KAPITOLA Voda a pH Peter J. Kennelly a Vietor W. Rodwell BIOCHEMICKÝ VÝZNAM Voda je převažující chemickou složkou živých organismů. Její unikátní fyzikální vlastnosti, zahrnující schopnost solvatovat široké spektrum organických a anorganických molekul, jsou odvozeny od di-polární struktury vody a její mimořádné kapacity pro tvorbu vodíkových vazeb. Způsob, jakým voda interaguje se solvatovanými biomolekulami, ovlivňuje strukturu každé z nich. Jako výjimečný nukleon! jexvoda reaktantem nebo produktem v mnoha metabolických reakcích. Voda má slabou tendenci disociovat na hydroxylové ionty a protony. Kyselost vodných roztoků je obecně vyjadřována za použití logaritmické pH stupnice. Hydrogenuhličitany a jiné pufry normálně udržují pH extracelulární tekutiny mezi 7,35 a 7,45. Podezření na poruchy acidobazické rovnováhy jsou ověřovány měřením pH arteriální krve a obsahu C02 ve venózní krvi. Příčiny acidóz (pH krve < 7,35) zahrnují diabetické ketoacidózy a acidózy vyvolané nadbytkem kyseliny mléčné. Alkalózy (pH > 7,45) mohou být důsledkem zvracení kyselého obsahu žaludku. Regulace rovnováhy vody závisí na hypothalamovém mechanismu, který ovládá žízeň, na antidiuretickém hormonu (ADH), na retenci nebo vyměšování vody ledvinami a na ztrátách odpařením. Nefrogenní diabetes insipidus, který zahrnuje neschopnost koncentrovat moč nebo nastavit sotva patrné změny osmolarity mimobuněčné tekutiny, pramení z malé citlivosti ledvinových tubulárních osmoreceptorů na ADH. VODA JE IDEÁLNÍ BIOLOGICKÉ ROZPOUŠTĚDLO Molekuly vody tvoří dipóly Molekula vody je nepravidelný, slabě zkosený čtyřstěn s kyslíkem v jeho středu (obr. 2-1). Dva vodíky a dva volné elektronové páry zbývajících dvou sp3 hybridizovaných orbitálů kyslíku zabírají rohy čtyř- stěnu. Úhel mezi atomy vodíku (105 stupňů) se slabě liší od ideálního úhlu čtyřstěnu, který je 109,5 stupně. Amoniak má také tvar čtyřstěnu s úhly 107 stupňů mezi jeho atomy vodíku. Voda je dipól, molekula s elektrickým nábojem nesymetricky rozloženým kolem její struktury. Silně elektronegativní atom kyslíku odtahuje elektrony od vodíkových jader a zanechává je s částečným kladným nábojem, zatímco jeho dva nepárové elektrony vytvářejí oblast lokálního záporného náboje. Voda, silný dipól, má vysokou dielektrickou konstantu. Jak je popsáno kvantitativně Coulom-bovým zákonem, síla interakce F mezi opačně nabitými částicemi je nepřímo úměrná dielektrické konstantě e obklopujícího prostředí. Dielektrická konstanta pro vakuum je 1, pro hexan 1,9, pro etha-nol 24,3 a pro vodu 78,5. Voda proto silně snižuje přitažlivou sílu mezi nabitými a polárními částicemi ve srovnání s bezvodým prostředím s nižšími dielektrickými konstantami. Její silný dipól a vysoká dielektrická konstanta umožňují vodě rozpouštět velká množství iontových sloučenin, jako jsou soli. Molekuly vody tvoří vodíkové vazby Částečně nestíněná vodíková jádra kovalentně vázaná na kyslíkový nebo dusíkový atom, který odtahuje elektrony, mohou interagovat s volným elektronovým párem jiného kyslíkového nebo dusíkového atomu a tvořit vodíkovou vazbu. Protože molekuly vody mají obě tyto vlastnosti, dávají přednost tvorbě vodíkové vazby navzájem mezi sebou za vzniku uspořádaných útvarů (obr. 2-2). Vodíkové vazby hluboce ovlivňují fyzikální vlastnosti vody a jsou příčinou její mimořádně vysoké viskozity, povrchového napětí a bodu varu. V průměru každá molekula vody v kapalném stavu asociuje pomocí vodíkových vazeb se 3,5 jinými molekulami. Tyto vazby jsou nejen poměrně slabé, ale i krátkodobé, s poločasem životnosti jedné mikrosekundy a kratším. K roztržení vodíkové vazby v kapalné vodě » 8 KAPITOLA 2 Voda a pH OBR. 2-1. Molekula vody je čtyřstěn H H V H l O .H—O' P- O. OBR. 2-2. Vlevo: Asociace dvou