Biotransformace
xenobiotik
1biochemie 12_4
Řecké slovo ξένος [xenos] znamená cizí
• Xenobiotika jsou látky, které se v organismu normálně
nevyskytují
• Do těla se dostávají hlavně s potravinami nebo jako léky
• Chemický průmysl – produkuje syntetické sloučeniny, které
se nevyskytují v přírodě (plasty, pesticidy, barviva, aditiva …)
• Farmaceutický průmysl – produkuje sloučeniny syntetické
a izolované z přírodních zdrojů (rostliny) – nevyskytují se
v lidském organismu
biochemie 12_4 2
Vstup xenobiotik do těla
• tři hlavní vstupy: střevo, plíce, kůže
• bariéry mezi krví a tkáněmi jsou tvořeny epitely
– ty obsahují fosfolipidovou dvojvrstvu
• průnik xenobiotika závisí na jeho fyz.-chem. vlastnostech
• lipofilita usnadňuje průnik fosfolipidovou dvojvrstvou
3biochemie 12_4
Vstup xenobiotik do buněk
• Volná difuze – významné pro lipofilní látky, rychlost závisí
na konc. gradientu (játra – volně prostupná, velké póry v
buněčné membráně, jsou nejvíce zasažená při otravách)
• Usnadněná difuze – přenašeče, strukturní podobnost s
endogenními substráty  využití existujících transportních
systémů
• Aktivní transport – primární, sekundární
• Endocytóza
4biochemie 12_4
Biotransformace xenobiotik v buňce
• Probíhá převážně v játrech, dvě fáze:
• I. Fáze - převážně hydroxylace, produkt často výrazně
biologicky aktivní
• II. Fáze – konjugace, produkt většinou neaktivní
• Výsledkem jsou polárnější deriváty, které se mohou vyloučit
močí (žlučí) ven z těla
5
Velmi hydrofobní látky by bez biotransformace mohly
přetrvávat v tukové tkáni neomezeně dlouho!!
biochemie 12_4
Exkrece xenobiotik z buňky
• primární aktivní transport – vyžaduje energii, štěpení ATP
speciální ATP-asy zvané ABC (ATP binding cassette)
• lokalizované v plazmatických membránách, exportují xenobiotika
z buňky do ECT
• MRP (multidrug resistence protein) – při zvýšené expresi jsou
zodpovědné za rezistenci vůči lékům
6biochemie 12_4
Exkrece xenobiotik z těla
• chemicky modifikovaná xenobiotika se vylučují z těla
močí, potem, stolicí
• těkavé látky - plícemi
• někdy dochází ve střevě k dekonjugaci a zpětné
resorpci (enterohepatální oběh – past)
• exkrece do mateřského mléka
7biochemie 12_4
Příklady reakcí I. fáze biotransformace
Reakce Příklad xenobiotika
Hydroxylace
Sulfooxidace
Dehydrogenace
Redukce
Hydrolýza
(hetero)aromatické sloučeniny (Ar-H  Ar-OH)
dialkylsulfid (R-S-R)  sulfoxid (R-SO-R)
alkohol / aldehyd-hydrát  aldehyd / kyselina
nitrosloučeniny (R-NO2)  aminy (R-NH2)
ester  kyselina + alkohol
8
Reakce probíhají hlavně v ER, některé v cytosolu
Enzymy I. fáze jsou poměrně nespecifické – výhoda !!
