1
Biochemie
2. Aminokyseliny
a peptidy,
proteiny
biochemie_2_1
2
Aminokyseliny a proteiny
2.1) Aminokyseliny
- Třídy aminokyselin
- Modifikované AMK v proteinech
- AMK stereoizomery
- Titrace AMK
- Reakce AMK
2.2) Peptidy
2.3) Struktura proteinů
- Struktura proteinů
- Vláknité proteiny
- Globularní proteiny
biochemie_2_1
Aminokyseliny
 substituční deriváty karboxylových kyselin které obsahují
skupinu –COOH a –NH2
 ze živých organismů bylo izolováno několik set AMK
 nejdůležitějších je 20, ze kterých jsou zbudovány bílkoviny –
kódované AMK
 jako kódované se označují proto, že informace o jejich zařazení do bílkovin
je uložena v nukleových kyselinách prostřednictvím genetického kódu
 tzn. že pro každou aminokyselinu existuje konkrétní kód nebo kódy tvořené
třemi po sobě jdoucími nukleotidy  viz nukleové kyseliny
 většina přírodních aminokyselin jsou α-aminokyseliny, mají
proto stejný základní skelet
 složení:
-COOH …kyselá složka: COOH → COO- + H+
-NH2 …zásaditá složka: | NH2 + H+ → NH3
+
NH2
R CH COOH

biochemie_2_1 3
Aminokyseliny
 stavební jednotky bílkovin
 deriváty karboxylových kyseliny
 liší se postranním řetězcem (R)
postranní řetězec
aminoskupina
karboxylová skupina
C
C
R
NH2
OOH
H

biochemie_2_1 4
Prostorové uspořádání
 α-aminokyseliny = NH2 skupina na 2. C (Cα)
 Cα je chirální → enantiomery D a L
C
C
CH2 OH
OH
OH
H

D-glyceraldehyd L-glyceraldehyd L-aminokyselina
C
C
CH2 OH
OH
OH
H

C
C
R
NH2
OOH
H

biochemie_2_1 5
Glycin
NH2CH2COOH nemá chirální uhlík (nejjednodušší AK)
většina aminokyselin
v přírodě: α,L-AK
biochemie_2_1 6
Stereochemie aminokyselin
Chirální molekuly existují ve dvou formách
http://www.imb-jena.de/~rake/Bioinformatics_WEB/gifs/amino_acids_chiral.gifbiochemie_2_1 7
Dva stereoisomery alaninu
-uhlík je chirálním centrem
Dva stereoisomery se nazývají
enantiomery.
Tmavě vyznačené vazby jsou
projectovány v rovině plátna a
šrafované dozadu a dopředu.
Horizontální vazby jsou
projectovány v rovině plátna a
vertikální dozadu a dopředu.
biochemie_2_1 8
L-alanin D-alanin
Proč je většina aminokyselin v přírodě právě v kofiguraci L a ne D nevíme..
biochemie_2_1 9
Optická aktivita aminokyselin
Aminokyseliny rozpuštěné ve vodě při pH 7.0 stáčejí rovinu
polarisovaného světla.
(+) alanin, isoleucin, arginin, k. glutamová, kyselina
asparagová, kyselina glutamová, lysin, valin.
(-) tryptofan, leucin, fenylalanin.
Optická otáčivost se mění při změně pH.
biochemie_2_1 10
Kódované aminokyseliny
 základní stavební jednotky bílkovin
 mají svoji specifickou tRNA
 existuje 21 kódovaných aminokyselin
 některé si organismus neumí sám vytvořit a musí je
přijímat v potravě - esenciální
 liší se svými postranními řetězci (-R)
V roce 1986 objevena 21. kódovaná aminokyselina
selenocystein.
Selenocystein se váže na speciální tRNA, která nese antikodon
UCA. Tento antikodon rozeznává UGA kodon na mRNA, což je za
normálních okolností stopkodon – žádná aminokyselina by se
v tomto případě neměla zařadit a prodlužování proteinu by se mělo
zastavit. To, že se zařadí aminokyselina selenocystein, je
způsobeno sekvencí v bezprostředním okolí kodonu UGA.
Selenocystein se vyskytuje např. v selenoproteinech
formiátdehydrogenázách.[1]
biochemie_2_1 11
Selenocystein
C
C
CH2
OO
-
HNH3
+
SeH
 v selenoproteinech – enzymy, kde Se je redukčním
centrem (redukují volné kyslíkové radikály)
 v deiodinasach – regulují působení thyroidních
hormonů
C
C
CH2
OO
-
HNH3
+
SHselenocystein
(Sec) cystein (Cys)
C
C
CH2
NH3
+
OO
-
H
OH
serin (Ser)
biochemie_2_1 12
13
Aminokyseliny
 Standardní AMK ( v proteinech, 21), proteinogenní
 Nestandardní AMK (modifikované po začlenení do polypeptidu)
Obecná struktura
L- a- aminokyselina
prolin
α-iminokyselina
http://awaremed.com/addictioneducation/wp-
content/uploads/2014/07/amino-acid-structure.jpg
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thu
mb/9/92/Beta_alanine_comparison.svg/317px-
Beta_alanine_comparison.svg.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thu
mb/d/d7/L-proline-skeletal.png/995px-L-proline-
skeletal.png
biochemie_2_1
biochemie_2_1 14
Postranní řetězce aminokyselin C
C
OO
-
HNH3
+
CH2
CH2
CH2
CH2
NH3
+
C
C
CH
OO
-
HNH3
+
CH3 CH3
C
OO
-
NH2
+
C
C
CH2
OO
-
HNH3
+ C
C
CH2
OO
-
HNH3
+
OH
C
C
CH2
OO
-
HNH3
+
SH
hydrofobní
postranní
řetězce
polární postranní řetězce
kyselý
postranní
řetězec
zásaditý
postranní
řetězec
C
C
CH2
OO
-
HNH3
+
C
OO
-
C
C
CH2
OO
-
HNH3
+
ONH2
biochemie_2_1 15
K čemu slouží aminokyseliny v
organismech?
