohou připojovat aktivované monosacharidy (UDP-sacharidy), připojování sacharidů katalyzují
příslušné glykosyltransferasy.
Hotový oligosacharid je pak přenesen na bílkovinu (na již zmíněný asparagin).
Oligosacharid je složený především z N-acetylglukosaminu, manosy a glukosy (dále pak
z galaktosy a N-acetylneuraminové kyseliny). Přesný postup jeho syntézy zde uvádět nebudeme,
výsledek vypadá tak, jak je znázorněno na obrázku níže:
Tento oligosacharid je následně přenesen na protein, kde dochází k jeho finálním úpravám. Ve
výsledku rozlišujeme tři hlavní typy N-glykoproteinů:
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 44
 vysoce manosový typ
 hybridní typ (jednoanténový)
 komplexní typ (trojanténový)
O-glykoproteiny
Probíhá v ER a v GA. Na –OH skupinu serinu nebo threoninu se rovnou navazují aktivované
monosacharidy a na ty se následně napojují další, dokud nevytvoří potřebný oligosacharid.
Úprava proteinů odštěpením části jejich struktury
typickým příkladem jsou proteiny nacházející se v GIT (např. změna pepsinogen → pepsin). My si
uvedeme jako příklad syntézu inzulinu.
Inzulin ihned po své syntéze vypadá následovně (jedná se o preproinsuin):
Z preproinzulinu je odštěpen vodící peptid, čímž vznikne proinzulin:
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 45
Následně je v GA pomocí karboxypeptidas vyštěpen C-protein a jsou vytvořeny disulfidické
můstky. Tím získáme finální podobu inzulinu.
Vzniklý inzulin v GA ukládán do sekrečních granul, která z GA putují k cytoplazmatické
membráně. Po stimulaci s membránou fúzují a inzulin se vylévá do extracelulárního prostoru.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 46
11.9 Regulace genové exprese
Genová exprese v sobě zahrnuje tvorbu proteinů nebo RNA produktů. Obvykle je v daném čase
exprimováno v buňce jen malé množství genů.
Regulace je opět rozdílná u prokaryontů a eukaryontů. Nejprve se zaměříme na regulaci u
prokaryontů, pak u eukaryontů.
Prokaryonti
Prokaryotické organismy obsahují jedinou kružnicovou molekulu DNA, která není nikterak
komplexovány s proteiny (dokonce jádro není odděleno od cytoplazmy).
Výše uvedená fakta, spolu s tím, že transkripty mRNA neobsahují introny, umožňují to, že
transkripce i translace probíhají simultánně.
Regulace genové exprese je tedy (v souvislosti s uvedenými skutečnostmi) jednodušší než u
eukaryontů a probíhá především na úrovni regulace transkripce.
Operonová teorie
V bakteriální DNA jsou strukturní geny často sdružovány do skupin, které nazýváme operony
(pod pojmem operon rozumíme nejen skupinu genů, ale i promotor, který této skupině
předchází).
V jedné molekule mRNA z operonu vytvořené se proto vyskytuje informace o více proteinech
(říkáme, že je polycistronická; viz dříve). Jednotlivé úseky pro různé proteiny jsou od sebe
odděleny sekvencemi AGGU.
Geny jednoho operonu bývají exprimovány současně (jsou všechny zapnuty, nebo všechny
vypnuty) a jejich regulace je řízena jediným promotorem!
Regulována je především RNA polymerasa a to jak pozitivně (zvýšení transkripce), tak negativně
(snížení transkripce).
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 47
Negativní kontrola RNA-polymerasy prokaryont
Na regulačním genu je nesyntetizována mRNA a podle ní represor. Represor difunduje
k promotoru a váže se v oblasti nazývané operátor (nejčastěji se operátor nachází právě v oblasti
promotoru). Navázány represor pak blokuje vazbu RNA-polymerasy a syntéza mRNA pro určité
proteiny neprobíhá.
Činnost represoru je možné kontrolovat dvěma způsoby:
 indukcí
 korepresí
Indukce využívá malou molekulu jménem induktor (většinou malá molekula některé ze
základních živin, či jejich metabolitů). Jeho navázáním na represor vede ke změně konformace a
represor se tak odpojí od operátoru a transkripce může začít.
PŘED NAVÁZÁNÍM (transkripce neprobíhá) PO NAVÁZÁNÍ (transkripce probíhá)
Příklad indukce: Indukce lac operonu laktosou u E. Coli
Enzymy pro metabolismus glukosy glykolýzou jsou u E. Coli produkovány konstitutivně (tedy
pořád). Chybí-li ale glukosa a je-li přidána laktosy, buňky se adaptují a začnou produkovat další
enzymy kódované lac operonem.
Jako induktor slouží allolaktosa (isomer laktosy vznikající spontánně), která se váže na represor a
tím jej inaktivuje. Inaktivace represoru způsobí, že se RNA-polymerasa může navázat
k promotoru a zahájit transkripci, přičemž přepisuje strukturní geny v lac operonu a produkuje
polycistronickou mRNAm, která kóduje enzymy jako β-galaktosidasu, permeasu a transacetylasu.