biochemie 12_4
Cytochromy P-450 (CYP)
• Skupina (nadrodina) hemových enzymů (velké množství izoforem)
• Mohou katalyzovat různé typy reakcí, hlavně hydroxylaci
• Široká a překrývající se substrátová specifita - výhoda
• Mohou být indukovány a inhibovány
• Obsaženy ve všech tkáních (kromě svalů a erytrocytů)
• Nejvíce zastoupené v játrech (ER)
• Vykazují genetický polymorfismus – atypická biotransformace léčiv
9
Vysvětlení zkratky: P = pigment, 450 = vlnová délka (nm), při které enzym výrazně
absorbuje po navázání oxidu uhelnatého CO
biochemie 12_4
Podíl isoforem CYP na metabolismu léčiv
10
4 % 1A2
11 % 2C
30 % 2D6
2 % 2E1
52 % 3A4
1 % ostatní
biochemie 12_4
Mechanismus hydroxylace působením CYP
• vznik hydroxylové skupiny (R-H  R-OH )
• jsou to monooxygenasy, z molekuly O2 se inkorporuje jeden
atom O do substrátu, mezi C a H
• druhý atom O vytváří vodu, donorem 2H je NADPH + H+
• dochází k redukci dikyslíku na -OH skupinu a vodu
11
R-H + O2 + NADPH + H+  R-OH + H2O + NADP+
2 e- + 2 H+
biochemie 12_4
Složky systému cytochromu P-450
NADP
+
FAD
FADH2
Fe
++
hem
Fe
+++
hem
NADPH H
+
+
2 H
+
cyt. reduktasa cyt P-450
RH
R OH
O2
H2O
12
Systém cytochromu P-450 je složen ze:
• dvou enzymů a tří kofaktorů (NADPH, FAD, hem)
• NADPH:CYP reduktasa (dělič elektronového páru, 2 H  2 e- + 2 H+)
• cytochrom P-450 (hydroxylasa)
biochemie 12_4
13
cyt P-450
Fe
+3
A H
cyt P-450
Fe
+3
A H
cyt P-450
Fe
+2
A H
NADPH + H
NADP
O2
e
e
cyt P-450
Fe
+2
A H
O2
cyt P-450
Fe
+2
A H
O2
2 H
H2O
A OH
hydroxylovaný
substrát
substrát
Podrobnější schéma hydroxylace ukazuje aktivaci a redukci O2
biochemie 12_4
Hydroxylace účinkem CYP nastává u
endogenních i exogenních substrátů
• Endoplazmatické retikulum:
skvalen, cholesterol, žluč. kyseliny, kalciol,
desaturace MK, prostaglandiny, xenobiotika
• Mitochondrie:
steroidní hormony
14biochemie 12_4
Srovnání různých hydroxylačních reakcí
Substrát Produkt Původ O Koreduktant Další složky
Fenylalanin
Xenobiotika
Prolin
Dopamin
tyrosin
xen-OH
4-OH-Pro
noradrenalin
O2
O2
O2
O2
BH4
NADPH+H+
2-oxoglutarát
askorbát
FAD,
hem
Fe2+, askorbát
Cu2+
15biochemie 12_4
Hlavní izoformy cytochromu P-450
CYP Substráta Induktora Inhibitora
CYP1A2
CYP2A6
CYP2C9
CYP2C19
CYP2D6
CYP2E1
CYP3A4
theofylin
methoxyfluran
ibuprofen
omeprazol
kodein
halothan
diazepam
cig. kouř
fenobarbital
fenobarbital
fenobarbital
rifampicin
alkoholb
fenobarbital
erythromycin
methoxsalem
sulfafenazol
teniposid
chinidin
disulfiram
grapefruit
16
Různé subtypy enzymu preferují různé substráty, mají různé induktory a inhibitory
a Pouze vybrané příklady z mnoha existujících. b viz dále.biochemie 12_4
Indukce a inhibice CYP 450
• Některá xenobiotika vyvolávají indukci syntézy CYP, metabolická
kapacita CYP se tím zvýší
• Je-li současně s induktorem podán lék metabolizovaný stejným
CYP  léčivo je odbouráno rychleji  léčivo je méně účinné
• Některá xenobiotika působí jako inhibitory CYP
• Nejrozšířenější izoformou je CYP3A4, metabolizuje více jak 120
různých léčiv
• Inhibitory CYP3A4 jsou makrolidová ATB (Rulid, Klacid),
grapefruit (furanokumariny), ketokonazol
• Současné podání inhibitorů s léčivem  zvýšená koncentrace
léčiva  předávkování  nežádoucí účinky
17biochemie 12_4
Mechanismy indukce CYP
18
induktor (komplex s intracelulárním receptorem):
• váže se na DNA a zvyšuje transkripci mRNA =
stimulace syntézy CYP
• snižuje rychlost degradace mRNA a/nebo CYP
• ovlivňuje posttrankripční modifikace mRNA
• může vyvolat hypertrofii ER
biochemie 12_4
19
Genetický polymorfismus CYP450 a klinický účinek
vyšší hladiny léku
nežádoucí účinky
toxicita
Pomalý