 dodávají a přenášejí N (esenciální prvek)
 jsou základní stavební jednotkou proteinů
 v případě hladovění mohou být alternativními
zdroji energie a prekurzory pro tvorbu sacharidů
 slouží jako neurotransmitery a hormony– některé
samy o sobě, jiné jako výchozí látky pro jejich
tvorbu
 podílejí se na syntéze lipidové dvojvrstvy,
nukleotidů, alkaloidů atd..
 a mají mnoho dalších funkcí
biochemie_2_1 16
17
Označení aminokyselin
http://patentimages.storage.goog
leapis.com/WO2004022747A1/i
mgf000026_0001.png
biochemie_2_1
C
C
R
OO
-
NH3
+
H
C
C
R
O
NH2
H
O
C
C
R
OOH
NH3
+
H
H+
OHElektrický
náboj aminokyselin
kation anionamfion
neutrální pH
(fyziologicé)nízké pH vysoké pH
aminokyselina je elektroneutrální
Aminokyseliny mohou mít pozitivní, negativní nebo žádný náboj
biochemie_2_1 18
19
Titrace aminokyselin
 Aminokyseliny mohou mít pozitivní, negativní nebo žádný náboj
 -COOH a -NH3 slabě kyselé skupiny existují v roztoku v iontové
rovnováze:
amfoterní
zwitterion (neutralní,
fyziologické pH)
- Úplná disociace COOH a NH2 skupin za fyziologického pH
http://cdn1.askiitian
s.com/Images/2014
728-179154-5129-
zwitterion.png
biochemie_2_1
Isoelektrický bod
 pI
 pI = pH, kdy je celkový elektrický náboj
aminokyseliny nulový (amfion), pro každou
aminokyselinu jiné
C
C
R
OO
-
NH3
+
H
biochemie_2_1 20
Jednoduchá monoamino monokarboxylová aminokyselina
je diprotická kyselina (poskytuje
proton) když je plně protonizovaná.
biochemie_2_1 21
Aminokyselina má characteristickou titračná křivku
Plně protonizovaná
forma je při
nejnižším pH
Při pH, kdy pK1 = 2.34 je
přítomná ekvimolární
koncentrace donoru protonu a
akceptoru protonu.
+
Dipolární iont
+
Při pH, kdy pK = 9.60 je
přítomná ekvimolární
koncentrace donoru protonu a
akceptoru protonu.
donor
protonu
akceptor
protonu
donor
protonu
akceptor
protonu
Izoelektrický bod
biochemie_2_1 22
protonizovaná forma neprotonizovaná forma (konjugovaná báze)
HA H+ A-+
Ka
[HA]
[H+] [A-]
=
= Ka x
[A-]
[HA]
[H+]
- log[H+]-log Ka-log
[A-]
[HA]
=
pH = pKa log
[A-]
[HA]+
Henderson/Hasselbachova rovnice a pKa
biochemie_2_1 23
Acidobazické vlastnosti
• pH při, kterém je výsledný náboj nulový se
nazývá izoelektrický bod pI
• je charakteristický pro každou AMK
• má vliv na fyzikální i chemické vlastnosti AMK
pI = (pK1 + pK2 )/2
(pK1 + pK2 = disociační konstanty), graf !!!
• pI: neutrální AMK = 4,8 – 6,3
zásadité AMK = 7,6 – 10,8
kyselé AMK = 2,7 – 3,2
• tato vlastnost se často využívá při separaci a identifikaci
aminokyselin (elektroforéza – izoelektrická fokusace)
biochemie_2_1 24
Aminokyseliny se obecně dělí na skupiny
podle polarity postranních řetězců
Východiskem pro dělení aminokyselin je to, že
mají:
 nepolární postranní řetězec
 polární postranní řetězec
 polární nabitým postranní řetězcem
Klasifikace aminokyselin
biochemie_2_1 25
26http://www.personal.psu.edu/staff
/m/b/mbt102/bisci4online/chemist
ry/charges.gif
biochemie_2_1
Nepolární aminokyseliny
Nepolární aminokyseliny mají ve svém
postranním řetězci pouze uhlík a vodík,
obecně nejsou reaktivní. Fakt, že jsou
hydrofóbní, je předurčuje k tomu, aby
pomáhaly proteinům uspořádávat se do 3-D
struktury
biochemie_2_1 27
Glycin (Gly)
Alanin (Ala)
Valin (Val)
Leucin (Leu)
Isoleucin (Ile)
Nonpolární (hydrofóbní) postranní řetězce R
Prolin (Pro)
Tryptofan (Trp)
Fenylalanin (Phe)
Methionin (Met)
http://www.indstate.edu/thcme/mwking/amino-acids.html
biochemie_2_1 28
Alanin, valin, leucin a isoleucin mají saturovaný
postranní řetězec s vodíkem a uhlíkem, leucin a
isoleucin jsou isomery.
