Enzymy
ZÁKLADY ENZYMOLOGIE – ENZYMOVÁ KINETIKA
Biochemie_3_1_enzymy 1
Dvě základní podmínky života
1. Živé organizmy musí být schopné samoreplikace
2. Organizmy musí být schopné katalyzovat
chemické reakce efektivně a selektivně
Biochemie_3_1_enzymy 2
3
Obecné vlastnosti enzymů
• proteiny
• biokatalyzátory
• specifické (vzhledem k substrátu i účinku)
• vysoce účinné
• fungují za mírných podmínek
• mohou být regulovány
• in vitro – citlivé na vnější podmínky
Biochemie_3_1_enzymy
4
Enzymy jsou různé proteiny
• jednoduché proteiny
• s kovalentně navázanou prostetickou skupinou
• metaloenzymy (viz přednáška Enzymy II)
• oligomerní, multienzymové komplexy
• asociované s membránami
• různá distribuce v těle i v buňce
• tvoří izoformy (izoenzymy)
Biochemie_3_1_enzymy
5
Enzymové markery subcelulárních frakcí
Frakce Enzym Typ enzymu Funkce enzymu
Pl. membrána
Jádro
ER
ER
GA
Lyzosom
Mitochondrie
Peroxisom
Cytosol
Na+/K+-ATPasa
DNA/RNA-polymerasa
Glc-6-fosfatasa
cyt-b5-reduktasa
galaktosyltransferasa
kys. fosfatasa
sukcinátdehydrogenasa
katalasa
laktátdehydrogenasa
hydrolasa
transferasa
hydrolasa
oxidoreduktasa
transferasa
hydrolasa
oxidoreduktasa
oxidoreduktasa
oxidoreduktasa
transport iontů
syntéza DNA/RNA
hydrolýza Glc-6-P
desaturace MK
synt. glykoproteinů
hydrolýza fosfoesterů
sukcinát  fumarát
rozklad H2O2
laktát  pyruvát
výzkum
Biochemie_3_1_enzymy
6
Enzymy jsou vysoce účinné katalyzátory
• snižují aktivační energii  urychlují reakce
• účinnost o mnoho řádů vyšší než u jiných katalyzátorů
• reakce s enzymem jsou o 106-1014 rychlejší než bez enzymu
• nemají vliv na rovnovážnou konstantu K
• z reakce vycházejí nezměněny
• poměrně málo stabilní
Kdyby reakce v biol. systémech nebyly katalyzovány enzymy, byly by tak pomalé,
že by nemohly zajistit existenci živé hmotyBiochemie_3_1_enzymy
7
Enzymy fungují za mírných podmínek
• za atmosférického tlaku
• úzké rozmezí teplot - kolem 37 °C
• nad 50 °C většinou denaturovány
• úzké rozmezí pH  pH optimum
Biochemie_3_1_enzymy
8
Existuje možnost regulace
Aktivita enzymu
• aktivátory
• inhibitory
• kovalentní modifikace
(fosforylace)
Množství enzymu
• regulace
proteosyntézy a
proteolýzy enzymu
• některé hormony –
induktory × represory
Biochemie_3_1_enzymy
9
Specifičnost enzymů je dvojí
Účinková
• z možných reakcí
substrátu katalyzují
pouze jedinou
REAKCI
Substrátová
• z možných substrátů pro
určitou reakci si vybírají
jediný (nebo jedinou
skupinu substrátů)
• často stereospecifické
Biochemie_3_1_enzymy
10
Enzymy jsou stereospecifické katalyzátory
existují dva typy přeměn:
• achirální substrát  chirální produkt(jeden enantiomer)
např. pyruvát  L-laktát, fumarát  L-malát
• chirální substrát(jeden enantiomer)  produkt
L-alanin  pyruvát (D-alanin nereaguje)
D-glukosa   pyruvát (L-glukosa nereaguje)
chirální signální molekula  komplex s receptorem  biologická odpověď
chirální léčivo(ant)agonista  komplex s receptorem  farmakologická odpověď
Biochemie_3_1_enzymy
11
Hydrogenace pyruvátu in vitro
adice vodíku na planární substrát z obou stran