metabolizátor
žádný / nedostatečný
efekt
Ultrarychlý
metabolizátor
Střední (Rychlý)
metabolizátor
normální odpověď
klinický účinek léčiva
Př. warfarin
krvácivé stavy
Problém:
psychofarmaka
Průměrná dávka léčiva
většina populace
biochemie 12_4
Biotransformace benzenu
H
hydroxylace
(CYP 450)
O
H
20
Důkazem chronické expozice benzenu je zvýšené vylučování
fenolu močí (pracující v chem. průmyslu, čichači, sniffers)
Příklad
biochemie 12_4
Biotransformace polycyklických aromatických uhlovodíků
(PAU)
O
epoxid OH
HO
H2O
OH
HO
O
dihydrodiol
vazba na DNA, mutace
nádory (kůže, plíce)
21
benzo[a]pyren
Příklad
biochemie 12_4
Polycyklické aromatické uhlovodíky
v životním prostředí
• Průmyslové zdroje: spalovaní uhlí, benzínu, nafty;
výroba koksu, asfaltu; havárie tankerů; zapalování
ropných vrtů; popílek v ovzduší …
• Neprůmyslové zdroje: požáry lesů, spalování odpadů,
domácí topeniště, cigaretový kouř …
• Potraviny: smažené, uzené, grilované potraviny,
přepálený tuk, připálené maso a pečivo …
22biochemie 12_4
Co vzniká spalováním
Materiál Toxické produkty spalování
PVC
Polystyrén
PET lahve
Dřevo z demolice, nábytku
Zbytky jídla, tráva, listí ...
Barevné časopisy
Tetrapak
Pneumatiky
Dioxiny
Styrén
Polycyklické aromatické uhlovodíky
Dioxiny
Dioxiny
Těžké kovy
Chlororganické látky, těžké kovy
Polycyklické aromatické uhlovodíky
23biochemie 12_4
II. Fáze biotransformace
• Konjugace - syntetický charakter
• Xenobiotikum po I. fázi biotransformace reaguje s
endogenní konjugační složkou
• Vzniká konjugát, polárnější – snadno se vylučuje močí/žlučí
• Endergonní charakter - nutná energie (reaguje aktivovaná
konjugační složka nebo aktivované xenobiotikum)
• Enzymy - transferasy
24biochemie 12_4
Přehled konjugačních činidel
Typ konjugace Konjugační činidlo Skupina v xenobiotiku
Glukuronidace
Sulfatace
Methylace
Acetylace
Glutathionem
Aminokyselinou
UDP-glukuronát
PAPS
SAM
acetyl-CoA
glutathion
glycin, taurin
-OH, -COOH, -NH2
-OH, -NH2, -SH
-OH, -NH2
-OH, -NH2
Ar-Hal, Ar-epoxidy
-COOH
25biochemie 12_4
Biosyntéza UDP-glukuronátu
O
OH
OH
OH
O
CH2OP
H
O
O
OH
OH
O
CH2HO
PH
O
O
OH
OH
O
CH2HO
UDPH
UTP
glukosa-6-P glukosa-1-P UDP-glukosa
H
O
O
OH
OH
O
C
UDP
OO NAD
+
H2O
NAD
+
glukosiduronáty
UDP-glukuronát
26biochemie 12_4
UDP-glukuronát
N
OHOH
O
NH
O
O
O
P
O
O
O
P
O
O
O
O
OH
O
COO
H
H
27
N-glykosidová vazba
O-glykosidová vazba
esterového typu
O
biochemie 12_4
Glukuronáty jsou nejčastější konjugáty
• Vznikají O-glukosiduronáty
etherový typ (Ar-O-glukuronát, R-O-glukuronát)
esterový typ (Ar-COO-glukuronát)
• N-, S-glukosiduronáty
• Substráty: arom. aminy, amfetaminy, kys. salicylová, léčiva, flavonoidy, …
• Endogenní substráty: bilirubin, steroidy
28biochemie 12_4
Biotransformace amfetaminu
CH2 CH NH2
CH3
CH2 CH NH2
CH3
HO
CH2 CH NH2
CH3
O
O
OHHO
HO
HOOC
I. fáze
II. fáze
29
Příklad
O-glukosiduronát
etherového typu
Příznaky užívání: neklid, euforie,
upovídanost, třes, nespavost, pocení,
sucho v ústech, rozšířené zřítelnice,
hubnutí, úzkostné stavy, paranoia,
halucinace
biochemie 12_4
PAPS je sulfatační činidlo
(phospho adenosine phospho sulfate)
O
OHO
O
P
P
O
O
OS
O
O
O
O
O
O
N
N
N
N
NH2
30
Fyziologické sulfatace:
Glykosaminoglykany
heparin, dermatansulfát,
keratansulfát, chondroitinsulfát
Sulfoglykosfingolipidy
(kyselé glykolipidy, sulfatidy)
biochemie 12_4
Konjugace fenolu
konjugace
O glukuronát O sulfát
H
hydroxylace
(CYP 450)
OH
31
Příklad
biochemie 12_4
Methylace je součástí inaktivace katecholaminů a estrogenů
32
CH2HO
HO
CH2 NH2 CH2HO
HO
C
H
O
CH2HO
HO
C
OH
O
CH2HO
O
C
OH
O
CH3
dopamin
MAO
- NH3
dihydroxyfenyloctová kys.