Glycin – postranní řetězec tvoří pouze vodík
Alanin Valin
Leucin Isoleucin
biochemie_2_1 29
Methionin má v postranním řetězci síru.
Fenylalanin je alanin s benzenovým jádrem. Je velice
hydrofóbní a vyskytuje se v globulárních proteinech.
Methionin Fenylalanin
biochemie_2_1 30
Tryptofan je strukturně podobný alaninu, s indolovou
skupinou namísto aromatického kruhu fenylalaninu.
Je hydrofóbní a také pomáhá sbalovat globulární
proteiny.
Prolin je iminokyselina. Mezi aminokyselinami je
výjimečný, postranní řetězec se stáčí do kruhu a
váže se na kostru aminokyseliny. Je málo reaktivní.
biochemie_2_1 31
Mají v postranním řetězci kyslík, síru a nebo
dusík a proto jsou polární. Snadno interagují
s vodou, jsou hydrofilní. Jsou velmi dobře
rozpustné ve vodě.
Polární (hydrofilní) aminokyseliny
biochemie_2_1 32
Polární (hydrofilní) postranní řetězce R
Serin (Ser) Cystein (cys)
Glutamin (Gln)
Asparagin (Asn)
Tyrosin (Tyr)
Threonin (Thr)
http://www.indstate.edu/thcme/mwking/amino-acids.html
biochemie_2_1 33
Serin a threonin mají –OH skupinu a jsou velmi
polární. Hrají významnou úlohu při fosforylačních
reakcích (v aktivním místě enzymů).
Tyrosin je fenylalanin s hydroxylovou (-OH) skupinou.
Je velmi polární, slabou kyselinou. Má důležitou
katalytickou funkci v aktivním místě enzymů
(reverzibilní přenos fosfátové skupin).
biochemie_2_1 34
Cystein obsahuje síru a thyolová (-SH) skupina je
velice reaktivní. Dva cysteiny vytváří kovalentní vazbu
(disulfidický můstek). Ten je důležitý pro stabilizaci
prostorového uspořádání proteinu.
SHHS CH2CH2CH CH COOHCOOH
NH2 NH2
- - - - - SSbiochemie_2_1
35
Asparagin a glutamin jsou amidy kyselin
asparagové a glutamové. Jejich postranní řetězce
obsahují druhou aminoskupinu, která neionizuje.
Asparagin Glutamin
biochemie_2_1 36
Asparagová kyselina (Asp) Glutamová kyselina (Glu)
Negativně nabité (nepolární) postranní
řetězce R
Asparagová a glutamová kyselina obsahují druhou
COO- skupinu a jsou negativně nabité. Proteinu
dodávají celkový záporný náboj.
biochemie_2_1 37
Pozitivně nabité (nepolární) postranní
řetězce R
e-aminoskupina guanidinová skupina imidazolová skupina
Lysin (Lys) Arginin (Arg) Histidin (His)
Lysin a arginin mají oba pK kolem 10 a jsou proto vždy při neutrálním
pH pozitivně nabité.
Histidin je zajímavý v tom, že jeho pK je 6.5 a proto může být bez
celkového náboje nebo pozitivně nabitý. Histidin hraje důležitou roli v
katalytickém mechanismu enzymových reakcí, často se vyskytuje v
aktivním místě enzymu. Jako součást hemoglobinu reguluje pH krve.biochemie_2_1 38
Dělení aminokyselin podle chemického složení
malé aminokyseliny – glycin, alanin
větvené aminokyseliny – valine, leucine, isoleucine
hydroxy aminokyseliny (-OH skupina) – serin, threonin
aminokyseliny se sírou – cystein, methionin
aromatické aminokyseliny – fenylalanin, tyrosin, tryptofan
kyselé aminokyseliny a jejich deriváty – asparagová kyselina a
asparagin, glutamová kyselina a glutamin
bazické aminokyseliny – lysin, arginin, histidin
iminokyselina - prolin
biochemie_2_1 39
Esenciální aminokyseliny u člověka
• přísun z potravy
• člověk není schopen syntetisovat jejich uhlíkovou kostru
Arginin*
Histidin*
Isoleucin
Leucin
Valin
Lysin
Methionin
Threonin
Fenylalanin
Tryptofan
* Esenciální pouze u dětí, ne u dospělých
biochemie_2_1 40
Neesenciální aminokyseliny
• není potřeba jejich přísun potravou
• vznikají transaminací -ketokyselin a následnými
dalšími reakcemi
Alanin
Asparagin
Aspartát
Glutamát
Glutamin
Glycin
Prolin
Serin
Cystein (z Met*)
Tyrosin (Phe*)
* Esenciální aminokyseliny
biochemie_2_1 41
Málo běžné aminokyseliny vyskytující se v
proteinech
hydroxyprolin a hydroxylysin
v kolagenu a elastinu
6-N-methyllysin
složka myosinu
g-karboxyglutamát
složka prothrombinu a
dalších proteinů vázajících
Ca2+
biochemie_2_1 42
Desmosin
příčná vazba v elastinu
Ornitin a citrulin
intermediáty biosyntézy argininu a
močovinového cyklu
biochemie_2_1 43
Ninhydrinová
reakce
Toto silně oxidační činidlo
oxidativně dekarboxyluje
aminokyselinu. Amoniak a
hydrindantin, který
vznikne z ninhydrinu,
vytvoří modročervenou
barvu
biochemie_2_1 44
45
Optické vlastnosti AMK a proteinů
TEST
http://web.campbell.