dipolárních molekul vody pomocí vodíkové vazby (tečkovaná čára). Vpravo: shluk (klastr) čtyř molekul vody, vytvořený pomocí vodíkových vazeb. Všimněte si, že molekula vody může sloužit současně jako donor vodíku i jako akceptor vodíku. CH, — CH2 — O — rf—-O H I CH3 —CH2 —O —H ■O \ CHo CHn C=0--H— N / \ R1 R111 OBR. 2"3. Také polární skupiny se podílejí na vodíkových vazbách. Na obr. jsou ukázány vodíkové vazby vytvořené mezi ethanolem a vodou, mezi dvěma molekulami ethanolu a mezi karbonylovým kyslíkem peptidů a vodíkem aminoskupiny sousední aminokyseliny. je zapotřebí pouze asi 4,5 kcal/mol, méně než 5% energie potřebné k roztržení kovalentní O-H vazby. Vodíkové vazby umožňují vodě rozpouštět mnoho organických biomolekul, obsahujících funkční skupiny, které se mohou podílet na tvorbě vodíkových vazeb. Kyslíkové atomy aldehydů, ketonů a amidů například poskytují volné elektronové páry, které mohou sloužit jako akceptory vodíku. Alkoholy a aminy mohou sloužit jako akceptory vodíku i donory nestíněných vodíkových atomů pro tvorbu vodíkových vazeb (obr. 2-3). INTERAKCE S VODOU OVLIVŇUJE STRUKTURU BIOMOLEKUL Kovalentní a nekovalentní vazby stabilizují biologické molekuly Kovalentní vazba je největší síla, která drží molekuly pohromadě (tab. 2-1). Nekovalentní síly, přestože mají menší velikost, značně přispívají ke struktuře, stabilitě a funkční schopnosti makromolekul v živých buňkách. Tyto síly, které mohou být buď přitažlivé, nebo odpudivé, zahrnují interakce jak uvnitř biomolekuly, tak mezi ní a vodou, která tvoří hlavní složku okolního prostředí. Biomolekuly zaujímají takovou konformaci, aby jejich polární a nabité skupiny byly na jejich povrchu Většina biomolekul je amfipatická, to znamená, že mají oblasti bohaté na nabité nebo polární funkční skupiny i oblasti s hydrofobním charakterem. Proteiny mají sklon svinovat se tak, aby R-skupiny aminokyselin s hydrofobním postranním řetězcem byly uvnitř molekuly. Aminokyseliny s nabitým nebo polárním postranním řetězcem (např. arginin, glutamát, serin) jsou obecně přítomné na povrchu, v kontaktu s vodou. Podobné modely převažují ve fosfolipidových dvojvrstvách, kde nabité skupiny fosfatidylserinu nebo fosfatidylethanolaminu jsou v kontaktu s vodou, zatímco jejich hydrofobní postranní řetězce, tvořené acyly mastných kyselin, se spolu shlukují (klastrují) za vyloučení vody. Tento model maximalizuje možnost tvorby energeticky preferovaných interakcí náboj - dipól, dipól - dipól a vodíkových vazeb řnezi polárními skupinami v biomolekule a vodou. Také minimalizuje energeticky nepříznivé kontakty mezi vodou a hydrofob-ními skupinami. TAB. 2-1. Vazebné energie pro atomy biologického významu Typ vazby Energie (kcal/mol) Typ vazby Energie (kcal/mol) O-O 34 0=0 96 s-s 51 C-H 99 C-N 70 C=S 108 S-H 81 O-H 110 C-C 82 C=C 147 C-0 84 C=N 147 N-H 94 C=0 164 KAPITOLA 2 Voda a pH 9 Hydrofobní interakce Hydrofobní interakce jsou tendence nepolárních sloučenin k »samoasociaci« ve vodném prostředí. Tato »samoasociace« není řízena ani vzájemným přitahováním, ani - jak se někdy nesprávně říká -hydrofobními vazbami. »Samoasociace« minimalizuje energeticky nevýhodné interakce mezi nepolárními skupinami a vodou. Jestliže vodíky nepolárních skupin, jako jsou methylenové skupiny uhlovodíků, netvoří vodíkové vazby, musí ovlivňovat strukturu vody, která je obklopuje. Molekuly vody sousedící s hydrofobními skupinami jsou omezeny v počtu orientací (stupně volnosti), které jim dovolují zúčastnit se maximálního počtu energeticky výhodných vodíkových vazeb. Maximální tvorba násobných vodíkových vazeb může být udržována jen zvýšeným uspořádáním přiléhajících molekul vody, provázeným poklesem entropie. Z druhého zákona termodynamiky vyplývá, že optimální volná