2.3 Struktura, funkce a metabolismus
hemoglobinu a myoglobinu
Obrázek byl převzat z http://themedicalbiochemistrypage.org/hemoglobin-myoglobin.html
Biochemie-3-2-Hb-Myo 2
2.3 FUNKCE PROTEINŮ
• Funkce mnoha proteinů zahrnuje reverzibilní
vazby další molekuly
• LIGAND
• VAZEBNÉ MÍSTO (BINDING SITE)
• VAZBA LIGANDU NA PROTEIN – často
spojena se změnou konformace
• KOOPERATIVNÍ EFEKT
• ALOSTERICKÝ EFEKT
• Protein: - ligand
- vazebné místo
• Enzymy: - substrát
- aktivní místo
Struktury obsahující hem
Hemoproteiny
• Hemoglobin (Hb)
• Myoglobin (Mb)
• Cytochromy
• Kataláza (rozklad
H2O2 na H2O a O2)
• Peroxidázy
Obrázek byl převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Heme
Cyklický tetrapyrrol
Fe, Cu , Mg
Biochemie-3-2-Hb-Myo 4
Reverzibilní vazba proteinu na ligand
Kyslík vázající proteiny
• MYOGLOBIN, HEMOGLOBIN
• O2 špatně rozpustný ve vodných roztocích, difúze
pouze několik milimetrů
• AK neváží O2
• Evoluce- proteiny transportující a uchovávající O2
• Hemoproteiny (hem, reverzibilní vazba O2)
• Hem- Fe2+
http://moje-
zajmy.blogerka.cz/Prirodopis/Cervene-
krvinky
Struktura hemu
Hem je metaloporfyrin
(cyklický tetrapyrol)
Hem obsahuje:
 konjugovaný systém
dvojných vazeb → červené
zbarvení
 4 atomy dusíku (N)
 1 železnatý kation (Fe2+)
→ vázán uprostřed
tetrapyrolového skeletu
koordinačně kovalentními
vazbami
Obrázek převzat z http://www.nebrwesleyan.edu/people/nfackler/lecturelinks/images/
Overheads/Fig%2015-A.jpg
methinový můstek pyrrol
Vlastnosti železa v hemu
• Koordinační číslo železa
v hemu = 6
• 6 vazeb:
• 4x pyrolový kruh
• 1x vazba na protein
• 1x vazba kyslíku
Obrázek převzat z http://www.mun.ca/biochem/courses/3107/images/VVP/Ch07/7-2.jpg
Myoglobin (Mb)
• je jednovláknový globulární
protein
(153 aminokyselin, 17 kDa)
obsahující 1 hem
• Uchovává a transportuje O2 v
kosterním a srdečním svalu
• obsažen v cytosolu buněk
• slouží jako marker poškození
myokardu při ICHS
 a-helix 75% molekuly, A-H (8
a-helixů),
• povrch polární,
• uvnitř nepolární až na His E7distální,
His F8-proximální ,
HYDROFOBNÍ KAPSA
Obrázek byl převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Myoglobin
8
TEST
Hemoglobin (Hb)
• je hemoprotein přítomný v cytoplazmě erytrocytů
• transportuje O2 a CO2 mezi plícemi a různými tkáněmi
• hem náleží mezi cyklické tetrapyroly (porfyriny)
• fyziologické koncentrace Hb v krvi:
Dospělí jedinci:
muži 135 – 175 g/l
ženy 120 – 168 g/l
Hodnoty koncentrací Hb byly převzaty z Ústavu biochemie a patobiochemie FNKV
Struktura hemoglobinu
• sférická molekula skládající se ze 4 peptidových podjednotek
(globinů) = kvartérní struktura
• Hb dospělých jedinců (Hb A) je tetramer obsahující 2 a- a 2 βglobiny
→ každý globin obsahuje 1 hemovou skupinu s centrálním
Fe2+ iontem
Obrázek byl převzat z http://faculty.etsu.edu/currie/images/hemat3.jpg
Saturační křivky Myoglobinu a
Hemoglobinu
Alosterické vlastnosti
Kooperativní efekt
Funkce hemoglobinu
• Hb je pufr (Hb/Hb-H+) v erytrocytech
• Hb je přenašeč O2 a CO2
Vazba O2 je kooperativní. Hb váže O2 slabě při nižších pO2 a silněji
při vyšších pO2. Vazba první molekuly O2 na Hb zesiluje možnost
vazby dalších molekul O2 → allosterický efekt → esovitá (sigmoidální)
saturační křivka Hb
Obrázky byly převzaty z
http://www.chemistry.wustl.edu/~edudev/labTutorials/Hemoglobin/MetalComplexinBlood.html a
http://en.wikipedia.org/wiki/Hemoglobin
TEST
Biochemie-3-2-Hb-Myo 13
Hemoglobin, Tetramer, kooperativita
Lidský hemoglobin,
Dvě alfa
Dvě beta
podjednotky,
4 skupiny hemu
Kvartérní struktura
Hemoglobin se skládá se čtyř podjednotek –
dvou podjednotek α a dvou podjednotek β.