edu/faculty/nemecz/
323_lect/amino/ima
ges/spectrum.jpg
biochemie_2_1
46
Absorpce spektra Trp & Tyr
Lamber - Beerův zákon: A = ecl. Používán na zjištění koncentrace
proteinů
biochemie_2_1
1) Reakce AMK - kondenzace
• reakce, při kterých dochází k propojování AMK do řetězců
• reakce –COOH skupiny 1. AMK s –NH2 skupinou 2. AMK za
současného odštěpení vody
• vzniká dipeptid až polypetid (tj. bílkovina)
• přítomnost peptidické vazby – BIURETOVA reakce (vzniká biuret =
modrofialové zabarvení, peptid + Cu2+ v alkalickém prostředí)
R2O
R1
COOH
NH2
CH
C
N
CH
H
R1
NH2
CH C
O
OH
R2
N
CH COOH
H H
+
N-konec C-konec
- H2O
peptidová
vazba
biochemie_2_1 47
Příklad
biochemie_2_1 48
2) Reakce AMK - dekarboxylace
• reakce, které si využívají při odbourávání
nadbytečných AMK
CH COOHR
NH2
CH2R NH2 + CO2
biochemie_2_1 49
3) Reakce AMK - transaminace
• reakce slouží k přenosu aminoskupiny z jedné
molekuly na druhou
• z kyseliny, která je v nadbytku se může vyrobit
AMK potřebná
R1
NH2
CH COOH R2
O
C COOH+ R1
O
C COOH R2
NH2
CH COOH+
biochemie_2_1 50
4) Reakce AMK - oxidační deaminace
• reakce sloužící při získávání energie z AMK a bílkovin
(např. při hladovění)
• úplným odbouráním AMK vzniká oxid uhličitý, voda a
amoniak
NH2
R CH COOH
NH
R C COOH
O
R C COOH + NH3
OH2
- 2 H
imin
biochemie_2_1 51
Tvorba proteinů - vznik peptidové
vazby
C C
R
1
NH3
+
O
O
-
H
C C
R
2
N
+
O
O
-
HH
H
H
+
OH2
C C
R
1
NH3
+
O
H
C C
R
2
N
O
O
-
HH
peptidová vazba
dipeptid
biochemie_2_1 52
peptidová vazba je vazbou kovalentní, je rigidní – vazba C-N má
částečně charakter dvojné vazby v důsledku rezonance, atomy
se kolem ní nemohou volně otáčet
tyto dvě vazby jsou
jednoduché, umožňují
volnou rotaci atomů,
takže dlouhé řetězce
aminokyselin jsou
vysoce pohyblivé
C C
R
1
NH3
+
O
H
C C
R
2
N
O
O
-
HH
C C
R
1
NH3
+
H
C C
R
2
N
+
O
O
-
H
O
-
H
biochemie_2_1 53
při pH~7 je stabilní i při 100°C
hydrolyzuje se v silně kyselém nebo
zásaditém prostředí
nebo pomocí enzymů
stabilita peptidové vazby:
biochemie_2_1 54
55
Reakce aminokyselin
- Peptidická vazba
- Disulfidový můstek
http://www.blc.arizona.edu/courses/schaf
fer/182/PeptideBond-HiRes.JPEG
http://guweb2.gonzaga.edu/faculty/cronk/
biochem/images/disulfide_bond_formati
on.gif
biochemie_2_1
56
Primární struktura: Peptidická vazba, mezi AMK
Mezi -karboxylovou skupinou jedné AMK & -amino skupinou jiné AMK
2 AMK
Dipeptid
Ztráta
H2O
Rovnováha upřednostňuje hydrolýzu, a proto
biosyntéza peptidových vazeb vyžaduje volný vstup energie
Peptidové vazby jsou kineticky stabilní
Tvorba peptidické vazby kondenzací. Amino skupina jedné AMK (s R2 skupinou) se účastní jako nukleofil , aby nahradila hydroxylovou
skupinu druhé AMK (s R1 skupinou) za vytvoření peptidické vazby. Amino skupina je dobrý nukleofil, zatímco hydroxylová skupina je
slabě odštěpitelná skupina a není tedy ihned nahrazena. Za fyziologického pH se tato reakce nevyskytuje ve značné míře.