H
C C
CH3
O
O
HO
H
C
COOH
CH3
HHO + C
COOH
CH3
OHH
L-laktát + D-laktát
Existuje statisticky stejná pravděpodobnost přístupu reagentu z obou stran
planárního substrátu – proto vznikne racemát
Biochemie_3_1_enzymy
12
Hydrogenace pyruvátu in vivo (anaerobní glykolýza)
adice vodíku na planární substrát pouze z jedné strany
H
C C
CH3
O
O
HO
C
COOH
CH3
HHO
enzym
L-laktát
vzniká jediný
stereoizomer
Biochemie_3_1_enzymy
13
Hydrogenace D-fruktosy in vitro poskytne směs epimerů
CH2OH
C
C
O
C
HO H
C
H OH
CH2OH
OHH
CH2OH
C
C
C
HO H
C
H OH
CH2OH
OHH
OHH
CH2OH
C
C
C
HO H
C
H OH
CH2OH
OHH
HHO
2H
+
D-fruktosa D-glucitol D-mannitol
reakční centrum je planární
in vivo enzymová hydrogenace: pouze jeden produkt (D-glucitol)Biochemie_3_1_enzymy
14
Příklad: neenzymová hydratace fumarátu
C
C
COOHH
HOOC H
H
H
O
H
H
O
adice z pravé
strany
C
COOH
CH2COOH
OHHC
COOH
CH2COOH
HHO
adice z levé
strany
L-malát D-malát
in vitro vznikne racemický D,L-malát
fumarát
Biochemie_3_1_enzymy
15
Enzymová hydratace fumarátu (CC)
C C COOH
H
H
HOOC
H
O
H
Enzym
Substrát
in vivo vznikne pouze jeden enantiomer (L-malát)
Reagent
Biochemie_3_1_enzymy
16
Vazba chirálního substrátu (léčiva) do aktivního místa enzymu nebo
receptoru
R R
x
aktivní enantiomer neaktivní enantiomer
R
x
chirální substrát
vazebná
místa enzymu
účinné léčivo
neúčinné léčivo
viz také
LCH II, str. 13
Biochemie_3_1_enzymy
17
Názvosloví enzymů
Triviální
• přípona -in, -asa
• pepsin, trypsin
• amylasa, lipasa
• doporučené triviální
názvy
Systémové
• přípona -asa
• název obsahuje
informaci o:
1. substrátu
2. typu reakce
Biochemie_3_1_enzymy
18
Příklady názvů
• Doporučený triviální název: alkoholdehydrogenasa
• Systémový název: EC 1.1.1.1 ethanol:NAD+-oxidoreduktasa
• Reakce: ethanol + NAD+  acetaldehyd + NADH + H+
• Doporučený triviální název: alaninaminotransferasa (ALT)
• Systémový název: EC 2.6.1.2 L-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferasa
• Reakce: L-alanin + 2-oxoglutarát  pyruvát + L-glutamát
Biochemie_3_1_enzymy
19
Klasifikace enzymů:
šest tříd podle typu reakce
1. oxidoreduktasy
2. transferasy
3. hydrolasy
4. lyasy
5. isomerasy
6. ligasy
Každá třída má další podtřídy
Biochemie_3_1_enzymy
TEST
20
1 Oxidoreduktasy
• katalyzují oxidaci nebo redukci substrátu
podtřídy:
• dehydrogenasy katalyzují transfer 2 H atomů
• oxygenasy katalyzují zabudování jednoho nebo dvou O atomů do
substrátu (monooxygenasy, dioxygenasy)
• oxidasy katalyzují transfer elektronů mezi substráty
(cytochrom-c-oxidasa, ferroxidasa)
• peroxidasy katalyzují rozklad peroxidů
Příklad: ethanol + NAD+  acetaldehyd + NADH + H+
Doporučený název: alkohol dehydrogenasa
Systematický název: ethanol:NAD+ oxidoreduktasa
Biochemie_3_1_enzymy
21
2 Transferasy
• katalyzují transfer skupiny za jednoho substrátu na druhý
Podtřídy:
• aminotransferasy, methyltransferasy, glukosyltransferasy
• fosfomutasy - transfer skupiny PO3
2– v rámci jedné molekuly
• kinasy - fosforylace substrátů = transfer fosforylu PO3
2– z ATP
na substrát (hexokinasy, proteinkinasy).