Mezi podjednotkami existují dva typy
interakcí:
a) hydrofobní
b) elektrostatické
Hydrofobní interakce se nacházejí mezi podjednotkami α a β (na
obrázku naznačeny šedým pásem). Hydrofobní interakce existují mezi
jednotkami jak v oxygenovaném, tak v deoxygenovaném hemoglobinu.
Elektrostatické interakce jsou relativně silné a nacházejí se mezi
jednotkami α a α; β a β nebo i α a β (na obrázku jsou naznačeny
čárkovaně). V okamžiku, kdy se na hemoglobin naváže kyslík, jsou
elektrostatické interakce narušeny
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 6
TEST
http://en.wikipedia.org/wiki/Hemoglobin#mediaviewer/Fil
e:1GZX_Haemoglobin.png
Oxygenace hemoglobinu
Hb může existovat ve 2 různých formách: T-forma a R-forma.
T-forma (T = „tense“,napjatý, deoxy) má mnohem nižší afinitu k O2 než Rforma.
Globinové podjednotky Hb jsou navzájem udržovány elektrostatickými
interakcemi. Vazba první molekuly O2 do podjednotky T-formy vede k lokální
konformační změně, která oslabí asociaci mezi podjednotkami → R-forma
(„relaxed“, oxy).
Zvýšení parciálního tlaku kyslíku vede k přeměně T-formy na R-formu.
T  R
Hb + ↑pO2  HbO2
Hydrofobní interakce v T stavu, narušeny
vazbou O2
Metabolismus erytrocytu
• ATP je produkováno anaerobní glykolýzou → ATP je využíváno v
transportu iontů přes buněčnou membránu
• glykolýza produkuje 2,3-BPG a laktát
• asi 5 - 10% Glc je metabolizováno pentózovým cyklem →
produkce NADPH → je využíváno k udržování glutathionu v
redukovaném stavu
Obrázek byl převzat z http://themedicalbiochemistrypage.org/hemoglobin-myoglobin.html
Činitelé, kteří ovlivňují vazbu kyslíku:
● 2,3-bisfosfoglycerát (2,3-BPG) se váže pouze na deoxyHb
(β-globiny) → deoxyHb je takto stabilizován
● H+ ionty (nižší pH) – vazba H+ na Hb snižuje jeho afinitu ke O2 →
Bohrův efekt
● CO2 – vyšší koncentrace CO2 v plazmě způsobuje posunutí saturační
křivky doprava = Bohrův efekt
Obrázky byly převzaty z http://en.wikipedia.org/wiki/Bohr_Effect a
http://themedicalbiochemistrypage.org/hemoglobin-myoglobin.html
Deriváty hemoglobinu
 Oxyhemoglobin (oxyHb) = Hb s navázaným O2
 Deoxyhemoglobin (deoxyHb) = Hb bez navázaného O2
 Methemoglobin (metHb) obsahuje Fe3+ místo Fe2+ v hemové skupině
 Karbonylhemoglobin (HbCO) – CO se váže na Fe2+ hemu v případě
otravy CO nebo při kouření. CO má 200x vyšší afinitu k Fe2+ než O2.
 Karbaminohemoglobin (HbCO2) - CO2 je nekovalentně vázán na
globinový řetězec Hb. HbCO2 transportuje CO2 v krvi (asi 23%).
 Glykovaný hemoglobin (HbA1c) je tvořen spontánně neenzymatickou
reakcí s Glc (globiny). Pacienti s DM mají vyšší koncentrace HbA1c
(› 7%) než zdraví lidé v důsledku déletrvajících hyperglykémií.