http://oregonstate.edu/instru
ct/bb450/spring14/stryer7/2
/figure_02_13.jpg
biochemie_2_1
57
Polypeptidické vazby jsou planární
Šest atomů (Ca, C, O, N, H, Ca) leží v rovině, mezi jedním párem AMK
http://oregonstate.edu/i
nstruct/bb450/spring14
/stryer7/2/figure_02_1
8.jpg
biochemie_2_1
58
Polypeptidový řetězec je orientovaný
http://oregonstate.ed
u/instruct/bb450/spr
ing14/stryer7/2/figu
re_02_14.jpg
biochemie_2_1
59
Hlavní řetězec neboli páteř
Konstantní hlavní řetězec: pravidelně se opakující část
Rozdílný postranní řetězec (R-skupiny): variabilní část
AMK jednotky v polypeptidu se nazývají zbytky, které obsahují
Karbonylovou skupinu; dobrý akceptor vodíkové vazby,
Amino skupinu(kromě Pro); dobrý donor vodíkové vazby
http://oregonstate.edu/instruct/bb450/
spring14/stryer7/2/figure_02_15.jpgbiochemie_2_1
60
Délka vazeb v peptidové vazbě
http://oregonstate.edu
/instruct/bb450/sprin
g14/stryer7/2/unnum
bered_02_p36.jpg
http://o.quizl
et.com/Wpor
YW0r9DIqu
pDOSjrgrQ_
m.jpg
biochemie_2_1
61
Peptidová vazba: charakter dvojné vazby
Zabraňuje rotaci kolem vazby
Délka vazby:
C-N peptid = 1.32 A
C-N jednoduchá= 1.49 A
C-N dvojná= 1.27 A
Možné dvě (cis & trans)
konfigurace. Vyskytuje se pouze trans
biochemie_2_1
62
Trans & cis peptidy
Cis konfigurace má stérickou překážku; trans silně preferovaná
http://oregonstate.edu/instruct
/bb450/spring14/stryer7/2/fig
ure_02_20.jpg
biochemie_2_1
63
Trans & cis X-Pro
N prolinu je vázán na dva tetraedrické C:
Stérická překážka v obou formách, nižší preference pro trans
http://oregonstate.edu/instruct/bb45
0/spring14/stryer7/2/figure_02_21.j
pg
biochemie_2_1
64
Rotace vazeb v polypeptidu
Amino skupina C & karbonalová skupina C jsou čisté jednoduché vazby,
Umožňují rotaci
Volnost v rotaci umožňuje proteinu sbalení v různých formách
Úhel vzpětí: měření rotace mezi -180o & +180o
http://oregonstate.edu/instru
ct/bb450/spring14/stryer7/2
/figure_02_22a.jpg
biochemie_2_1
65
Oxidace cysteinu
-Vysoce reakticní SH- (thiolová
skupina cysteinu)
- reverzibilní oxidace – vznik
disulfidu
-CYSTIN (disulfid) –
-DISULFIDICKÝ MŮSTEK
-- jeden řetězec, 2 separované
řetězce
-V proteinech: stabilita
http://classconnection.s3.amazona
ws.com/1860/flashcards/701479/j
pg/cysteine-dimer.jpg
biochemie_2_1
66
Cross link (disulfidické můstky)
Vyskytují se hlavně v extracelulárních proteinech
biochemie_2_1
Peptidy a proteiny
• v těle vznikají
proteosyntézou v
cytoplazmě buněk
• proteosyntéza
probíhá na
ribozomech
• 2 – 50 AK: peptid
• > 50 AK: protein
(bílkovina)
biochemie_2_1 67
Názvosloví peptidů
• pořadí aminokyselin (=jejich sekvenci)
čteme od N konce k C konci
• k názvu aminokyselin přidáme koncovku –yl
• např.: Tyrozylalanylcystein
• H2N-Tyr-Ala-Cys-COOH
• většina peptidů a proteinů mají triviální názvy
(glutathion, hemoglobin, kolagen)
biochemie_2_1 68
Některé významné peptidy v
našem těle
CH2 C
O
CH C
CH2
NH
O
CH2CNH
O
O
-
CH2CH
SH
NH3
+
C
O
-
O
glutathion –
tripeptid, v těle
působí proti
oxidativnímu stresu
tvorbou disulfidových
můstků
některé hormony: oxytocin, vazopresin, glukagon, ...