Příklad: glukosa + ATP  glukosa-6-P + ADP
Doporučený název: glukokinasa
Systematický název: ATP:D-glukosa fosfotransferasa
Biochemie_3_1_enzymy
22
Příklad: Fosforylace glukosy
O OH
OH
OH
OH
HO
O OH
OH
OH
OH
O
P
O
O
O
glukokinasa
+ ATP + ADP
glukosa glukosa-6-fosfát
Biochemie_3_1_enzymy
23
Příklad: glukosa-6-P + H2O  glukosa + Pi
Doporučený název: glukosa-6-fosfatasa
Systematický název: glukosa-6-fosfát fosfohydrolasa
3 Hydrolasy
• katalyzují hydrolytické štěpení esterů, glykosidů, amidů, peptidů apod.
podtřídy:
• esterasy (lipasy, fosfolipasy, ribonukleasy, fosfatasy)
• glykosidasy (sacharasa, maltasa, amylasa)
• proteinasy a peptidasy (pepsin, trypsin, kathepsiny,
dipeptidasy, karboxypeptidasy, aminopeptidasy)
• amidasy (glutaminasa, asparaginasa)
• ATPasy (štěpí anhydridové vazby v ATP)
Biochemie_3_1_enzymy
24
Příklad: Fosfatasa
O OH
OH
OH
OH
HO
O OH
OH
OH
OH
O
P
O
O
O
glukosaglukosa-6-fosfát
+ H2O OH
P
O
O
O
+
glukosa-6-fosfatasa
Biochemie_3_1_enzymy
25
Srovnejte
Enzym Serin OH Enzym Serin O P
O
O
O
ATP ADP
H2O
P
O
O
OHO
kinasa
fosfatasa
Biochemie_3_1_enzymy
26
Hydrolasy štěpí vazby vzniklé kondenzací
Hydrolasa Typ štěpené vazby
Glukosidasa
Galaktosidasa
Hyaluronidasa
Arylsulfatasa
Lysozym
Kathepsin
Kolagenasa
Elastasa
Ribonukleasa
Lipasa
Fosfatasa
Ceramidasa
glykosidová
glykosidová
glykosidová
sulfoesterová
glykosidová
peptidová
peptidová
peptidová
fosfodiesterová
esterová
fosfoesterová
amidová
Biochemie_3_1_enzymy
27
Jazyková poznámka: lysozym × lyzosom
Lysozym je enzym
• složenina, lyso (řec. lysis štěpit) + zym (od enzym)
• hydrolasa, glykosidasa, štěpí β-1,4-glykosidovou vazbu
v bakteriálních mukopolysacharidech
• ve slinách, slzách, sekretech apod.
Lyzosom (lysosom) je organela
• složenina, z řečtiny, lysis – štěpit, soma – tělo
• typická pro živočišné buňky
• kyselé pH, obsahuje četné kyselé hydrolasy
Biochemie_3_1_enzymy
28
4 Lyasy
• katalyzují nehydrolytické štěpení nebo vznik vazeb C–C, C–O, C–N, C–S
odstraněním (nebo přidáním) malé molekuly jako H2O, CO2, NH3
• amoniak lyasy (histidinamoniaklyasa – histidasa)
• dekarboxylasy (karboxylyasy)
• aldolasy (štěpení nebo vznik aldolu)
• (de)hydratasy (karbonátdehydratasa, enolasa)
• synthasy (citrátsynthasa)
Příklad: fumarát + H2O  L-malát
Doporučený název: fumarát hydratasa
+ H2O
COOH
C H
CH2
HO
COOH
C
C
COOHH
HOOC H
Biochemie_3_1_enzymy
29
5 Isomerasy
• katalyzují intramolekulární přesmyky
příklady:
• epimerasy
• racemasy
• mutasy
Příklad: UDP-glukosa  UDP-galaktosa
Doporučený název: UDP-glukosa 4-epimerasa
Biochemie_3_1_enzymy
30
6 Ligasy
• katalyzují vznik vazeb C–C, C–O, C–N za současného štěpení ATP
příklady:
• karboxylasy
• synthetasy (např. glutaminsynthetasa)
• POZOR: odlišujte od synthasy (skupina 4)
Příklad: Pyruvát + CO2 + ATP + H2O  oxalacetát + ADP + Pi
Doporučený název: pyruvátkarboxylasa
Biochemie_3_1_enzymy
31
Tři enzymy „mají něco“ s fosfátem
Enzym (Třída) Schéma reakce / Typ reakce
Kinasa
(Transferasa)
substrát-OH + ATP  substrát-O-P + ADP
fosforylace = transfer fosforylu z ATP na substrát
Fosfatasa
(Hydrolasa)
substrát-O-P + H2O  substrát-OH + Pi
hydrolýza fosfoesterové vazby
Fosforylasa
(Transferasa)
(glykogen)n + Pi  (glykogen)n-1 + glukosa-1-P
fosforolýza = štěpení O-glykosidové vazby fosfátem =
transfer glukosylu na anorganický fosfát
!
