1 Enzymy II Mechanismus enzymové reakce, metaloenzymy, kinetika, aktivita, enzymy v lékařství Biochemie_3_2_enzymy_2 2 Aktivní místo enzymu • malá část molekuly, trojrozměrné uspořádání • hluboká štěrbina, povrchová prohlubeň • účastní se postranní řetězce AK vzdálených v primární struktuře • místo je skutečně aktivní - flexibilita proteinu umožňuje indukované přizpůsobení konformace, která odpovídá substrátu • substrát vázán relativně slabě Biochemie_3_2_enzymy_2 Mechanismy • -přiblížení a orientace • - acidobazická katalýza • pnutí a deformace (tranzitní stav, -lytické reakce) • kovalentní katalýza (přechodná kovalentní vazba mezi E a S1-S2) 4 hluboká, relativně hydrofobní kapsa hluboká kapsa se zbytkem Asp (záporný náboj) dva zbytky valinu tvoří ústí malé hydrofobní kapsy Příklad: Aktivní místa tří proteinas Určité postranní řetězce AK určují substrátovou specifitu Peptidové vazby přednostně štěpené: chymotrypsin – velkých hydrofobních AK (Phe, Trp), trypsin – delších kladně nabitých řetězcích (Arg, Lys), elastasa – malých hydrofobních skupinách (Gly, Ala). Biochemie_3_2_enzymy_2 5 SERINOVÉ PROTEASY Serin 195 Chymotrypsin, trypsin CYSTEINOVÉ PROTEINASY karboxypeptidasa A, thermolysin (bakterie) METALOPROTEINASY kathepsiny, papain ASPARTÁTOVÉ PROTEINASY Pepsin, renin Příklady proteinas • různé uspořádání aktivního místa • různá substrátová specifita • různý katalytický mechanismus Biochemie_3_2_enzymy_2 6 Vazba substrátu na enzym • vazba substrátu do aktivního místa vyvolá odpovídající konformační změnu molekuly enzymu – indukované přizpůsobení • vytvoří se komplex enzym-substrát (ES) Biochemie_3_2_enzymy_2 7 Katalytický mechanismus závisí na počtu substrátů • Monosubstrátové reakce S + E  { ES.......EP }  P + E • Dvousubstrátové reakce (častější) SA + SB  { ESAB.......EPAB }  PA + PB + E Sekvenční reakce: oba substráty se navážou na enzym a pak proběhne chemická přeměna a uvolnění produktů Ping-pongové reakce: typický pro aminotransferasy, jeden substrát se naváže, přemění a uvolní, pak totéž s druhým substrátem Biochemie_3_2_enzymy_2 8 Sekvenční reakce: uspořádané – substráty se vážou na E v definovaném pořadí nahodilé Ping-pongové reakce: + + + Biochemie_3_2_enzymy_2 9 Katalytické skupiny • k realizaci chemické přeměny v aktivním místě jsou použity tzv. katalytické skupiny • nukleofilní (cystein -SH, serin -OH) • kyselé (Asp, Glu), bazické (His, Arg, Lys) • acidobazický (transfer protonu) • přechodná kovalentní vazba • katalýza kovovým iontem (metaloenzymy) • elektrostatické interakce (bez vody) • deformace substrátu možné mechanismy Biochemie_3_2_enzymy_2 10 Příklad: aktivní místo chymotrypsinu Nukleofilní atak -OH serinu na karbonylový uhlík peptidové vazby  serinová proteasa N C O H His N N H Ser OH 195 57 zjednodušeno Biochemie_3_2_enzymy_2 11 Aktivní místo chymotrypsinu: rozštěpení peptidové vazby His N N H Ser O C O NH2 Biochemie_3_2_enzymy_2 12 Metaloenzymy • obsahují funkční kovové ionty, které se přímo účastní katalyzované reakce, ionty kovu vázány poměrně pevně (Enz-M) • některé enzymy potřebují ionty kovů pouze k aktivaci, v tom případě jsou vázány slabě (Enz …M), ionty dvojmocných