energie směsi uhlovodík - voda je funkcí jak maximální entalpie (z vodíkové vazby), tak minimální entropie (maximum stupňů volnosti). Nepolární molekuly mají tendenci tvořit kapičky, aby minimalizovaly plochu odkrytého povrchu va zmenšovaly počet ovlivněných molekul vody. Podobně ve vodném prostředí živých buněk hydrofobní části biopolymerů směřují k tomu, aby byly schovány uvnitř struktury molekuly nebo uvnitř li-pidové dvojvrstvy, čímž se zmenší kontakt s vodou. Elektrostatické interakce Interakce mezi nabitými skupinami pomáhají tvarovat strukturu biomolekul. Elektrostatické interakce mezi opačně nabitými skupinami uvnitř biomolekul nebo mezi nimi jsou nazývány solné můstky. Solné můstky jsou svou silou srovnatelné s vodíkovými vazbami, ale působí na větší vzdálenosti. Proto často usnadňují vazbu nabitých molekul a iontů k proteinům a nukleovým kyselinám. Van der Waalsovy síly Van der Waalsovy síly vznikají přitahováním mezi přechodnými dipóly tvořenými rychlým pohybem elektronů všech neutrálních atomů. Značně slabší než vodíkové vazby, ale potenciálně extrémně početné van der Waalsovy síly klesají šestkrát se vzdáleností oddělených atomů. Proto působí jen na velmi malé vzdálenosti, typicky 2-4 A. Násobné síly stabilizují biomolekuly Dvojitá šroubovice DNA ilustruje příspěvek násobných sil ke struktuře biomolekul. Zatímco každé jednotlivé vlákno DNA je drženo pohromadě ko-valentními vazbami, dvě vlákna šroubovice jsou držena pohromadě výhradně nekovalentními interakcemi. Tyto nekovalentní interakce zahrnují vodíkové vazby mezi nukleotidovými bázemi (Wat-sonovo-Crickovo párování bází) a van der Waalsovy interakce mezi nahromaděnými purinovými a pyrimidinovými bázemi. Šroubovice stáčí nabité fosfátové skupiny a polární sacharidy (ribosu a de-oxyribosu), tvořící páteř DNA, k vodě, zatímco relativně hydrofobní nukleotidové báze jsou schovány uvnitř. Rozvolněná páteř maximalizuje vzdálenosti mezi negativně nabitými fosfáty a tak minimalizuje nepříznivé elektrostatické interakce. VODA JE VÝBORNÝ NUKLEOFIL Metabolické reakce často zahrnují atakvolných elektronových párů, které jsou v elektronově bohatých molekulách, nazývaných nukleofily, na elektronově chudé atomy - elektrofily. Nukleofily a elektrofily nemusí mít bezpodmínečně formální záporný nebo kladný náboj. Voda, jejíž dva volné elektronové páry sp3 elektronů nesou částečný záporný náboj, je výborný nukleofil. Jiné nukleofily biologického významu obsahují kyslíkové atomy fosfátů, alkoholů a karboxylových kyselin; síru thiolů; dusík aminů a imidazolový kruh histidinu. Běžné elektrofily obsahují karbonylový uhlík v amidech, esterech, aldehydech a ketonech a fosforové atomy fosfoesterů. Důsledkem nukleofilního ataku vody je obecně štěpení amidových, glykosidových nebo esterových vazeb, které drží biopolymery pohromadě. Tento proces se nazývá hydrolýza. Opačně, jsou-li mo-nomerní jednotky spojovány navzájem za vzniku biopolymerů, jako jsou proteiny nebo glykogen, je voda produktem, např. během tvorby peptidové vazby mezi dvěma aminokyselinami: o valin 10 KAPITOLA 2 Voda a pH Zatímco hydrolýza je termodynamicky upřednostňovanou reakcí, amidové a fosfoesterové vazby polypeptidů a oligonukleotidů jsou stálé ve vodném prostředí buněk. Toto zdánlivě paradoxní chování odráží skutečnost, že termodynamické ovládání rovnováhy reakce neurčuje, jakou rychlostí bude probíhat. Je-li to zapotřebí, proteinové katalyzátory, enzymy, zvětšují rychlost hydrolytických reakcí v buňkách. Proteasy katalyzují hydrolýzu proteinů na jejich složky aminokyseliny, zatímco nukleasy katalyzují hydrolýzu fosfoesterových vazeb v DNA a RNA. Aktivitu těchto enzymů je třeba citlivě ovládat, aby bylo zajištěno, že působí na vhodné cílené molekuly ve vhodnou