také některé jedy a mnoho dalších významných látek
Umělá příprava polypeptidů by mohla vést k
získání bezpečných vakcín.biochemie_2_1 69
CH2 C
O
CH C
CH2
NH
O
CH2CNH
O
O
-
CH2CH
SH
NH3
+
C
O
-
O
2x
CH2 C
O
CH C
CH2
NH
O
CH2CNH
O
O
-
CH2CH
S
NH3
+
C
O
-
O
CH2 C
O
CH C
CH2
NH
O
CH2CNH
O
O
-
CH2CH
S
NH3
+
C
O
-
O
H2
Oxidace glutathionu
biochemie_2_1 70
71
Peptidy
 Peptidická vazba, výrazná reaktivita
 Výrazná biologická aktivita
Glutathion
Oxytocin
Vasopresin
Enkefaliny a endorfiny
Atriální natriuretický faktor
Substance P
Bradykinin
http://nwpfcommunity.files.wordpress.com/201
3/06/glutathione.gif
http://biochemie.wz.cz/img/oxytocin.gif
biochemie_2_1
72
 Glutathion –
 (g-glutamyl-L-cysteinnylglycine)
(g-amidová vazba, g-karboxy skupina se účastní na peptidické vazbě)
Funkce:
- Syntéza proteinů a DNA,
Metabolismus xenobiotik (léčiva, toxiny),
transport AMK
- Redukční činidlo
- Chrání buňky před oxidativním poškozením
- GSH/GSSG je běžně přítomen v buňkách ve vysoké koncentraci
- Významné intracelulární redukční činidlo
- Glutathion peroxidáza
(methemoglobin)
TEST
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/7/7e/Glutathion
e-skeletal.png
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0d/Gl
utathione_peroxidase_reductase.svg/620px-
Glutathione_peroxidase_reductase.svg.png
biochemie_2_1
73
Peptidické hormony
•Hormony obratlovců: mnoho malých peptidů vykazuje svůj účinek při velmi nízkých
koncentracích.
•Hypotalamus:
Oxytocin (9 AMK zbytků) sekretován ze zadního laloku hypofýzi a stimuluje kontrakce
dělohy
Vasopresin
bradykinin (9 zbytků) brání zánětu tkání
thyrotropin-releasing factor (3 zbytky) tvořen v hypotalamu a atimuluje uvolnění dalšího
hormonu; thyreotropinuz přednáho laloku hypofýzi.
http://humanphysiology2011.wikispaces.com/file/vi
ew/polypeptide_%26_glycoportein_hormones.jpg/2
01094590/720x268/polypeptide_%26_glycoportein_
biochemie_2_1
74
Peptidy
 Aspartam
L-aspartyl-L-phenylalanine methyl
ester, umělé sladidlo známé jako aspartam
nebo NutraSweet.
http://www.sweetenerbook.com/asset
s/img/aspartame.pngbiochemie_2_1
Biochemie-2 75
Peptid
Některé extrémně toxické toxiny hub, jako amanitin,
Jsou rovněž malými peptidy.
http://www.tehnologijahrane.com/wp-
content/uploads/2009/07/amanita-phalloides-i-
amatoksin-amanitin-toksin-zelene-pupavke.jpg
75biochemie_2_1
76
Leu L
-C-C-CONH2-C-CONH2
-C-COOH -C-C-COOH
-H -CH3
-C-OH -C-SH
-C-C-S-C
PPro
-C-C C
N N+
-C-C-C-C-NH3
+
-C-C-
-OH
-C-
N
South line
Circular line
Alifatické
Amidy
Kyseliny
Imino,
Cyklické
Bazické
SíraHydroxy
Aromatické
-C-C-C-N-C-N
N+
=
C
-C-C-C
C
-C-C-C
C C
-C
C
C C
HN C-COOH
a-C-C
OH
Gln QAsn N
Asp D Glu EPhe F
Arg R
Lys K
His H
Gly G AAAla VVal IIle
YTyr
Ser S
Thr T Met M
Cys C
Mapa aminokyselin
Trp W
Nepolárn
í
Polarní
Toto není metabolická dráha
TEST
biochemie_2_1
77
POLARní
NE
POLÁRNÍ
Tyr His
Gly
Acidic Neutral Basic
Asp
Glu Gln
Cys
Asn Ser
Thr Lys
Arg
Ala
Val
Ile
Leu Met
Phe Trp
Pro
Klasifikace AMK podle polarity
Polarita je základní vlastností AMK.
TEST
biochemie_2_1
biochemie_2_1 78
biochemie_2_1 79
biochemie_2_1 80
81
Struktura a funkce proteinů
Proteiny jsou nejvšestrannějšími makromolekulami v živých systémec
a mají klíčové funkce v podstatě ve všech biologických procesech
1 Proteiny se skládají z 20 AMK
2 Primární struktura: aminokyseliny spojené peptidovou vazbou
tvoří polypeptidový řetězec
3 Sekundární struktura: polypeptidové řetězce se sbalují do pravidelných
struktur jako alfa helix, beta list, & obraty & smyčky
4 Terciární struktura: ve vodě rozpustné proteiny se sbalují
do kompaktrních struktur s nepolárním jádrem
5 Kvartérní struktura: polypeptidové řetězce se mohou seskupovat
do více jednotkových struktur
6 Sekvence aminokyselin v proteinu určuje jeho trojrozměrnou strukturu
biochemie_2_1
Biochemie-2 82
Struktura proteinů na různých úrovních
https://figures.boundless.
com/18576/full/figure-
03-04-09.jpe
82biochemie_2_1
83
Proteiny – Klíčové vlastnosti- široký rozsah
funkcí
1. Proteiny jsou lineární polymery sestavené z monomerních jednotek
aminokyselin – spontánně složeny do prostorových struktur
2. Proteiny obsahují velké množství funkčních skupin- alkoholy,
thioly, thioethery, karboxylové kyseliny, karboamidy, a další základní
skupiny - např. chemická reaktivita nezbytná pro funkci proteinů
3. Proteiny mohou interagovat spolu navzájem, s dalšími biologickými
makromolekulami za vzniku komplexních struktur
4. Některé proteiny jsou rigidní, zatímco ostatní vykazují určitou
flexibilitu- structuralní elementy v cytoskeletu
biochemie_2_1
Primární struktura hovězího insulinu
First protein to be fully sequenced (by
Fred Sanger in 1953). For this, he won his
first Nobel Prize (his second was for the
Sanger dideoxy method of DNA
sequencing).