kovů, Ca2+ (koagulační faktory), Mg2+ (kinasy) Biochemie_3_2_enzymy_2 13 Kation kovu je součástí ternárního komplexu • tři složky vytvářejí komplex: enzym (Enz), substrát (S) a kationt kovu (M) • různé typy (můstkových) komplexů Enz-S-M, Enz-M-S, někdy vznikají cyklické komplexy • do vakantních orbitalů mohou přijímat elektronový pár nukleofilu za vzniku -vazby • mohou tvořit cheláty s vhodnými skupinami enzymu či substrátu  deformace struktury  napětí, které usnadňuje chemickou přeměnu • koordinační sféra kovu působí jako trojrozměrný templát  stereospecifická kontrola možné mechanismy Biochemie_3_2_enzymy_2 14 Molybden • Součást některých oxidoreduktas • Součást kofaktoru – molybdopterin • Xanthinoxidasa (xanthin  kys. močová) • Sulfitoxidasa (HSO3 -  SO4 2-) Zdroje Mo: luštěniny, celozrnné obilniny Biochemie_3_2_enzymy_2 15 Zinek • Mnoho enzymů • Alkoholdehydrogenasa (ethanol + NAD+  acetaldehyd + NADH+H+) • Karbonátdehydratasa (H2O + CO2  H2CO3) • Karboxypeptidasy (štěpení polypeptidů od C-konce) • Cu, Zn-superoxiddismutasa (cytosolová izoforma) (2 •O2 - + 2 H+  O2 + H2O2) Zdroje Zn: červené maso, korýši, luštěniny, slunečnicová a dýňová semínka, celozrnné obilniny Biochemie_3_2_enzymy_2 16 Měď • Četné oxidoreduktasy • Ceruloplazmin (ferrooxidasa) (Fe2+  Fe3+) • Cytochrom-c-oxidasa (DŘ, přenos el. na O2) • Monoaminooxidasy (MAO, inaktivace biogenních aminů, vzniká H2O2, LCH II s. 60, Harper s. 565) • Dopaminhydroxylasa (dopamin  noradrenalin) • Lysyloxidasa (vyzrávání kolagenu, Lys  alLys) Zdroje Cu: játra, maso, kakao, luštěniny, ořechy Biochemie_3_2_enzymy_2 17 Mangan • Četné hydrolasy, dekarboxylasy, transferasy • Mn-superoxiddismutasa (mitochondriální izoforma) • Arginasa (Arg  močovina + ornithin) • Syntéza proteoglykanů + glykoproteinů Zdroje Mn: luštěniny, celozrnné obilniny, ořechy Biochemie_3_2_enzymy_2 18 Železo • Hemové enzymy, nehemové přenašeče • Katalasa (hem, H2O2  H2O + ½O2) • Myeloperoxidasa (hem, neutrofily) H2O2 + Cl- + H+  HClO + H2O • Cytochromy (hem, přenašeče elektronů v DŘ) • Fe-S proteiny (nehem, přenos elektronů v DŘ) Zdroje Fe: výrobky z vepřové, husí, kachní krve, (červené) maso, játra, žloutek, ořechy Biochemie_3_2_enzymy_2 19 Selen • Několik enzymů (redoxní reakce), Se je vždy v selenocysteinu • Glutathionperoxidasa (2 GSH + H2O2  2 H2O + G-S-S-G) • Dejodasy thyroninů (thyroxin T4  trijodthyronin T3) • Thioredoxin reduktasy (ribosa  deoxyribosa) • Selenoprotein P (plazma, antioxidační funkce ?) Zdroje Se: hlavonožci, mořské ryby, luštěniny Biochemie_3_2_enzymy_2 20 Základní pojmy z kinetiky • reakce: S  P (S = substrát, P = produkt) • definice reakční rychlosti: ] l.s mol [0 ]P[]S[        tt v Poznámka: takto je definována průměrná reakční rychlost, okamžitá rychlost: d[S]/dt (derivace, podíl dvou nekonečně malých čísel) Biochemie_3_2_enzymy_2 21 Na čem závisí rychlost reakce? • na koncentraci substrátu [S] • na teplotě • na přítomnosti efektoru (katalyzátoru, inhibitoru) U enzymových reakcí navíc: • koncentrace enzymu [E] • pH Biochemie_3_2_enzymy_2 22 Kinetická rovnice pro reakci S  P v = k [S] = k [S]1  reakce 1. řádu k = rychlostní konstanta v [S] Biochemie_3_2_enzymy_2 23 Koncentrace substrátu během reakce klesá  kinetická křivka [S] t z kinetické křivky se zjišťuje rychlost Biochemie_3_2_enzymy_2 TEST 24 Reakce 0. řádu je zvláštní případ • rychlost reakce nezávisí na koncentraci substrátu • v = k [S]0 = k . 