COMT
homovanilová kys.
MAO monoaminooxidasa, COMT katechol-O-methyltransferasa
SAM
Inaktivace může probíhat i v opačném pořadí: nejdříve COMT, pak MAO, výsledný produkt je stejný.
dihydroxyfenylacetaldehyd
biochemie 12_4
Glutathion má trojí význam
-glutamylcysteinylglycin
• Redukční činidlo (glutathionperoxidasa)
• Konjugační činidlo (glutathiontransferasa)
Endogenní substráty – konjugace leukotrienů
• Transport AK do buněk (-glutamyltransferasa)
33biochemie 12_4
Glutathion (GSH)
34
HOOC
N
N COOH
O
H
CH2
SH
O
H
NH2



R-X + GSH  R-SG + XH (R-X epoxidy, halogenalkany)
nukleofilní
skupina
elektrofilní
centrum
biochemie 12_4
Před exkrecí vznikají z R-SG merkapturové kyseliny
35
N-acetyl-S-substitovaný cystein
(merkapturová kyselina)
Příklad
GSH
acetyl-S-CoA
CoA-SH
Glu + Gly
epoxid
biochemie 12_4
Konjugace aminokyselinami
• glycin, taurin
• xenobiotika s -COOH skupinou
• vznik amidové vazby
• endogenní substráty – žlučové kyseliny
36biochemie 12_4
C
OH
O glycin
C
NH
O
CH2 C
OH
O
benzoová kys. hippurová kyselina
(N-benzoylglycin)
37
CH3 CH2OH COOH
toluen benzylalkohol benzoová kys.
aktivovaná navázáním
na CoA: benzoyl-CoA
biochemie 12_4
Biotransformace ethanolu v játrech (cytosol)
38
H3C C
H
H
O
H
+ NAD H3C C
H
O
+
alkoholdehydrogenasa
aldehyddehydrogenasa
+ H2O H3C C
OH
H
O
H
H3C C
OH
ONAD
- 2H
NADH+H
H3C C
H
O
acetaldehyd
aldehyd-hydrát octová kyselina
(acetaldehyddehydrogenasa)
biochemie 12_4
TEST
• Alkoholdehydrogenasa (AD) – metaloenzym (Zn), více
molekulových forem, v játrech, plicích, ledvinách, GIT, a
dalších tkáních
• Žaludeční forma je výrazně aktivnější u mužů než u žen
• Acetaldehyddehydogenasa (AcD) – více forem, játra,
cytosol i mitochondrie
39biochemie 12_4
Další dráhy biotransformace ethanolu
40
ER hepatocytu:
MEOS (mikrosomální ethanol oxidující systém, CYP2E1)
CH3-CH2-OH + O2 + NADPH+H+  CH3-CH=O + 2 H2O + NADP+
Tento systém se aktivuje až při zvýšené konzumaci alkoholu
= vyšší hladiny (> 0,5 ‰)  zvýšená produkce acetaldehydu
Peroxisomy: oxidace ethanolu za účasti peroxidu vodíku, katalasa
CH3-CH2-OH + H2O2  CH3-CH=O + 2 H2O
biochemie 12_4
Důsledky biotransformace ethanolu
41
Ethanol
ADH
MEOS
AcetaldehydČástečně rozpustný
v membr. lipidech
zvýšení fluidity membrán
toxický efekt
(CNS)
adukty s
proteiny, nukl.