Děj probíhá pouze tehdy, je-li v buňce nedostatek glukosy!
V případě koreprese vypadá situace následovně: i přes to, že je represor navázaný, dochází
k transkripci. Až po vazbě korepresoru (vytvoří se komplex represor-korepresor) je transkripce
zastaveny. Korepresory jsou stejně jako induktory malé molekuly pocházející z metabolismu
živin.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 48
PŘED NAVÁZÁNÍM (transkripce probíhá) PO NAVÁZÁNÍ (transkripce neprobíhá)
Příklad koreprese: koreprese trp operonu (syntéza tryptofanu u E. Coli)
Geny pro enzymy syntézy tryptofanu (celkem 5 enzymů) jsou soustředěny v trp operonu.
Tryptofan samotný je korepresorem – váže se k inaktivnímu represoru a vytváří komplex
represor-tryptofan. Tento komplex inhibuje transkripci operonu.
Pozitivní kontrola RNA-polymerasy prokaryont
Stimulační (regulační) proteiny pozitivní kontroly se vážou k promotoru a stimulují navázání
RNA-polymerasy.
Regulační protein je sám o sobě aktivován na základě přítomnosti nebo nedostatku molekuly
určité živiny (nebo jejího metabolitu) v buňce.
Příklad pozitivní kontroly: vliv přítomnosti glukosy na lac operon u E. Coli
Transkripce lac operonu může být indukována allolaktosou (viz výše) pouze v nepřítomnosti
glukosy.
Pokles hladiny glukosy v buňce vyvolá zvýšení hladiny cAMP (není známo proč). cAMP se
naváže na svůj receptor v buňce (CRP – cAMP-receptor protein). Komplex cAMP-CRP se naváže
do regulační oblasti lac operonu, stimuluje vazbu RNA polymerasy k promotoru a transkripci
genů pro metabolismus laktosy.
Buňka tedy metabolizuje laktosu, pouze pokud nemá k dispozici glukosu.
Atenuace transkripce
Atenuace znamená předčasné ukončení (přerušení) transkripce změnou sekundární struktury
mRNA. Dochází k ní v případě, že buňka nepotřebuje produkt trasnrkipce. Součástí operonu je
oblast zvaná atenuátor (zpomalovač).
Příklad si uvedeme na trp operonu, který vytváří tryptofan:
U prokaryont probíhá transkripce i translace najednou. Představme si, že za RNA-polymerasou,
která vytváří mRNA pro proteiny syntézy tryptofanu, se už pohybuje ribozom a vytváří tyto
proteiny. Jak se RNA-polymerasa blíží k 5‘ konci transkriptu, objevuje se mnoho kodonů pro
tryptofan.
Je-li tryptofanu (a tRNAtryptofan
) v buňce dostatek, ribozom jej může do vznikajícího proteinu
zařazovat bez větších problémů a pohybuje se po mRNA velmi rychle. Avšak tento rychlý pohyb
ribozomu vede k tomu, že se na mRNA vytvoří smyčka. Tato smyčka dává pokyn
RNA-polymerase, že má přestat transkribovat. Transkripce je tak zastavena, protože buňka má
tryptofanu dostatek.
Pokud je ale hladina tryptofanu nízká (a tím jsou nízké i hladiny tRNAtryptofan
), ribozom se
pohybuje pomalu a smyčky na mRNA se netvoří – RNA-polymerasa tedy nemá důvod zastavit
transkripci a dokončí přepis operonu. Tím pádem dochází k syntéze tryptofanu.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 49
Úroveň rychlosti transkripce je tedy nastavena podle hladiny tryptofanu v buňce (při vysoké
hladině tryptofanu se operon nadále nepřepisuje, při hladině nízké, kdy je tryptofan potřeba,
není jeho transkripce zastavena).
Poznámka autora: Doufám, že jsem atenuaci pochopil správně, pokud máte jakékoliv pochybnosti, napište mi.
Eukaryonti
Rozdíl oproti prokaryontům:
Oproti prokaryontům je DNA organizovaná v nukleosomech, geny je tedy potřebné nejprve
dostat do jejich aktivní formy (změna heterochromatinu na euchromatin). Geny nejsou v DNA
uspořádány v operonech a dokonce geny, které kódují proteiny účastnící se jedné metabolické
dráhy, bývají rozmístěny na rozdílných chromozomech. Z toho vyplývá, že každý gen má svůj
vlastní promotor.
Navíc je DNA umístěna v jádře a ribosomy v cytoplazmě, není tedy možné, aby transkripce a
translace probíhaly simultánně.
Genovou expresi je možné ovlivňovat na každé úrovni vedoucí od DNA k proteinu:
 na úrovni DNA a chromozomů
 na úrovni transkripce
 na úrovni úpravy transkriptů
 na úrovni iniciace translace
Ovlivnění genové exprese na úrovni DNA a chromosomů
Remodelace chromatinu
Jak bylo řečeno, je DNA v jádře umístěna v podobě chromatinu. Chromatin může být:
a) kondenzovaný (heterochromatin; geny jsou neaktivní)
b) difuzní (euchromatin; geny jsou aktivní)
Změna stavu chromatinu vede k aktivaci (přeměna heterochromatin → euchromatin) nebo
inhibici (přeměna euchromatin → heterochromatin) transkripce.