1 = k = konstanta • nastává při velkém nadbytku S, takže jeho úbytek je prakticky zanedbatelný v [S] u enzymových reakcí pouze v laboratorních podmínkách Biochemie_3_2_enzymy_2 25 Počáteční rychlost vo • rychlost změřená dříve než vznikne významnější množství produktu • nejvyšší hodnota rychlosti • „virtuální veličina“ • není ovlivněna úbytkem substrátu ani vratnou přeměnou produktu • stanovuje se z kinetických křivek Biochemie_3_2_enzymy_2 26 Závislost vo na koncentraci substrátu • rovnice Michaelise a Mentenové • pro jednosubstrátové reakce m o K Vv   ]S[ ]S[ max Vmax = maximální rychlost (pro danou koncentraci enzymu) Km = Michaelisova konstanta Biochemie_3_2_enzymy_2 27 Grafickým vyjádřením předchozí rovnice je saturační křivka Km mol/l[S] vo Vmax enzym nasycen substrátem Vmax 2 Biochemie_3_2_enzymy_2 TEST 28 Jestliže [S] << Km 1max max ]S[]S[ ]S[ ]S[ k K V K Vv mm o    Při nízkých koncentracích substrátu se reakce řídí kinetikou 1. řádu Biochemie_3_2_enzymy_2 29 Jestliže [S] >> Km 0 maxmaxmax ]S[ ]S[ ]S[ ]S[ ]S[ kVVVv m K o    Při vysokých koncentracích substrátu se reakce řídí kinetikou 0. řádu Biochemie_3_2_enzymy_2 30 Dvě oblasti v saturačním grafu mol/l[S] vo kinetika 0. řádu kinetika 1. řádu enzym nasycen substrátem srovnejte se snímky 19 a 21 Biochemie_3_2_enzymy_2 31 Jestliže [S] = Km 2]S[2 ]S[ ]S[]S[ ]S[ max maxmax V VVvo    Biochemie_3_2_enzymy_2 32 Biochemický význam Km • koncentrace substrátu, při níž reakce probíhá polovinou maximální rychlosti • při této koncentraci je enzym z 50 % nasycen • Km má rozměr koncentrace (mol/l) • Km je nepřímo úměrná afinitě enzymu pro daný substrát • existuje-li více strukturně podobných substrátů, ten který má nejmenší Km se považuje za nejpřirozenější pro daný enzym Biochemie_3_2_enzymy_2 33 Jak se získá saturační křivka? • sada pokusů, konstantní koncentrace enzymu, • různé koncentrace substrátu, rozpětí 2-3 řády • z jednotlivých kinetických křivek se stanoví vo • vo se graficky vynesou proti příslušným [S] • vznikne hyperbolická saturační křivka [P] t [S1] [S2] [S3] [S4] v0 1 v0 2v0 3v0 4 Biochemie_3_2_enzymy_2 34 Rozlišujte Kinetická křivka • časový záznam jedné reakce • [P] = f (t) Saturační křivka • závislost získaná z mnoha stejných reakcí (viz předcházející sn.) • vo = f ([S]) Biochemie_3_2_enzymy_2 35 Hodnoty Vmax a Km charakterizují kinetické vlastnosti enzymu • snadno se zjistí z linearizovaného grafu • Lineweaver-Burk • dvojí reciproké vynesení • 1/vo se vynáší proti 1/[S] Biochemie_3_2_enzymy_2 36 m o K Vv   ]S[ ]S[ max          ]S[]S[ ]S[1 ]S[ ]S[11 maxmax mm o K V K Vv ]S[ 111 maxmax  V K Vv m o Matematické odvození reciprokého vztahu Biochemie_3_2_enzymy_2 37 Reciproký vztah je rovnice přímky ]S[ 111 maxmax  V K Vv m o 1/vo ................ závisle proměnná 1/[S] ............... nezávisle proměnná Km/Vmax ........... směrnice přímky 1/Vmax ............. úsek na ose závisle proměnné Biochemie_3_2_enzymy_2 38 Linearizovaný graf: 1/vo jako funkce 1/[S] 1/vo 1/[S] 1 / Vmax - 1 / Km Biochemie_3_2_enzymy_2 39 Koncentrace enzymu [E] také ovlivňuje rychlost nasycený enzym: vo = k [E]t = k [ES] [E]t je celková (totální) koncentrace enzymu [E]t = [E] + [ES] ......... obecně Biochemie_3_2_enzymy_2 40 Saturační křivky pro různé koncentrace enzymu vo [S] [E1] [E2] > [E1] [E3] > [E2] KM se nemění, Vmax se zvyšuje Biochemie_3_2_enzymy_2 41 Jak zjistit množství enzymu v biologickém materiálu? • velmi obtížné • nízké (stopové) koncentrace enzymů • přítomno mnoho dalších bílkovin • běžné chemické reakce jsou nepoužitelné • nejsou specifické pro odlišení jednotlivých enzymů Biochemie_3_2_enzymy_2 42 Množství enzymu v biologickém materiálu lze stanovit dvojím způsobem • katalytická koncentrace • μkat/l • stanoví se produkt enzymové reakce • většina klinicky významných enzymů • hmotnostní koncentrace • μg/l • stanoví se enzym (jako antigen, imunochemicky) • jen některé, např. tumorové markery Biochemie_3_2_enzymy_2 43 Katalytická aktivita enzymu • zavedena jednotka katal, 1 kat = mol/s • jeden katal je katalytická aktivita enzymu, při které se v reakci přemění jeden mol substrátu za sekundu mezinárodní jednotka IU (international unit) 1 IU = μmol/min Převodní vztahy: 1 μkat = 60 IU 1 IU = 16,6 nkat Biochemie_3_2_enzymy_2 44 Katalytická koncentrace enzymu • aktivita je vztažena na objem biologické tekutiny (krevní sérum) • jednotky mkat/l, kat/l Biochemie_3_2_enzymy_2 45 Metodika stanovení ALT (všechny složky jsou bezbarvé) Alanin + 2-Oxoglutarát Pyridoxalfosfát Pyruvát + Glutamát krevní sérum (obsah. ALT) LD Laktát + NADPyruvát + NADH + H při reakci klesá absorbance At Legenda: složky reakční směsi vzorek s enzymem optický test Semináře, s.18 Biochemie_3_2_enzymy_2 46 Stanovení katalytické aktivity v laboratoři • optimální podmínky (teplota, pH, kofaktory) • měří se [S] nebo [P] v určitém časovém intervalu • kinetika 0. řádu, [S] >> Km  nasycený enzym, rychlost je konstantní, blíží se Vmax Biochemie_3_2_enzymy_2 47 Dvě metody pro zjištění katalytické koncentrace Charakteristika Kinetická metoda Metoda konstantního času Co se měří [S] nebo [P] [P] Jak kontinuálně (např. po 10 s) po urč. čase (např. 10 min) je reakce inhibována Kinetická křivka hodnocena ano ne Co se stanoví / počítá počáteční rychlost vo průměrná rychlost Zhodnocení metody přesná méně přesná Biochemie_3_2_enzymy_2 48 Uvědomte si, že katal. koncentrace enzymu = rychlost chemické reakce [kat/l] = [mol/l.s] Biochemie_3_2_enzymy_2 49 Inhibice enzymů (snížení aktivity) Ireverzibilní • inhibitor pevně vázán na enzym (akt. místo) • organofosfáty • ionty těžkých kovů • kyanidy Reverzibilní • inhibitor volně vázán • rovnováha E+I  E-I • inhibitor lze odstranit (dialýza, gel. filtrace) • dva základní typy: kompetitivní, nekompetitivní Biochemie_3_2_enzymy_2 50 Příklad irreversibilní inhibice Diisopropylfluorofosfát DIPF (organofosfát) inhibuje acetylcholinesterasu fosforylace serinového zbytku Biochemie_3_2_enzymy_2 51 Kompetitivní inhibice • inhibitor je strukturně podobný substrátu • váže se do aktivního místa • soutěží s přirozeným substrátem o vazebné