kys., biog.
aminy
acetát
acetyl-CoA
syntéza MK  TAG
steatosa jater
ADH
Nadbytek NADH v cytosolu
Reoxidace pyruvátem
nadbytek laktátu = nedostatek pyruvátu
snížení glukoneogeneze
laktátová acidóza
různé produkty
(kocovina)
biochemie 12_4
Reakcí acetaldehydu s biogenními aminy vznikají
deriváty tetrahydroisochinolinu (tzv. živočišné alkaloidy)
NH2
HO
HO
H
C
O
CH3
HO
HO
N
CH3
H
42
salsolinol
6,7-dihydroxy-1-methyl-1,2,3,4-tetrahydroisochinolin
dopamin
- H2O
acetaldehyd
biochemie 12_4
Tabák
Látky nikotin, produkty nedokonalého spalování
Účinky
euforie, psychická relaxace, zvýšení tepové frekvence,
vazokonstrikce, stimuluje sekreci adrenalinu („tichý stres“),
zvyšuje sekreci slin a žaludeční šťávy, zesiluje střevní
peristaltiku (defekační účinek první ranní cigarety)
Příznaky
užívání
typický zápach, zažloutlé prsty a zuby
Rizika
plicní choroby (CHOPN, nádory), infarkt, vředová choroba
žaludku, poruchy potence, předčasné vrásky
43biochemie 12_4
Nikotin je hlavní alkaloid tabáku
N
N
CH3
44
3-(1-methylpyrrolidin-2-yl)pyridin
Na krabičce cigaret
Nikotin: 0.9 mg/cig.
Dehet: 11 mg/cig.
Co se děje při hoření cigarety?
sušený tabák podléhá nedokonalému spalování, vzniká složitá směs produktů
nikotin částečně destiluje a přechází do kouře (aerosolu),
částečně se pyrolyticky rozkládá
biochemie 12_4
Cigaretový kouř obsahuje
• volný nikotin (bázi) - váže se na nikotinové receptory
v mozku, dřeni nadlevin a jinde
• CO - váže se na hemoglobin, vzniká karbonylhemoglobin –
ischemie tkání (u silných kuřáků až 12 % CO-Hb)
• oxidy dusíku - mohou generovat volné radikály
• polykondezované aromatické uhlovodíky (PAU)
(pyren, chrysen …), hlavní složky dehtu,
atakují a poškozují DNA, karcinogeny
• další látky (N2, CO2, HCN, CH4, terpeny, estery …)
45biochemie 12_4
Biotransformace nikotinu
N
N
CH3
N
N
H
N
N
CH3
OH
N
N
CH3
O
46
nikotin
nornikotin 5-hydroxynikotin
kotinin
nikotin-N-glukuronát
kotinin-N-glukuronát
Příklad
biochemie 12_4
Jak odhalit kuřáka?
1. test se slinami kuřákovy
sliny obsahují mnohonásobně více thiokyanatanu než sliny
nekuřáka, poločas 6 dní,
thiokyanatan SCN- vzniká biotransformací CN(síra
pochází z katabolismu cysteinu)
reakcí s Fe3+ ionty  červený komplex
2. nikotin v moči
3. minoritní alkaloidy tabáku a metabolity nikotinu v moči
(kotinin, nornikotin, anatabin, anabasin)
47biochemie 12_4
Biotransformace vybraných léčiv
Léčivo Biotransformace Metabolit
Diazepam
Kodein
Bromhexin
Paracetamol
Acetylsalicylová k.
hydroxylace, demethylace
demethylace
hydroxylace, demethylace
konjugace, oxidace
hydrolýza, hydroxyl., konjug.