TEST
20
Transport CO2 krví :
1/ 85 % HCO3
-
2/ 10-15 % karbamát (Hb)
3/ 5 % fyzikálné rozpuštěný
(chemicky nezreagovaný CO2)
Hb – NH2 + CO2  Hb - NH - COOH
karbaminová kys. = karbamová kys. = amino.mravenčí H2N - COOH
Transport O2 a CO2 v plicích
Obrázek byl převzat z http://www.mfi.ku.dk/ppaulev/chapter15/Chapter15.html
Transport O2 a CO2 mezi tkáněmi a krví
Obrázek byl převzat z http://www.mfi.ku.dk/ppaulev/chapter15/Chapter15.htm
Typy hemoglobinu
 Hb dospělých jedinců (HbA) = 2 α- a 2 β-podjednotky
HbA1 je hlavní forma Hb u dospělých a dětí starších 7 měsíců.
HbA2 (2 α, 2 δ) je minoritní forma, tvoří pouze 2 – 3% celkového
HbA.
 Fetální Hb (HbF) = 2 α- a 2 γ-podjednotky
- u fétu a novorozenců HbF váže O2 při nižších parciálních tlacích
než HbA → Hb F má vyšší afinitu ke O2 než HbA
Po narození HbF je nahrazován HbA během několika prvních měsíců
života.
 HbS – v β-globinu Glu je nahrazen Val
- abnormální typ Hb u srpkovité anémie
Obrázek byl převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Sickle-cell_disease
Fetální HbF vs. Hb dospělých jedinců HbA
Obrázek byl převzat z http://en.wikipedia.org/wiki/Fetal_hemoglobin
Jednotky tlaku:
1 mmHg = 1 Torr
1 mmHg = 133,22 Pa
1 Pa = 0,0075 mmHg
1 kPa = 7,5 mmHg
25
Glykace Hb
Hodnota HbA1c poskytuje nepřímou informaci o průměrné
hladině cukru v krvi (dále glykémie) v časovém období 4-6
týdnů. Délka období odpovídá biologickému poločasu
přežívání červených krvinek, tzv. erytrocytů. Hodnota
HbA1c odráží hodnoty glykémie za celé toto období před
provedením odběru krve.
HbA1c je proto stále považován za nejdůležitější parametr
kompenzace cukrovky.
Správné hodnoty glykovaného hemoglobinu HbA1c
HbAlc se odebírá v zpravidla při odběrech v diabetologické
ordinaci. Pacient nemusí být nalačno. Hodnoty HbA1c
vyjadřujeme v procentech (%) jako procento glykovaného
hemoglobinu z celkového hemoglobinu v krvi.
• U zdravého člověka netrpícího diabetem
se hodnoty HbA1c pohybují v rozmezí
2,8 – 4,0 %.
 U pacienta s diabetes mellitus
(cukrovkou) se rozlišují 3 stupně
kompenzace:
Stupeň kompenzace Hodnota HbA1c
 Výborná kompenzace do 4,5 %
 Uspokojivá kompenzace 4,5% - 6,0%
 Neuspokojivá kompenzace nad 6,0%
NOVÁK, Jan. Biochemie I.
Brno: Muni, 2009, s..13
HEMOGLOBINCH2NH2
C
C
C
C
C
CH2OH
O
H OH
OH H
H OH
H OH
H
glukosa
+
neenzymová reakce
irreversibilní
H2O
C
C
C
C
C
CH2OH
N
H OH
OH H
H OH
H OH
H CH2
aldimin
(labilní)
HEMOGLOBIN
Amadoriho
přesmyk
C
C
C
C
C
CH2OH
NH
O
OH H
H OH
H OH
H
CH2
H
glykovaný hemoglobin
(ketoamin; aminoderivát fruktosy)
HEMOGLOBIN
Porfyrie – poruchy syntézy hemu
• vrozené nebo získané
• klasifikace podle defektního enzymu biosyntézy
• prekurzory hemu (porfyrinogeny) se hromadí v těle
(kůže) a jsou vylučovány močí nebo stolicí (tmavé
zbarvení)
• neuropsychické poruchy, fotosenzitivita
Thalasémie – heterogenní skupina chorob
s poruchou syntézy α- nebo β-globinu
• α-thalasémie vzniká při deleci genu pro α-globin
• β-thalasémie vzniká při bodové mutaci jednoho genu
pro β-globin
• ery jsou více náchylné k destrukci → anémie
• jsou časté v oblastech endemického výskytu malárie –
heterozygóti thalasémie jsou vůči malárii odolnější
• vyšetření Hb (DNA diagnostika) se provádí v rizikových
zemích u novorozenců a jako předsňatkové vyšetření
Syntéza hemoglobinu
• probíhá v erytroblastech v kostní dřeni,
ne v erytrocytech!