84biochemie_2_1
85
Bovinní insulin: AMK sekvence
1953, Fred Sanger stanovil sekvenci inzulinu, mezník!
Ukázáno vůbec poprvé, že protein má přesně definovanou sekvenci
Také dokázáno, že jsou přítomny pouze L-aminokyseliny spojené
peptidickou vazbou
Nyní je známa AMK sekvence > 100,000 proteinů
1950-1960 léta: studie rovněž dokázaly genetické ovlivnění
sekvence
Každá z 20 AMK je kódována jednou nebo více specifickými
sekvencemi 3 nukleotidů. http://cnx.org/resources/20a380bd2
28cff5ec1a23622e0d2a596/Figure_
03_04_04.jpg
biochemie_2_1
Molekulární údaje o některých proteinech
86biochemie_2_1
Proteinové databaze  http://web.expasy.org/protparam/
87biochemie_2_1
88biochemie_2_1
89biochemie_2_1
Evoluce a konservace proteinové
sekvence
Translation elongation factor Tu/1
Myoglobin
90biochemie_2_1
Genetický kód
91biochemie_2_1
DNA RNA Protein
92biochemie_2_1
Iniciační aminokyseliny v procesu
translace
N-Formylmethionine in
prokaryotes
Just methionine in
eukaryotes
N
H
H
N
S
CH3
O R
OO
H
H3N
H
N
S
CH3
O R
O
93biochemie_2_1
Aktivace tRNAs specifickou AK
94biochemie_2_1
Translace z mRNA do Proteinu
95biochemie_2_1
Aktivita Ribosomální Peptidyl
Transferase
Note: the catalytic component of the ribosome’s peptidyl transferase activity is
RNA; it’s an example of a catalytic RNA or ribozyme. 96biochemie_2_1
Tvorba disulfidických vazeb v insulinu
97biochemie_2_1
Biochemie-2 98
Shrnutí
1) Aminokyseliny mohou být kovalentně spojeny peptidickou vazbou za
vzniku peptidů a proteinů. Buňky obecně obsahují tisíce různých proteinů,
každý s jinou biologickou aktivitou.
2. Proteiny mohou být velmi dlouhé polypeptidové řetězce o 100 až několik
tisíc zbytků. Ačkoli některé přirozeně se vyskytující peptidy mají jen velmi
málo zbytků. Některé proteiny jsou složeny z několika nekovalentně
asociovaných polypeptidů; podjednotek. Jednoduché proteiny se
hydrolýzou rozkládají pouze na AMK; konjugované proteiny navíc
obsahují další složku např. kov nebo prostetickou skupinu.
3. Sekvence aminokyselin v proteinu je charakteristická pro každý protein a
nazývá se primární struktura. Toto je jedna ze čtyř obecně rozlišovaných
úrovní struktury proteinů.
98biochemie_2_1
Metody v proteinové biochemii
99biochemie_2_1
Gelová elektroforeza
100biochemie_2_1
Polyamfolitní charakter peptidu a
izoelektrický bod
Isoelectric Point (pI), pH at
which molecule has net zero
charge, determined using
computer program for known
sequence or empirically (by
isoelectric focusing).
Group pKa
-NH3
+ 9.7
Glu g-COOH 4.2
Lys e-NH3
+ 10.0
-COOH 2.2
101biochemie_2_1
102biochemie_2_1
Isoelektrická fokusace
Electrophoresis through polyacrylamide gel in
which there is a pH gradient.
103biochemie_2_1
104biochemie_2_1
2D gelová elektroforesa
 Separace proteinů založená na isoelektrickém bodě v
prvním rozměru
 Separace proteinů zložená na molekulové hmotnosti
v 2. směru
105biochemie_2_1
Vysolování: precipitace, srážení
síranem amonným – proteinová
frakcionace
106biochemie_2_1
Centrifugace
Centrifugation Methods
•Differential (Pelletting) – simple method
for pelleting large particles using fixedangle
rotor (pellet at bottom of tube vs.
supernatant solution above)
•Zonal ultracentrifugation (e.g., sucrosegradient)
– swinging-bucket rotor
•Equilibrium-density gradient
ultracentrifugation (e.g., CsCl) –
swinging-bucket or fixed-angle rotor
Low-speed, high-speed, or
ultracentrifugation: different
spin speeds and g forces
107biochemie_2_1
Zonalní centrifugace v gradientu sacharosy:
gradientová preparativní ultracenrifugace
Separates by sedimentation coefficient
(determined by size and shape of solutes) 108biochemie_2_1
Sacharosová gradietová preparativní
ultracenrifugace
109biochemie_2_1
Gradientová ultracentrifugace
založená na stejné hustotě
 využívá se Meselsen-Stahl experimentu,
rozdělení na základě hustoty rozpuštěných
látek.