Biochemie_3_1_enzymy
32
Rozlišujte: Lýza třikrát jinak
Hydrolýza
štěpení substrátu vodou, velmi časté v GIT, např.:
sacharosa + H2O  glukosa + fruktosa
(škrob)n + H2O  maltosa + (škrob)n-2
Fosforolýza
štěpení O-glykosidové vazby fosfátem:
(glykogen)n + Pi  (glykogen)n-1 + glukosa-1-P
Thiolýza
štěpení vazby C-C sírou z koenzymu A (skupina –SH)
při β-oxidaci MK nebo štěpení ketolátek,
RCH2COCH2CO-SCoA + CoA-SH  RCH2CO-SCoA + CH3CO-SCoA
!
Biochemie_3_1_enzymy
33
Kofaktory enzymů
• nízkomolekulární neproteinové sloučeniny
• přenášejí 2 H nebo e-  oxidoreduktasy
• přenášejí skupiny  transferasy
• pevně vázané - prostetická skupina
• volně vázané - koenzymy (kosubstráty)
Biochemie_3_1_enzymy
TEST
34
Tři různé složky v enzymové reakci
enzym
substrát kofaktor  produkt kofaktormodif+ +
1. substrát(y) – nízkomolekulární
2. kofaktor – nízkomolekulární
3. enzym – vysokomolekulární, koordinuje a urychluje reakci
přímo spolu reagují
Pozn.: některé reakce probíhají bez kofaktoru (např. hydrolýzy),
substráty mohou být i vysokomolekulárníBiochemie_3_1_enzymy
35
Oxidovaná forma Redukovaná forma Funkce kofaktoru
NAD+
NADP+
FAD
Dihydrobiopterin (BH2)
Molybdopterinoxid
Lipoát
Ubichinon (Q)
Hem-Fe3+
Nehem-S-Fe3+
Glutathionoxid (G-S-S-G)
NADH+H+
NADPH+H+
FADH2
tetrahydrobiopterin (BH4)
molybdopterinred
dihydrolipoát
ubichinol (QH2)
hem-Fe2+
nehem-S-Fe2+
glutathionred (GSH)
NAD+ akceptor 2 H
NADPH+H+ donor 2 H
FAD akceptor 2 H
BH4 donor 2 H
přenos elektronů
přenos H + acylu
přenos 2 elektronů a 2 H+
přenos 1 elektronu
přenos 1 elektronu
2 GSH donor 2 H
Kofaktory oxidoreduktas
Biochemie_3_1_enzymy
36
NAD+ je dehydrogenační činidlo
• nikotinamidadenindinukleotid
• kofaktor dehydrogenas
• odnímá 2H ze substrátu
• jeden se jako hydridový anion H- aduje do ppolohy
pyridiniového kruhu
• druhý se jako proton H+ váže na enzym
2 H = H– + H+
Biochemie_3_1_enzymy
37
Struktura NAD+
O
OH O
N
CONH2
CH2 O P O P O
OH
O O
OH
CH2
H O
OH OH
N
N
N
N
NH2adenin
pyridinium
ribosa
difosforečná kys.