dobu. Mnohé metabolické reakce zahrnují přesun skupin Mnoho enzymových reakcí zodpovědných za syntézu a štěpení biomolekul zahrnuje přesun chemické skupiny G z donoru D na akceptor A za vzniku komplexu mezi akceptorem a přenášenou skupinou A-G: D-G + A <=± A-G + D Hydrolýza a fosforolýza glykogenu např. zahrnuje přesun glukosylových skupin na vodu nebo na fosfáty. Rovnovážná konstanta pro hydrolýzu kovalentních vazeb silně podporuje vznik štěpných produktů. Naopak v mnoha případech reakce s přesunem skupiny, které vedou k biosyntéze makromolekul, zahrnují termodynamicky nevýhodnou tvorbu kovalentních vazeb. Enzymy překonávají tuto bariéru spřažením těchto reakcí s reakcemi termodynamicky výhodnými, takže celková změna volné energie podporuje syntézu biopolymeru. Je nukleofilní charakter vody a její vysoká koncentrace v buňkách příčinou toho, že biopolymery, jako proteiny a DNA, jsou poměrně stálé? A jak může docházet k syntéze biopolymeru ve vodném prostředí? Odpovědí na obě otázky jsou vlastnosti enzymů. Kdyby neexistovala enzymová katalýza, ani reakce termodynamicky vysoce zvýhodněné by nemusely probíhat rychle. Přesné a diferencované ovládání aktivity enzymů a jejich lokalizace ve speciálních organelách určují, za jakých fyziologických podmínek bude biopolymer syntetizován nebo degradován. Nově syntetizované biopolymery nejsou bezprostředně hydrolyzovány, zčásti proto, že aktivní centra biosyntetických enzymů udržují substráty v prostředí, ze kterého může být vyloučena voda. Molekuly vody vykazují slabou, ale důležitou tendenci kdisociaci Schopnost vody ionizovat, i když slabě, má ústřední význam pro život. Jelikož voda může působit jako kyselina i jako báze, může být její ionizace znázorněna jako intermolekulární přesun protonu za tvorby hydroniového iontu (H30+) a hydroxylo-vého iontu (OH): H20 + H20 ?=ž H30+ + OH" Přesunutý proton je ve skutečnosti asociován se shlukem (klastrem) molekul vody. Proton neexistuje v roztoku jen jako H30+ , ale také jako multi-mery H502+ a H703+. Proton je přesto běžně uváděn jako H+ , i když je ve skutečnosti silně hydratován. Protože hydroniové a hydroxylové ionty jsou kontinuálně rekombinovány za tvorby molekul vody, nemůžeme říci, že individuální vodík nebo kyslík je přítomen jako ion, nebo jako součást molekuly vody. V jednom okamžiku je jako ion a v dalším jako součást molekuly vody. Nejsou tedy uvažovány jednotlivé ionty nebo molekuly. Namísto toho hovoříme o pravděpodobnosti, ie v jistém okamžiku je vodík přítomen jako ion, nebo jako část molekuly vody. Protože 1 g vody obsahuje 3,46 • 1022 molekul, může být ionizace vody popsána statisticky. Prohlásit, že pravděpodobnost, že vodík existuje jako ion, je 0,01, znamená, že v daném časovém okamžiku je jedna možnost ze sta, že existuje jako ion, a 99 možností ze sta, že je součástí molekuly vody. Skutečná pravděpodobnost, že vodíkový atom existuje v čisté vodě jako vodíkový ion, je asi 1,8 • 10~9. Pravděpodobnost, že je součástí molekuly vody, je tak téměř jednotka. Vyjádřeno jiným způsobem, na každý vodíkový a hydroxylový ion v čisté vodě připadá 1,8 bilionu nebo 1,8 • 109 molekul vody. Přesto vodíkové a hydroxylové ionty přispívají značně k vlastnostem vody. Pro disociaci vody platí vztah K [H+][°H1 [H20] Závorky reprezentují molární koncentrace (přesně řečeno molární aktivity) a K je disociační konstanta. Protože hmotnost 1 molu (mol) vody je 18g, 1 litr (lOOOg) vody obsahuje 1000 : 18 = 55,56 molu. Čistá voda je tak 55,56molární. Protože pravděpodobnost, že vodík v čisté vodě bude existovat jako vodíkový ion, je 1,8 • 10~9, bude molární koncentrace [H+] iontů (nebo [OH-] iontů) v čisté vodě výsled- KAPITOLA 2 Voda a pH 11 kem součinu pravděpodobnosti 1,8 • 10 9 a molární