 Nevyžaduje předpřipravený gradient
 Nalijte hustý roztok rychle rozptylující látky ve
zkumavce (obvykle CsCI).
 Gradientem hustoty se vytvoří během
odstřeďování ("self-generování gradientu")
 Rozpuštěné látky migrují podle jejich hustotý,
rychlosti sedimentace (kde hustota
rozpuštěné látky = hustota roztoku CsCl). 110biochemie_2_1
Chromatografie na koloně
Flow-through Eluate
111biochemie_2_1
Různé typy chromatografie
 Gelová filtrace / molekulární síto - dělí podle velikosti (molekulové
hmotnosti) proteinů
 Iontoměničová (katex a výměna aniontů) - odděluje od povrchového
náboje na proteiny
Katexová: odděluje na základě kladných nábojů rozpuštěných látek /
proteinů matrix je záporně nabitý
Anexová: odděluje na základě záporných nábojů rozpuštěných látek
/ proteinů, matice je pozitivně nabitá
 Hydrofobní -odděluje od hydrofobnosti proteinů
 Afinitní - odděluje nějakou unikátní závaznou charakteristiku
proteinu zájmu afinitní matrix ve sloupci
112biochemie_2_1
Iontoměničová chromatografie
113biochemie_2_1
Gelová filtrace
114biochemie_2_1
Afinitní chromatografie
115biochemie_2_1
Štěpení polypetitdového řetězce pro
analýzu
 Silná kyselina (např, 6 M HCl) – nespecifické
 Sekvence specifické pro proteolytické
enzymy (proteázy)
 Sekvence specifické - chemické štěpení
(např, štěpení bromkyanem na zbytcích
methioninu)
116biochemie_2_1
Specifické proteázy
117biochemie_2_1
Štěpení – methioninové zbyky
pomocí kyanogen Bromidu
118biochemie_2_1
119biochemie_2_1
Proteinové sekvenace pomocí Edman Degradace
PTH = phenylthiohydantion
F3CCOOH = trifluoroacetic acid
PTC = phenylthiocarbamyl
120biochemie_2_1
Identifikace N-koncové AA
Note: Identification of C-terminal residue done by hydrazinolysis (reaction with anhydrous hydrazine in presence of mildly
acidic ion exchange resin) or with a C-terminus-specific exopeptidase (carboxypeptidase).
NO2
121biochemie_2_1
Separace AA pomocí HPLC
122biochemie_2_1
Idenifikace proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie
123biochemie_2_1
Idenifikace proteinů pomocí hmotnostní
spektrometrie
Dva hlavní přístupy:
1. Peptide hmotnost otisků prstů: proteolytické štěpení bílkovin, pak
stanovení m / z peptidů MS (např, MALDI-TOF a ESI-TOF), hledání
"otisk prstu" proti databázi. Úspěch je závislé na kvalitě / úplnost
databáze pro konkrétní proteomu.
2. Tandem MS (MS / MS - ​​například nanoLC-ESI-MS / MS):
proteolytické štěpení bílkovin, separaci a stanovení m / z každého
(MS-1), pak určení kolizí indukované disociace fragmentu spektra
pro každý peptid (MS-2). Poskytuje kontext / sekvenčně závislé
informace, takže spíš dělat novo metodou sekvenování.
124biochemie_2_1
Locating Disulfide Bonds
O
O-
I
iodoacetate
125biochemie_2_1
Determing Primary Structure of an
Entire Protein
126biochemie_2_1
Reactions in Solid-Phase Peptide
Synthesis
127biochemie_2_1
128biochemie_2_1
129
Aminokyseliny
 Proteiny jsou polymery aminokyseliny, kde je každý
aminokyselinový zbytek navázán na svého souseda
specifickým typem kovalentní vazby.
 L-α-aminokyseliny a jejich deriváty se podílí na rozličných
buněčných funkcí jako nervový přenos a biosyntéza
porfyrinů, purinů, pyrimidinů a močoviny.
 Existuje více než 300 AK, 21 v proteinech savců…
Proteiny: Esenciální pro všechny organismy
 AMK
 Peptidy
 Polypeptidy
 Proteiny; více než 50 AMK
biochemie_2_1
130
Funkce aminokyselin
 Primární funkce (součást proteinů)
 Chemický přenašeč:
- Neurotransmitery (substance z jedné nervové buňky,
- Které ovlivňují funkci druhé nervové buňky)
- GABA (γ-amino máselná kyselina), glycin,
serotonin (tryptofan)
- Hormony (chemické přenašeče….produkovány jedním typem buněk a regulují funkci jiných typů buněk)
- Thyroxin (tyrozin)
- Indolkarboxylová kyselina (rostliny)
- Prekurzory pro molekuly obsahující dusík
- Nukleotidy, hem, chlorofyl
- Metabolické intermediáty: arginin, citrulin, ornithin – cyklus
močoviny
TEST
http://www.chemieunterricht.de/dc2/essig/images/
hac-31.gif
http://www.pearsonhighered.com/mathews/ST/TH
YROXIN.GIF
biochemie_2_1