adice hydridového aniontu
N-glykosidová
vazba
ester
anhydrid
ester
ribosa
N-glykosidová
vazba
Biochemie_3_1_enzymy
38
N
CONH2
H
N
CONH2
HH
oxidovaná forma
aromatický kruh
kladný náboj na N
redukovaná forma
aromaticita porušena
elektroneutrální
H
Redoxní pár kofaktoru
oxidovaná forma NAD+ redukovaná forma NADH
aromatický kruh aromaticita zcela porušena
čtyřvazný dusík trojvazný dusík
kladný náboj na dusíku neutrální sloučenina
vysoký obsah energie
Biochemie_3_1_enzymy
39
Dehydrogenace působením NAD+
• substrát ztrácí 2 atomy H ze skupin:
• primární alkoholová skupina -CH2-OH
• sekundární alkoholová skupina >CH-OH
• sekundární aminová skupina >CH-NH2
• vzniká dvojná vazba (C=O, C=N)
Biochemie_3_1_enzymy
40
Typické NAD+ dehydrogenace
Substrát Produkt
primární alkohol
sekundární alkohol
aldehyd hydrát
hemiacetal
cyklický hemiacetal
hydroxykyselina
aminokyselina
aldehyd
keton
karboxylová kyselina
ester
lakton
oxokyselina
iminokyselina
Biochemie_3_1_enzymy
41
Dehydrogenace ethanolu
(alkoholdehydrogenasa)
H3C C
H
H
O
H
+ NAD H3C C
H
O
+ NADH+H
Biochemie_3_1_enzymy
42
Dehydrogenace glutamátu
(glutamátdehydrogenasa)
C HN
H
H
COOH
CH2
CH2
COOH
+ NAD
CHN
COOH
CH2
CH2
COOH
+ NADH + H
2-aminokyselina 2-iminokyselina
Biochemie_3_1_enzymy
43
NAD+-dependentní enzymy se nazývají také
pyridinové dehydrogenasy
• Citrátový cyklus:
isocitrátdehydrogenasa
2-oxoglutarátdehydrogenasa
malátdehydrogenasa
• Glykolýza:
glyceraldehyd-3-P
dehydrogenasa
laktátdehydrogenasa
• Oxidace ethanolu:
alkoholdehydrogenasa
acetaldehyddehydrogenasa
Biochemie_3_1_enzymy
44
Redukovaný kofaktor NADPH+H+ je hydrogenační činidlo
• donor 2H při hydrogenaci
• kofaktor redukčních syntéz (MK, cholesterol)
• regenerace GSH v erytrocytech !
• kofaktor hydroxylačních reakcí:
cholesterol   žlučové kyseliny
kalciol   kalcitriol
xenobiotikum  hydroxylované xenobiotikum
• obecné schéma hydroxylace:
R-H + O2 + NADPH+H+  R-OH + H2O + NADP+
Biochemie_3_1_enzymy
45
FAD je dehydrogenační činidlo
• flavinadenindinukleotid
• kofaktor flavinových dehydrogenas
• dehydrogenace -CH2-CH2- skupiny
• 2H se vážou na dva dusíky riboflavinu
Biochemie_3_1_enzymy
46
Struktura FAD
N
N N
NH
H3C
H3C
O
O
CH2
CH OH
CH
CH
OH
OH
CH2 O P O
OH
O
P
OH
O
O
CH2
O
OH OH
N
N
N
N
NH2
dimethylisoalloxazin
ribitol
adenin
ribosadifosfát
Biochemie_3_1_enzymy
oxidovaná forma FAD redukovaná forma FADH2
aromatický systém aromaticita částečně porušena
neutrální sloučenina neutrální sloučenina
vysoký obsah energie
47
N
N
N
NO
O
CH3
CH3
H
oxidovaná forma redukovaná forma
N
N
N
NO
O
CH3
CH3
H
H
H
1
10
Redoxní pár kofaktoru
Biochemie_3_1_enzymy
48
Dehydrogenace sukcinátu na fumarát
(flavinová dehydrogenasa)
COOH
CH2
CH2
COOH
+ FAD
C
C
COOHH
HOOC H
+ FADH2
Biochemie_3_1_enzymy
49
Tetrahydrobiopterin (BH4)
je hydrogenační činidlo
• kofaktor hydroxylačních reakcí
• poskytuje 2H na atom O za vzniku vody
• oxiduje se na chinoidní dihydrobiopterin
Biochemie_3_1_enzymy
50
Dehydrogenace tetrahydrobiopterinu
N
N
N
NN
O
CH3
OH
OH
H
H
H
H
H
- 2H
H
H
N
N
N
NHN
O
CH3
OH
OH
tetrahydrobiopterin
(BH 4)
dihydrobiopterin
(BH 2)
chinoidní
Biochemie_3_1_enzymy
51
Hydroxylace fenylalaninu
COOH
CHH2N
CH2
H
+ O O + BH4
COOH
CHH2N
CH2
OH
+ +H2O BH2
fenylalanin tyrosin
Biochemie_3_1_enzymy
52
Koenzym Q (ubichinon)
• derivát 1,4-benzochinonu
• součást dýchacího řetězce
• postupně přijímá elektron a proton (2x)
• redukuje se na semiubichinon a ubichinol
O
O
CH3
O
CH3
O
CH3
CH3
CH3 CH3 CH3
Biochemie_3_1_enzymy
53
Reverzibilní hydrogenace ubichinonu
O
O
CH3
RH3CO
H3CO
OH
O
e H+e H+
OH
OH
ubichinon semiubichinon ubichinol
R = polyisoprenoidní řetězec  lipofilní charakter
elektron (e-) a proton (H+) mají různý původ: elektron pochází z red.