koncentrace vody 55,56 mol/l, což je 1,0 • 10~7 mol/l. Nyní můžeme spočítat K pro čistou vodu: K [H1[QH1 Kí10"7] [H20] [55,56] = 0,018 ■ 10H4 =1,8 10"16mol/l Molární koncentrace vody 55,56 mol/l je příliš vysoká, aby byla významnou měrou ovlivňována disociací. Je tudíž považována v podstatě za konstantní. Tato konstanta může proto být včleněna do disociační konstanty K a poskytnout novou užitečnou konstantu Kw , nazývanou iontový součin vody. Vztah mezi K„ a K je ukázán níže: rH+¥oi-rl K = L rJL . J = 1,8 ■ 10-16mol/l [H20] Kw = (K)[Hfi] = [H+][OH-] = (l,8 • 10-16 mol/l )(55,56 mol/l) = 1,00 • 10-14 (mol/l )2 Všimněme si, že rozměry K jsou moly na litr a rozměry Kw jsou moly2 na litr2. Jak název naznačuje, iontový součin K„ je číselně shodný se součinem molárních koncentrací H+ aOH": K„ = [H+][OH-] Při 25 °C Kw = (10~7)2, nebo 10"14 (mol/l)2. Při teplotách pod 25 °C je Kv o málo menší než 10"14 a při teplotách nad 25 °C je o málo větší než 10~14. Uvnitř stanovených limitů vlivu teploty je Kw rovno 10~14 (mol/l)2 pro všechny vodné roztoky, tedy i pro roztoky kyselin a zásad. Kw používáme k výpočtu pH kyselých i bazických roztoků. pH JE ZÁPORNÝ LOGARITMUS KONCENTRACE VODÍKOVÝCH IONTŮ Termín pH byl zaveden v roce 1909 Sôrensenem, který definoval pH jako záporný log koncentrace vodíkových iontů: pH = -log [H+] Tato definice, i když není zcela přesná, postačuje k mnoha biochemickým účelům. Výpočet pH roztoku se provádí následovně: 1. Vypočte se koncentrace vodíkových iontů [H+] . 2. Vypočte se základ dekadického logaritmu [H+]. 3. pH je záporná hodnota čísla vypočteného v bodě 2. Např. pro čistou vodu při 25 °C, pH = -log [H+] = -log 10"7 = -(-7) = 7,0 Tato hodnota je také známa jako power (anglicky), puissant (fracouzsky) nebo potennz (německy) exponentu, proto se pro ni používá písmeno p. Nízké hodnoty pH odpovídají vysokým koncentracím H+ a vysoké hodnoty pH odpovídají nízkým koncentracím H+. Kyseliny jsou donory protonů a báze akceptory protonů. Silné kyseliny (jako HC1, H2S04) kompletně disociují na anionty a kationty i v silně kyselých roztocích (o nízkém pH). Slabé kyseliny disociují jen zčásti v kyselých roztocích. Podobně silné báze (jako NaOH, KOH) - ale ne slabé báze (jako Ca[OH]2) - jsou kompletně disociovány při vysokých pH. Mnohé biochemikálie jsou slabé kyseliny. Výjimky zahrnují fosforylované intermediáty, jejichž fosforylová skupina obsahuje dva disociova-telné protony, z nichž první je silně kyselý. Následující příklady ukazují, jak se počítá pH kyselých a bazických roztoků. Příklad 1: Jaké je pH roztoku, jehož koncentrace vodíkových iontů je 3,2 • 104 mol/l? pH - -log [H+J =-log (3,2- 10"4) = -log (3,2)-log (lO-4) = -0,5 + 4,0 = 3,5 Příklad 2: Jaké je pH roztoku, jehož koncentrace hydroxylových iontů je 4,0 • 104 mol/l? Nejprve definujeme hodnotu pOH, která je rovna - log [OH-] a může být odvozena z definice K„ = [H+][OH-] = 10-14 Tudíž log[H+] + log[OH"] = Iog10 M nebo ■ pH + pOH = 14 12 KAPITOLA 2 Voda a pH Řešení problému jiným postupem: [OH" J = 4,0 • 1(T4 pOH = -log [OH] - -log (4,0 ■ 10"4) = -log (4,0)- log (10~4) = -0,60 + 4,0 = 3,4 Nyní pH = 14-pOH = 14-3,4 = 10,6 Uvedené příklady ilustrují, jak logaritmická pH stupnice usnadňuje podávání informací a porovnávání koncentrací vodíkových iontů, které se vzájemně řádově liší, to je 0,00032 M (pH 3,5) a 0,000000000025 M (pH 10,6). Příklad 3: Jaká je hodnota pH (a) 2,0 • 10"2 mol/l KOH a (b) 2,0 x 10"6 mol/l KOH? OH" pocházejí ze dvou zdrojů, KOH a vody Protože pH je stanovováno z celkové [H+] (a pOH z celkové [OH-]), musí být uvažovány oba zdroje. V prvním případě (a) je příspěvek vody k celkové [OH-] zanedbatelný. To ale nemůže být řečeno pro druhý příklad (b): Koncentrace (mol/l) (a) (b) Molarita KOH 