• 4 jednotlivé podjednotky (globiny) jsou spojeny
nekovalentními vazbami → tetramer
Biochemie-3-2-Hb-Myo 34
ZÁKLADNÍ PRINCIPY
STRUKTURY A FUNKCE
HEMOGLOBIN:
Transport O2 krev-tkání, jen v
erytrocytech (RBC), váže O2
reverzibilně, saturace při vys
konc. O2, O2 se uvolňuje při
nižším tlaku v tkáních, regulace
afinity Hb k O2
Charakteristika Myoglobinu a hemoglobinu
HEMOGLOBIN MYOGLOBIN
Funkce Transport O2 Zásoba O2
Umístění Pouze v erytrocytech Pouze v kosterním, srdečním
svalstvu
Afinita O2 v tkáních Nízká Vysoká
Afinita O2 v plicích Vysoká Vysoká
Závislost afinity na pO2 Ano Ne
Allosterická regulace Ano Ne
Kvarterní struktura Ano - tetramer Ne - monomer
MYOGLOBIN
Srdeční a kosterní svalstvo,
váže O2 více pevně než Hb, O2
pufr v tkáních, jinak hypoxii,
nemění afinitu k O2 s rostoucí
konc. O2
Protein Redoxní stav železa Funkce
Hemoglobin Fe2+
transport kyslíku krví
Myoglobin Fe2+
zásoba kyslíku ve svalech
Katalasa Fe2+
↔ Fe3+
rozklad peroxidu vodíku
Peroxidasy Fe2+
↔ Fe3+
rozklad peroxidů
Cytochromy Fe2+
↔ Fe3+
složky dýchacího řetězce
Cytochrom P-450 Fe2+
↔ Fe3+
hydroxylace
Desaturasy MK Fe2+
↔ Fe3+
desaturace MK
Biosyntéza hemu •
hlavně v kostní dřeni (Hb) a játrech (cytochromy)
• buněčná lokalizace: mitochondrie a cytoplazma
• substráty: sukcinyl-CoA + glycin
• významné meziprodukty:
 kys. -aminolevulová (= 5-aminolevulová, ALA)
 porfobilinogen (PBG = derivát pyrolu)
 uroporfyrinogen III (= porfyrinogen – prekurzor
hemu)
 protoporfyrin IX (= přímý prekurzor hemu)
● klíčový regulační enzym: ALA-syntáza
Kyselina δ-aminolevulová (ALA)
• syntéza hemu začíná v mitochondrii
• sukcinyl-CoA a Gly podléhají kondenzaci → ALA
• reakce je katalyzována enzymem ALA-syntázou
Obrázek převzat z knihy Harper´s Illustrated Biochemistry 26th ed./ R.K.Murray; McGraw-Hill
Companies, 2003, ISBN 0-07-138901-6.
Porfobilinogen (PBG)
• ALA je transportována z mitochondrie do cytoplasmy
• kondenzace 2 molekul ALA → porfobilinogen
• reakce je katalyzována porfobilinogen syntázou
(ALA-dehydratáza)
Obrázek převzat z knihy Harper´s Illustrated Biochemistry 26th ed./ R.K.Murray; McGrawHill
Companies, 2003, ISBN 0-07-138901-6.
Uroporfyrinogen → koproporfyrinogen III
• enzym hydroxymethylbilan syntáza katalyzuje spojení 4 molekul
PBG za vzniku uroporfyrinogenu III
• 4 zbytky kys. octové jsou dekarboxylovány na methylové zbytky
→ koproporfyrinogen III vstupuje do mitochondrie
Obrázek byl převzat z učebniceT. M. Devlin et al.: Textbook of Biochemistry With Clinical
Correlations, 4th ed., Wiley-Liss, Inc., New York, 1997.
Protoporfyrinogen IX → protoporfyrin IX
• protoporfyrin IX (obsahuje systém dvojných konjugovaných
vazeb) vzniká oxidací protoporfyrinogenu IX
Obrázek byl převzat z učebnice T. M. Devlin et al.: Textbook of Biochemistry With Clinical
Correlations, 4th ed., Wiley-Liss, Inc., New York, 1997.
Hem
• iont Fe2+ je inkorporován do protoporfyrinu IX
• reakce je katalyzována enzymem ferrochelatázou
(hemsyntázou)
Obrázek byl převzat z http://www.porphyrin.net/mediporph/_netbiochem/synthesis/
ferrochelatase.html
Regulace biosyntézy hemu
 Enzym ALA-syntáza je hlavní regulační enzym, který je
inhibován hemem na úrovni transkripce i allostericky.
ALA-syntáza vyžaduje přítomnost pyridoxalfosfátu.