kofaktorů (=živin), H+ z matrix mitochondrie
nemá arom. kruh arom. kruh + radikál difenol
Q  •OH  QH2
Biochemie_3_1_enzymy
54
Hem cytochromů
• přenáší 1 elektron
• cytochromy jsou hemoproteiny, složky DŘ
• nastává reverzibilní přechod mezi Fe2+ a Fe3+
N N
NN
Fe 2+
N N
NN
Fe 3+
Biochemie_3_1_enzymy
55
Nehemové železo - klastr Fe2S2
S
Fe
S
S
Fe
S
S
S
CysCys
Cys Cys
3+ 3+
oxidovaný stav redukovaný stav
S
Fe
S
S
Fe
S
S
S
CysCys
Cys Cys
3+ 2+
+ e
- e
Jen jeden ion železa mění své oxidační číslo
Biochemie_3_1_enzymy
56
Molybdopterin
• na pteridinovém systému navázán heterocyklus s
molybdenem
• strukturní vzorec – viz semináře
• kofaktor oxygenas
• např. xanthinoxidasa, sulfitoxidasa
Biochemie_3_1_enzymy
57
Xanthinoxidasa: oxygenace purinu
N
N
N
N
OH
H
N
N
N
N
OH
HO
H
N
N
N
N
OH
HO OH
H
hypoxanthin  xanthin  močová kys.
Biochemie_3_1_enzymy
58
Sulfitoxidasa: vznik síranového aniontu
cystein
HSO3
- + H2O  SO4
2- + 3 H+ + 2 eplazma
(0,5 mmol/l)
moč
okyselují ECT
redukují Mo
(viz také semináře str. 46)
Biochemie_3_1_enzymy
59
Lipoát
• cyklický disulfid (-S-S-)
• 1,2-dithiolan-3-pentanová kyselina
• amidová vazba na lysin enzymu
• přijetím 2H vzniknou dvě -SH skupiny
• součást komplexní oxidační dekarboxylace 2oxokyselin
(pyruvát, 2-OG)
Biochemie_3_1_enzymy
60
Hydrogenace lipoátu
S S
CONH Lys Enzym
2H
CONH Lys Enzym
SS
H H
lipoát
dihydrolipoát
Biochemie_3_1_enzymy
61
Glutathion (GSH)
• tripeptid
• γ-glutamylcysteinylglycin
• kofaktor glutathionperoxidasy (obsahuje selenocystein)
• redukce H2O2 na vodu
• 2 G-SH + H-O-O-H  G-S-S-G + 2 H2O
Sloučeniny s -SH skupinou mají redukční vlastnosti
Biochemie_3_1_enzymy
62
Dehydrogenace dvou molekul GSH
HOOC
N
N COOH
O
H
CH2
S
O
H
NH2
N
NHOOC
O
H
CH2
S
O
H
NH2
COOH
HOOC
N
N COOH
O
H
CH2
SH
O
H
NH2
2 - 2H
Biochemie_3_1_enzymy
63
Vitamin Kofaktor Přenášená skupina
(vzniká v těle)
(vzniká v těle)
Listová kys.
Biotin
Thiamin
Pyridoxin
Pantothenová kys.