2,0-10"2 2,0 • 10"6 [OHI z KOH 2,0 • 1CT2 2,0-106 [OH-] z vody 1,0-10 ' 1,0-10- Celková [OHI 2,00001 • 10"2 2,1 • 10"6 pH může být vypočteno, jak je uvedeno výše. Uvedené příklady předpokládají, že silná báze KOH je v roztoku kompletně disociována, a že koncentrace OH" byla tudíž rovna koncentraci KOH plus koncentraci OH" původně přítomných ve vodě. Tento předpoklad je správný pro zředěné roztoky silných bází nebo kyselin, ale ne pro slabé báze nebo kyseliny. Protože slabé elektrolyty diso-ciují v roztocích jen slabě, musíme k výpočtu pH roztoků slabých kyselin nebo bází použít disociační konstantu. Ta nám umožní vypočítat hodnoty [H+] (nebo [OH"]) pro danou molaritu slabé kyseliny (nebo báze) a z ní následně pH. Funkční skupiny, které jsou slabými kyselinami, mají velký fyziologický význam Mnoho biochemikálií má funkční skupiny, které jsou slabými kyselinami nebo bázemi. Karboxylové skupiny, aminoskupiny a estery kyseliny fosforečné, jejichž disociace do druhého stupně klesá v rozmezí fyziologických koncentrací, jsou přítomny v proteinech a nukleových kyselinách, ve většině koenzymů a většině intermediárních metabolitů. Znalost disociace slabých kyselin a bází je tak základem k porozumění vlivu intracelulárního pH na strukturu a biologickou aktivitu. Separace, založené na pohybu nabitých částic, jako je elektroforéza a iontově výměnná chromatografie, jsou také dobře pochopitelné v pojmech disociačního chování funkčních skupin. Protonované částice (jako HA nebo R-NH3+) nazýváme kyseliny a neprotonované částice (jako A" nebo R-NH2) jejich konjugované báze. Podobně můžeme mluvit o bázích (jako A" nebo R-NH2) a jejich konjugovaných kyselinách (jako HA nebo R-NH3+). Dále jsou uvedeny reprezentativní slabé kyseliny (vlevo), jejich konjugované báze (uprostřed) a pKa hodnoty (vpravo): R—CH2—COOH R—CH2—COQT p/C„ =4-5 R—CH2—NH,+ R—CH2R—NH2 2 pKo=9-10 H2C03 HC03" 3 pKa = 6,4 H2PCV HP04"2 H pKa = 7,2 Relativní sílu slabých kyselin a zásad vyjadřujeme v pojmech jejich disociačních konstant. Níže jsou uvedeny výrazy pro disociační konstanty (KJ pro dva reprezentanty slabých kyselin, R-COOH a R-NH3+. R—COOH zri R—COO + H+ [R—COOH] R—NH3+ <=z R—NH2 + H+ K _ [R~NH2][H+] [r_NH3+] Protože číselné hodnoty Ka pro slabé kyseliny jsou záporná exponenciální čísla, vyjadřujeme K3 jako píQ, kde pK, =-\ogKa Všimněme si, že pJCa má stejný vztah ke Ka jako pH k [H+]. Čím silnější kyselina, tím nižší je piC, hodnota. prQ je používána k vyjádření relativní síly jak kyselin, tak zásad. Pro jakoukoliv slabou kyselinu je jejím konjugátem silná báze. Podobně je konju-gátem silné báze slabá kyselina. Relativní síly bází jsou vyjadřovány pomocí pKa jejich konjugovaných KAPITOLA 2 Voda a pH 13 kyselin. Pro vícesytné sloučeniny, obsahující více než jeden disociovatelný proton, je číselný subskript přiřazován ke každé disociaci v pořadí relativních acidit. Pro disociaci typu R—NH; -> R—NH2 + H+ pKa odpovídá pH, při kterém je koncentrace kyseliny R-NH3+ rovná koncentraci báze R-NH2. Z výše uvedených rovnic, uvádějících vztah mezi Ka a [H+] a koncentracemi nedisociovaných kyselin a jejich konjugovaných bází vyplývá: když [R—COO"] = [R—COOH] nebo když pak [R—NH2] = [R—NH3+] ^a=[H+] Když asociované (protonované) a disociované (kon-jugované báze) částice jsou přítomné ve stejných koncentracích, převažující koncentrace vodíkových iontů [H+] je číselně rovna disociační konstantě Ka. Zlogaritmujeme-li obě strany rovnice uvedené výše a vynásobíme je -1, dostaneme tyto výrazy: K, = [H+] -logKa = -log[H+] Protože -log/C, je definovaný jako pKa a -log [H+] definuje pH, může být rovnice přepsána jako p/Ca = pH To znamená, že pKa kyselé skupiny je pH, při kterém protonované a neprotonované částice jsou přítomné ve stejných