Tyto změny je možné provádět:
 rozvinutím (stočením) určitého úseku DNA (energii dodává štěpení ATP)
 kovalentní modifikací histonů pomocí acetylace a deacetylace na ε-aminoskupinách
v postraních řetězcích lysinu (např. u histonu H2A, H2B, H3 a H4)
Methylace DNA
DNA je možné methylovat na jejích cytosinových zbytcích, čímž vznikne 5-methylcytosin.
Methylace probíhá často v oblastech bohatých na GC-sekvence v přítomnosti promotorové
oblasti genu (reakci katalyzuje enzym methylasa a hovoříme o tzv. postsyntetické modifikaci
DNA).
Geny, které jsou výše popsaným způsobem methylovány jsou hůře transkribovány.
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 50
Příklad: Geny pro globin jsou methylovány v neerythroidních buňkách (v těch neprobíhá syntéza
hemoglobinu, tak není potřeba aby byly aktivní). Naopak v erytroblastech a retikulocytech (tedy
prekursorech erytrocytů, v nichž syntéza hemoglobin probíhá) tyto geny methylovány nejsou.
Přeskupování genů
Segmenty DNA se mohou v rámci genomu přeskupovat a asociovat s jinými segmenty (tedy
s jinými geny). Toto se odehrává pouze v některých buňkách, např. v imunoglobulinech.
Amplifikace genu
Při genové amplifikaci dochází k tomu, že určitá oblast DNA (určitá oblast chromozomu) podléhá
opakovaným cyklům replikace DNA. Nově syntetizovaná DNA je vystřižena a tvoří malé,
nestabilní chromozomy zvané double minutes. Tyto se pak integrují do jiných chromosomů a
příslušný gen je tak amplifikován.
Normální amplifikace je vyvolána chybami při replikaci DNA a při buněčném dělení.
Příklad: U pacientů léčených methotrexátem (inhibitor (dihydro)folátreduktasy) se vyvinula
resistence na lék – tzn., že přestal být účinný. Příčinou je zvýšení počtu genů pro
(dihydro)folátreduktasuv důsledku amplifikace.
Delece genu
Vzniká jako důsledek mutace, gen je pří ní zcela ztracen.
Regulace genové exprese na úrovni transkripce
Geny, jejichž transkripce probíhá konstitutivně, jsou regulovány složkami tzv. bazálního
transkripčního komplexu (tj. RNA-polymerasou a bazálními transkripčními faktory, které se váží
k TATA-boxu do oblasti promotoru). Pokud není tento komplex úplný (chybí byť jen jediný
transkripční faktor), transkripce neprobíhá.
Expresi genů je dále možné ovlivnit pomocí specifických transkripčních faktorů, které se váží
mimo promotor. Tyto transkripční faktory mohou transkripci aktivovat nebo inhibovat, samotné
transkripční faktory je možné ovlivňovat pomocí fosforylace, defosforylace, cytosiny a dalšími
způsoby.
(Pro více informací viz Transkripce DNA).
Regulace genové exprese na úrovni úpravy transkriptů
Do těchto úprav zařazujeme:
 alternativní sestřih (jediný gen může produkovat různé proteiny; viz výše)
 editaci RNA (viz dále)
Editací RNA rozumíme její posttranskripční úpravu (primární transkript hnRNA je tedy stále
stejný, až po jeho syntéze dojde ke změně). Touto změnou může být přidání nebo odebrání
nukleotidu, či záměna bází.
Příklad: Syntéza apoB v hepatocytech a enterocytech
Protein, který je syntetizován podle genu apoB je součástí chylomikronů a VLDL.
 v hepatocytech kóduje gen apoB protein, který obsahuje 4563 AK
 v enterocytech kóduje tentýž gen protein, který obsahuje pouze 2152 AK
© JN 2009 Kapitola 11 – Nukleové kyseliny 51
Gen je v obou případech přepsán do primárního transkriptu, avšak v něm dojde v případě
enterocytů k deaminaci cytosinu na uracil a tím vznikne STOP-kodon. Proto je protein kódovaný
v enterocytu kratší – tvoří pouze 48% délky proteinu hepatálního.
Regulace genové exprese na úrovni translace
Na úrovni translace je možné ovlivňovat aktivitu eukaryotických iniciačních faktorů (eIF).
Příklad: Syntéza globinu v retikulocytech
Faktor eIF2 je aktivní v případě, že je defosforylovaný. Je-li v buňce dostatek hemu, je inhibovaná
kinasa, která by mohla eIF2 fosforylovat, eIF2 je tak aktivní a syntéza globinu probíhá.
Je-li v buňce přítomno málo hemu, je kinasa aktivní, eIF2 je proto fosforylovaný a je tudíž
neaktivní (nedochází k syntéze globinu, protože není hem, který by do něj patřil)