(vzniká v těle)
[Methionin]
Kyanokobalamin
ATP
PAPS
H4-folát
karboxybiotin
thiamindifosfát
pyridoxalfosfát
CoA-SH
dihydrolipoát
SAM
methylkobalamin
-PO3
2-
-SO3
2C1
skupiny
CO2
tzv. aktivní aldehyd
-NH2
acyl
acyl
-CH3
-CH3
Vitaminy a kofaktory transferas
Biochemie_3_1_enzymy
64
Pyridoxalfosfát je kofaktor transaminas
R CH
NH2
COOH
N
CH2O
H3C
HO
C
OH
P
OH
O
OH
vzniká aldimin (Schiffova báze)
Biochemie_3_1_enzymy
65
Schéma dvou fází transaminace
(modrá barva ukazuje pohyb atomu dusíku)
C
OH
CH2NH2
HOOC C
O
CH2CH2COOH
- H2O
H2O
HOOC CH CH2CH2COOH
NH2
2-oxoglutarát glutamát
pyridoxamin pyridoxal
aminokyselina
oxokyselina
CH
NH2
COOHR R C COOH
CH2
N
R CH COOH
CH
N H2O
R C
O
COOH
CH2NH2
C
OH - H2O
pyridoxal pyridoxamin
Schiffova báze
Biochemie_3_1_enzymy
66
ATP (adenosintrifosfát)
význam je dvojí:
1. makroergní sloučenina
2. kofaktor kinas – fosforylační činidlo
Biochemie_3_1_enzymy
67
Struktura ATP
N
N
N
N
NH2
O
OHOH
OP
O
O
OP
O
O
O
P
O
O
O N-glykosidová
vazba
ester
anhydrid
Biochemie_3_1_enzymy
68
Fosforylace substrátu
OH P
O
O
O O
O
O
P RibO
O
O
P O
Ade
+
ATP (4-)substrát
kinasa
++
fosforylovaný substrát (2-) ADP (3-)
P
O
O
O RibO
O
O
P O
Ade
HO P
O
O
O
Biochemie_3_1_enzymy
69
PAPS je sulfatační činidlo
N
N
N
N
NH2
O
OHO
CH2
P
O
O O
OPO
O
O
S
O
O
O
• 3’-fosfoadenosin-5’-fosfosulfát
• smíšený anhydrid H2SO4 a H3PO4
• esterifikace –OH skupin kys. sírovou
• sulfatované sfingoglykolipidy a
glykosaminoglykany
(chondroitin sulfát, keratan sulfát)
Biochemie_3_1_enzymy
70
Karboxybiotin
• kofaktor karboxylačních reakcí
• karboxylace biotinu vyžaduje ATP
N NH
S
O
COOH
C
O
HO
HN NH
S
O
COOH
CO2 ATP
ADP + P
biotin karboxybiotin
Biochemie_3_1_enzymy
71
Karboxybiotin je kofaktor
karboxylačních reakcí
N NH
S
O
COOH
C
O
HO
Biotin COOH
H3C C
O
COOH
Biotin H
CH2 C
O
COOHHOOC
pyruvát oxalacetát
pyruvátkarboxylasa
+
Biochemie_3_1_enzymy
72
Rozlišujte: Dekarboxylace vs. Karboxylace
Kofaktor Dekarboxylace
Thiamin-diP
pyruvát  acetyl-CoA + CO2
2-oxoglutarát  sukcinyl-CoA + CO2
Pyridoxal-P aminokyselina  amin + CO2
Žádný acetoacetát  aceton + CO2 (neenzymová, spontánní)
Kofaktor Karboxylace
Biotin
pyruvát + CO2 + ATP  oxalacetát
acetyl-CoA + CO2 + ATP  malonyl-CoA
propionyl-CoA + CO2 + ATP  methylmalonyl-CoA  sukcinyl-CoA
karboxylace (+ ATP) během katabolismu Val, Leu, Ile
Fylochinon
(vitamin K )
protein-Glu + O2 + fylochinonred + CO2  protein-γ-karboxyGlu
posttranslační karboxylace glutamátu, srážení krve
Žádný Hb-NH2 + CO2  Hb-NH-COOH (nestabilní Hb-karbamát, spontánně)
!