koncentracích. píCa pro kyselinu může být stanovena přidáním 0,5 ekvivalentu alkalického hydroxidu na ekvivalent kyseliny. Výsledné pH bude stejné jako pKa kyseliny. Hendersonova-Hasselbalchova rovnice popisuje chování slabých kyselin a pufrů Hendersonova-Hasselbalchova rovnice je odvozena níže. Slabá kyselina HA ionizuje takto: Rovnovážná konstanta pro tuto disociaci je K ffi a" [HA] Křížovým vynásobením dostaneme [rf][A-] = Ka[HA] Vydělíme obě strany rovnice [ A~]: r [HAl [H+] = /Ca Zlogaritmujeme obě strany rovnice [HAf log[H+] = log I'M. = log Ka + log [HA] [A] Vynásobíme obě strany rovnice -1: -log[H+] = -log/Ca-log [HA] Nahradíme pH a pK, -log [H+] a -log Ka, pak: [HA] pH = pKa - log [AI Inverzí posledního výrazu odstraníme znaménko minus a dostaneme Hendersonovu-Hassel-balchovu rovnici: pH = přCa + log M [HA] HA H+ + A" Hendersonova-Hasselbalchova rovnice má vysokou predpovední hodnotu v protonové rovnováze. Např. 1. Je-li kyselina přesně z poloviny zneutralizo-vána, [A-] = [HA]. Za těchto podmínek [A"] i pH = p/ía + log = pKa + log - = p/Ca + 0 [HA] a 1 a Tedy v polovině neutralizace pH = pKa. 2. Je-li poměr [A]/[HA] = 100 : 1, ■ 14 KAPITOLA 2 Voda a pH PH = p/(a + log — pH = pKi + log 100/1 = pKa + 2 3. Je-li poměr [A"]/[HA] = 1 : 10, pH - pKt + log 1/1 0 = pK, + (-1) Je-li rovnice vypočítána při poměru [A~]/[HA] pohybujícím se od 103 do 10~3 a vypočtené hodnoty pH jsou vyneseny do grafu, pak graf popisuje tit-rační křivku pro slabou kyselinu (obr. 2-4). P - 1.0 - 1.0 io hydrox ít kyselin; 0.8 - 0.8 Jickéf ivaler 0.6 - 0.6 náboj alke liekv 0.4 0.4 ;vivalent lý na m 0.2 0.2 milieh přidai 0 I 1 1 ■ i i i 0 2 3 4 5 6 7 8 pH 1 OBR. 2_4. Titrační křivka pro kyselinu typu HA. Bod uprostřed křivky označuje pKa 5,0. Roztoky slabých kyselin a jejich solí pufrují změny pH Roztoky slabých kyselin nebo bází a jejich konju-gáty mají schopnost pufrovat, tj. odolávat změnám pH při přídavku silné kyseliny nebo báze. Protože mnohé metabolické reakce jsou provázeny uvolněním nebo spotřebou protonů, jsou některé z nich uvnitř buňky pufrovány. Oxidační metabolismus produkuje C02, anhydrid kyseliny uhličité, která i v případě, že by nebyla pufrována, mohla by způsobovat silné acidózy. Udržování konstantního pH zahrnuje pufrování fosfáty, hydrogenuhličitany a proteiny, které přijímají nebo uvolňují protony a brání tak změnám pH. Při pokusech za použití tkáňových extraktů nebo enzymů je konstantní pH udržováno přídavkem pufrů, jako je MES ([2-N-morfolino] ethansulfonová kyselina, pKa 6,1), anorganický fosfát (pJ<:a2 7,2), HEPES (N-hydroxyethylpiperazin-JV'-2-ethansulfonová kyselina, pKa 6,8) nebo Tris (tris[hydroxymethyl]aminomethan, pKí 8,3). Hodnota pKa vztažená k požadovanému pH je hlavní charakteristikou pro výběr pufru. Pufrování může být sledováno pH metrem při titraci slabé kyseliny nebo báze (obr. 2-4). Můžeme také vypočítat posun pH, provázející přídavek kyseliny nebo báze k pufrovanému roztoku. V uvede- ném příkladu má pufrovaný roztok (slabá kyselina, piCa = 5,0, a její konjugovaná báze) na počátku jednu ze čtyř hodnot pH. Vypočítáme posun pH, který nastane, když k 0,1 miliekvivalentu KOH je přidán 1 miliekvivalent každého roztoku: Počáteční pH 5,00 5,37 5,60 5,86 LA 3 počáteční 0,50 0,70 0,80 0,88 [HA]poíáleíní 0,50 0,30 0,20 0,12 ([A1/[HA])poíáte,„, 1,00 2,33 4,00 7,33 Přídavek 0,1 miliekvivalentu KOH způsobí [A ]konečná 0,60 0,80 0,90 0,98 [HA]koneĚná 0,40 0,20 0,10 0,02 ([A-]/[HA])konefný 1,50 4,00 9,00 49,0 log ([A1/[HA])kone£ný 0,18 0,60 0,95 1,69 konečné pH 5,18 5,60 5,95 6,69 ApH 0,18 0,60 0,95 1,69 Všimněme si, že změna pH na miliekvivalent přidaného OH" závisí na počátečním pH. Roztok odolává změnám pH nejúčinněji při hodnotách pH blízkých pKr Roztok slabé