Některá léčiva a steroidní hormony mohou zvyšovat
expresi genu pro ALA-syntázu.
 Enzym porfobilinogen syntáza je inhibován Pb2+ ionty v
případě otravy olovem.
 Enzym ferrochelatáza (hemsyntáza) je také inhibován
olovnatými ionty v případě otravy olovem.
Její aktivita je ovlivněna dostupností Fe2+ a kyseliny
askorbové.
Obrázek převzat z knihy: Color Atlas of Biochemistry / J. Koolman, K.H.Röhm. Thieme 2005. ISBN 3-13-100372-3
Degradace hemu
V lidském těle přibližně 100 – 200 mil. ery je degradováno
každou hodinu. Degradace začíná v endoplasm. retikulu
retikuloendoteliálních buněk RES (játra, slezina, kostní
dřeň a kůže).
Hb je degradován na:
● globiny → aminokyseliny → metabolismus
● hem → bilirubin
● Fe2+ → transport v komplexu s transferrinem a další
využití v biosyntéze hemu
Nejen Hb, ale i ostatní hemoproteiny obsahují hemové
skupiny, které jsou degradovány stejnou dráhou.
Přeměna hemu na bilirubin
Obrázek byl převzat z http://themedicalbiochemistrypage.org/heme-porphyrin.html
zelený
červenooranžový
Další osud bilirubinu (Bil)
Bilirubin (Bil) je uvolněn z RES do krve.
ALE! Bil je velmi špatně rozpustný v plasmě, a proto je v
krvi transportován ve vazbě na albumin („nekonjugovaný
Bil“ = „nepřímý Bil“).
↓
JÁTRA
V hepatocytech, Bil je konjugován se 2 molekulami kys.
glukuronové → bilirubin diglukosiduronát (rozpustný ve
vodě, „konjugovaný Bil“ = „přímý Bil“)
↓
ŽLUČ
↓
STŘEVO
Bil je redukován na urobilinogen a sterkobilinogen
bilirubin-diglukosiduronát = konjugovaný bilirubin
je rozpustný ve vodě → tzv. „přímý bilirubin“
Obrázek byl převzat z http://themedicalbiochemistrypage.org/heme-porphyrin.html
Ve střevě:
Urobilinogen a sterkobilinogen mohou být:
a) reabsorbovány a vracejí se zpět do jater (enterohepatální cirkulace)
b) oxidovány (v přítomnosti O2) na barviva urobilin (oranžový) a
sterkobilin (žlutý) → jsou vylučovány ve stolici
Urobilinogen (UBG) se také vyskytuje v moči.
Žlučová barviva
• bilirubin
• urobilin
• sterkobilin
Obrázek převzat z knihy: Color Atlas of Biochemistry / J. Koolman, K.H.Röhm. Thieme 2005.
Stanovení bilirubinu v séru
● Bil reaguje přímo s barvivy, jakmile jsou přidány do vzorku séra
→ konjugovaný bilirubin = přímý bilirubin (do 3.4 µmol/l)
• volný Bil nereaguje s barvivy dokud není přidán alkohol
(methanol) nebo kofein do vzorku séra. Stanovení tohoto typu
bilirubinu je nepřímé → nekonjugovaný bilirubin = nepřímý
bilirubin
• celkový bilirubin zahrnuje oboje - nekonjugovaný a konjugovaný
Bil (do 17 µmol/l)
52
Železo je vázáno v tetrapyrrolovém kruhu tak, že
formálně byla dvě pyrrolová jádra zbavena na svých
dusících H+. Takto vznikl na každém ze dvou dusíků
volný elektronový pár. Dvojice elektronů je využita
(na každém z obou jader) k vytvoření dativní kovalentní
vazby s Fe2+.
Fe2+ zároveň přináší do molekuly hemu 2 kladné náboje,
„ztracené“ při odnětí 2 H+.
Hem v hemoglobinu je tedy elektricky neutrální a váže
také elektricky neutrální molekuly (O2 , CO).
Oxidace železa na Fe3+ ( hemiglobin, methemoglobin)
vede k získání 1 kladného náboje v molekule hemu.
Hem pak jako kation váže anionty (např. CN-, ale nemůže
už vázat elektricky neutrální molekuly – není tedy schopen
přenášet kyslík).
Tyto skutečnosti jsou významné mj. pro toxikologii.
Železo v hemu - poznámka
53
ferro- → ferrosi- → Fe2+
~ hemo- (hemoglobin)
ferri- → Fe3+
~ hemi- (hemiglobin)
Názvosloví :
54
55
ferrosi- ferri-