Biochemie_3_1_enzymy
73
Koenzym A (CoA-SH)
• přenáší acyly
• vázané na atom síry
• thioesterová vazba
• acyl-CoA je aktivovaný acyl
• např. acetyl-CoA
R C
O
Biochemie_3_1_enzymy
74
Koenzym A
HO
P
O
O
OCH2C
HS CH2 CH2 HN
O
C CH2 CH2 HN
O
C CH
CH3
CH3
O
O
OP
O
NH2
N
N
N
N
O
O
O
P O CH2
OH
O
cysteamin
beta-alanin
pantothenov á
kyselina
vazba acylu
pantoová
kyselina
Biochemie_3_1_enzymy
75
Dihydrolipoát (dihydrolipoamid)
součást komplexní oxidační dekarboxylace 2-oxokyselin
pyruvátdehydrogenasa
2-oxoglutarátdehydrogenasa
oxiduje aktivovaný aldehyd (na TDP) a přenáší acyl jako thioester na koenzym A:
S S
CO–NH–Lys–Enzym
Lipoamid
(oxidovaná forma)
S-Acyldihydrolipoamid
(redukovaná forma)
S
H
CO–NH–Lys–Enzym
S
H
S
H
CO–NH–Lys–Enzym
S
R-CO
– 2 H
R1-CH–TDP
OH
CoA-SH
R-CO–S-CoA
Dihydrolipoamid
(redukovaná forma)
H–TDP
Biochemie_3_1_enzymy
76
S-Adenosylmethionin (SAM)
• „aktivní methyl“, trojvazná síra  sulfoniový kation
• kofaktor methylačních reakcí:
ethanolamin → cholin
guanidinacetát → kreatin
noradrenalin → adrenalin
• z methioninu vzniká homocystein
• pro remethylaci homocysteinu je nutný methyl-FH4 a B12 kofaktor
Biochemie_3_1_enzymy
77
S-Adenosylmethionin (SAM)
N
N
N
N
NH2
O
OHOH
S
CH3
HOOC CH
NH2
CH2CH2
Biochemie_3_1_enzymy
78
Kyselina listová je vitamin.
V těle je hydrogenována na 5,6,7,8-tetrahydrofolát (FH4)
N
N
N
NH2N
OH
CH2NH C NH
O
CH
COOH
CH2
CH2
COOHpteridin
p-aminobenzoová kys.
glutamová kys.
amid
5
6
7
8
přenos jednouhlíkatých skupin
105N
N
N
NH2N
OH
CH2NH C NH
O
CHCH2CH2COOH
COOH
H
H
Tetrahydrofolát (FH4) je kofaktor pro transfer C1 skupin
Biochemie_3_1_enzymy
79
C1 skupiny přenášené tetrahydrofolátem
Oxidační
číslo C
Vzorec Název Metabolický původ / Komentář
-III -CH3 methyl
redukce methylen-FH4,
methyl-FH4 spolupracuje s B12 při methylaci homocysteinu
-II -CH2- methylen
serin, glycin
syntéza dTMP  DNA
-I -CH= methenyl
deaminace formimino-FH4 (z histidinu)
syntéza purinových bází
+I -CH=O formyl
tryptofan  formiát  formyl
syntéza purinových bází
+I -CH=NH formimino histidin
viz schémata:
Semináře, str. 26
Harper(CZ), str. 613
Biochemie_3_1_enzymy
80
B12 vitamin je kyano nebo hydroxokobalamin
R = CN nebo OH
korinový cyklus
hydroxokobalamin - terapie otravy kyanidy
váže kyanidové anionty na netoxický
kyanokobalaminBiochemie_3_1_enzymy
81
B12 kofaktor je methyl nebo deoxyadenosylkobalamin,
je nutný pro dvě reakce v těle
• homocystein  methionin
• homocystein  propionyl-CoA  sukcinyl-CoA
• obě reakce na jedné stránce: Semináře, str. 45
B12
Biochemie_3_1_enzymy
82
Thiamin je vitamin B1
• kofaktor je thiamindifosfát (TDP)
• oxidační dekarboxylace pyruvátu, 2-oxoglutarátu (CC)
• pyruvát  acetyl-CoA, 2-oxoglutarát  sukcinyl-CoA (CC)
• transketolasová reakce v pentosovém cyklu
N
NH3C NH2
N
S
CH3
CH2CH2OH
Biochemie_3_1_enzymy
83
Thiamindifosfát (TDP) je kofaktorem
oxidační dekarboxylace pyruvátu
glukosa  pyruvát  acetyl-CoA
CC
TDP
vazba pyruvátu a jeho dekarboxylace
N
N
N
SH3C NH2
CH3
CH2CH2 O P
O
O
O P
O
O
O
Biochemie_3_1_enzymy