kyseliny a její konjugované báze pufrují nejúčinněji v rozmezí pH, pK, ± 1,0 jednotky pH. Obr. 2-4 také ilustruje čistý náboj na jedné molekule kyseliny jako funkci pH. Frakční náboj -0,5 neznamená, že jednotlivá molekula nese frakční náboj, ale že pravděpodobnost, že daná molekula má jednotkový záporný náboj v kterémkoliv časovém okamžiku, je 0,5. Úvaha o čistém náboji na makromolekulách jako funkci pH poskytuje základ pro separační techniky, jako je iontově výměnná chro-matografie nebo elektroforéza. Síla kyseliny závisí na struktuře molekuly Mnoho biologicky zajímavých kyselin má více než jednu disociující skupinu. Přítomnost záporného náboje v sousedství brání ztrátě protonu z blízké skupiny a tím zvyšuje její pKr To je patrné z pK3 hodnot pro tři disociující skupiny kyseliny fosforečné a citrónové (tab. 2-2). Vliv sousedního náboje klesá se vzdáleností. Druhá prCa pro kyselinu jantarovou, která má dvě methylenové skupiny mezi svými karboxylovými skupinami, je 5,6, zatímco pK, pro kyselinu glutarovou, která má ještě jednu methylenovou skupinu navíc, je 5,4. Hodnoty pKa závisí na vlastnostech prostředí pŕQ funkční skupiny je také silně ovlivňováno okolním prostředím. Prostředí může pK, bud zvyšovat, nebo snižovat v závislosti na tom, je-li nedisocio- KAPITOLA 2 Voda a pH 15 TAB. 2~2. Relativní síly vybraných kyselin biologického významu1 Kyseliny s jedním protonem mravenčí pK 3,75 mléčná pK 3,86 octová pK 4,76 amoniový ion pK 9,25 Kyseliny se dvěma protony uhličitá přf, 6,37 pK2 10,25 jantarová pK, 4,21 pK2 5,64 glutarová pK, 4,34 pK2 5,41 Kyseliny se třemi protony fosforečná p/f, 2,15 pK2 6,82 PK, 12,38 citrónová pK, 3,08 pK2 4,74 pK, 5,40 Poznámka: Hodnoty uvedené v tabulce jsou hodnoty pKa (-log disociačrtí konstanty) vybraných kyselin s jedním, dvěma a třemi protony. vaná kyselina nebo její konjugovaná báze nabitou částicí. Vliv dielektrické konstanty na píCa může být pozorován po přídavku ethanolu do vody. pKa karboxylové kyseliny vzrůstá, zatímco piC, aminu klesá, protože ethanol snižuje schopnost vody solvatovat nabité částice. Hodnoty pK^ disociujících skupin uvnitř proteinů jsou hluboce ovlivňovány jejich lokálním prostředím, včetně přítomnosti nebo nepřítomnosti vody. SOUHRN ■ Voda tvoří pomocí vodíkových vazeb shluky (klastry) se svými molekulami nebo s jinými donory či akceptory protonů. Vodíkové vazby jsou odpovědné za povrchové napětí, viskozitu, kapalný stav při pokojové teplotě a rozpouštěcí sílu vody. ■ Sloučeniny, které obsahuji O, N nebo S, mohou sloužit jako donory nebo akceptory vodíkových vazeb. H Makromolekuly mění vodíkové vazby na vnitřním povrchu za vodíkové vazby s vodou. Entropické sily způsobují, že makromolekuly nastavují polární oblasti směrem k vodnému rozhraní a skrývají nepolární oblasti. ■ Solné můstky, hydrofobní interakce a van der Waalsovy síly se podílejí na tvorbě molekulární struktury. ■ pH je záporný log [H+]. Nízké pH charakterizuje kyselé roztoky a vysoké pH označuje bazické roztoky. ■ Síla slabých kyselin je vyjadřována pomocí pJC,, záporného log disociační konstanty kyseliny. Silné kyseliny mají nízké hodnoty pK, a slabé kyseliny vysoké hodnoty pKľ ■ Pufry brání změně pH při vzniku nebo spotřebě protonů. Maximální pufrační kapacita je ± 1 pH jednotka na obě strany od pKľ Mezi fyziologické pufry patří hydrogenuhličitany, fosfáty a proteiny. LITERATURA Reese KM: Whence came the symbol pH. Chem & Eng News 2004;82:64. Segel IM: Biochemical Calculations. Wiley, 1968. Stillinger FH: Water revisited. Science 1980;209:451. Suresh SJ, Naik VM: Hydrogen bond thermodynamic properties of water from dielectric constant data. J Chem Phys 2000;113:9727. Wiggins PM: Role of water in some biological processes. Microbiol Rev 1990;54:432.