oxazepam (aktivní stejně)
morfin (aktivní jinak)
ambroxol (aktivní)
různé konjugáty (neaktivní)a
různé konjugáty (neaktivní)
48
a Situace může být složitější, viz dále
biochemie 12_4
Hlavní dráha biotransformace paracetamolu je
konjugace
H
N
C
CH3
O
OH
PAPS
H
N
C
CH3
O
O
S
O
O
O
UDP-glukuronát
H
N
C
CH3
O
O
OOOC
HO OH
HO
49
paracetamol
N-(4-hydroxyfenyl)acetamid
biochemie 12_4
Vedlejší dráha biotransformace paracetamolu vede k
hepatotoxickému chinoniminu
H
N
C
CH3
O
O
H
cyt P-450
N
C
CH3
O
O
N-acetylbenzochinonimin
(hepatotoxický)
NADPH H
+
O2+ +
NADP
+
H2O+ 2
paracetamol
50
 nebezpečí při předávkování
 u alkoholiků je větší část paracetamolu
metabolizována na chinonimin
CYPE21
indukovaný alkoholem
váže se na buněčné
proteiny - nekróza
biochemie 12_4
Biotransformace acetylsalicylové kyseliny
COOH
OCOCH3
esterasa
COOH
OH
salicylová kys.
COOH
OH
HO
cyt P-450
gentisová kys.
UDP-glukuronát
salicyl(acyl)-glukosiduronát
salicyl(fenol)-glukosiduronát
glycin
glycin
salicyloyl-glycin
gentisoyl-glycin
51biochemie 12_4
Polypragmazie a její důsledky
• užívání mnoha léčiv současně
• vzájemná interakce léčiv nebo jejich metabolitů
(potencování, inhibice)
• indukce, ale současně zatížení hydroxylujícího systému
(CYP450)
• více se uplatňují vedlejší (minoritní) dráhy
biotransformace  výraznější toxické účinky
• možná deplece glutathionu …. atd.
52biochemie 12_4
Vybrané ukazatele jaterního poškození
Analyt (sérum) Referenční hodnoty Změna
ALT
GMD
GMT
Bilirubin
Amoniak
Urobilinogeny (moč)
--------------------------
Cholinesterasa (CHS)
Močovina
Albumin
0,1 - 0,8 kat/l
0,1 - 0,7 kat/l
0,1 - 0,7 kat/l
5 - 20 mol/l
5 - 50 mol/l
do 17 mol/l
--------------------
65 - 200 kat/l
3 - 8 mmol/l
35 - 53 g/l






---------



53biochemie 12_4
54biochemie 12_4
Jak odhalit alkoholika?
• Enzymy: AST, ALT, GMD, GMT ....↑, CHS ...↓
• CDT (carbohydrate-deficient transferrin, bezsacharidový transferrin)
molekula transferrinu obsahuje 4-6 sialových kys. Chronický abusus alkoholu
narušuje glykosylaci transferrinu, vzniká CDT = formy transferrinu s 0-2 sial.
kys. Zvýšená hodnota CDT = marker vydatného požívání EtOH během
uplynulých 4 týdnů (kontrola abstinence u léčených ethyliků)
• FAEE (fatty acids ethyl esters) přetrvávají v krvi až 24 hod poté, co
klesne hladina EtOH na nulu (význam u dopravních nehod)
• Ethylglukosiduronát (EtG) přetrvává až 5 dní
• Fosfatidylethanol (PEth) přetrvává až 3 týdny
55biochemie 12_4
Hladina alkoholu v krvi se vypočte z poměru
hmotnosti alkoholu (g) a celkové tělesné vody (kg)
fm
m
t
alkohol
(kg)
(g)

Charakteristika Muži Ženy
Celková tělesná voda 60 – 67 % 50 - 55 %
Celkový tělesný tuk 10 – 20 % 20 – 30 %
56
alkohol v krvi (‰) =
0,67 (muži)
0,55 (ženy)
biochemie 12_4
Jazyková poznámka: kocovina
Etymologie slova je nejasná, uvádějí se tři různé výklady
• podle mladoboleslavského hejtmana Kotze (1848)
– proti němu četné výtržnosti zvané lidově kočičiny
• z něm. Katzenjammer (kočičí bědování)
• z něm. kotzen (zvracet)
57biochemie 12_4
Biotransformace ethylenglykolu
58
oxid.
COOH
COOH
glyoxalová
kyselina
CH2OH
CH2OH
CHO
CHO
COOH
CH2OH
oxid.
CHO
CH2OH
COOH
CHO
ethylenglykol glykolaldehyd
glyoxal
glykolová kyselina
št'avelová
kyselina
oxid.
oxid.
oxid.
oxid.
Otrava ethylenglykolem může mít fatální průběh
biochemie 12_4