místo Biochemie_3_2_enzymy_2 52 Přirozený substrát vs. kompetitivní inhibitor COO CH2 CH2 COO COO CH2 COO sukcinát malonát malonát je inhibitorem sukcinátdehydrogenasy Biochemie_3_2_enzymy_2 53 Otrava methanolem se léčí ethanolem CH3OH H COOH alkoholdehydrogenasa CH3CH2OH Vznik toxických produktů je inhibován ethanolem, který vytěsní methanol z vazebného místa enzymu – kompetitivní inhibice dehydrogenace methanolu Biochemie_3_2_enzymy_2 54 Kompetitivní inhibice • maximální rychlost je dosažena až za vyšších hodnot [S] • Vmax se nemění • Km se zvyšuje Km mol/l[S] vo Vmax Km inh Biochemie_3_2_enzymy_2 55 Kompetitivní inhibice 1/vo 1/[S] 1 / Vmax - 1/Km - 1/Km 1 / Vmax Biochemie_3_2_enzymy_2 56 Nekompetitivní inhibice • Inhibitor se váže mimo aktivní centrum na E i na komplex E-S • Km se nemění (aktivní místo je volné pro substrát) • Vmax se snižuje, protože klesá koncentrace funkčního komplexu E-S Km mol/l[S] vo Vmax Km inh Vmax inh Biochemie_3_2_enzymy_2 57 Nekompetitivní inhibice 1/vo 1/[S] 1 / Vmax - 1 / Km - 1 / Km 1 / Vmax inh Biochemie_3_2_enzymy_2 58 Mnohá léčiva jsou inhibitory enzymů • Acetylsalicylová kyselina (cyklooxygenasa) • Ibuprofen (cyklooxygenasa) • Statiny (HMG-CoA reduktasa) – hypolipidemika, snižují syntézu cholesterolu (lovastatin) • Inhibitory ACE (angiotensin konvertující enzym) – léčba hypertenze (enalapril) • Reverzibilní inhibitory acetylcholinesterasy (neostigmin) – nervosvalové choroby, pooperační atonie střev • Selektivní inhibitory mozkové acetylcholinesterasy (rivastigmin, galantamin) - Alzheimerova chorobaBiochemie_3_2_enzymy_2 TEST 59 Antibiotika inhibují enzymy nutné pro určitý životní děj bakterií • Peniciliny – inhibují transpeptidasy (výstavba buněčné stěny) • Tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol – inhibice proteosyntézy • Fluorované chinolony (ciprofloxacin) – inhibice bakteriální gyrasy (topoisomerasy II) (rozplétání DNA během replikace) Biochemie_3_2_enzymy_2 60 1. Regulace množství molekul enzymu 2. Regulace biologické aktivity enzymu 3. Dostupnost a koncentrace substrátu a/nebo kofaktoru (in vivo méně významný faktor) Regulace enzymové aktivity (tři obecné způsoby) Biochemie_3_2_enzymy_2 61 Regulace množství enzymu • Řízená proteosyntéza enzymu konstitutivní a induková exprese genů, regulace rychlosti transkripce, posttranskripčních úprav RNA, regulace rychlosti translace a posttranslačních úprav • Řízená degradace enzymu specifické intracelulární proteinasy – určují rozdílné biologické poločasy enzymů Biochemie_3_2_enzymy_2 62 Regulace biologické aktivity enzymu • Izoenzymy (jeden typ reakce je regulován odlišně v různých tkáních) • Aktivace enzymu částečnou a nevratnou proteolýzou • Vratná kovalentní modifikace enzymu • Allosterická regulace Biochemie_3_2_enzymy_2 63 Izoenzymy • katalyzují stejnou reakci, ale liší se primární strukturou a tedy fyz.-chem. a kinetickými vlastnostmi • mají často různou tkáňovou distribuci • stanovují se elektroforézou • izoformy – obecnější termín (zahrnují ještě pseudoizoenzymy, posttranslační varianty) Biochemie_3_2_enzymy_2 64 Kreatinkinasa (CK) je dimer a tvoří tři izoenzymy Izoenzym Výskyt Procento celk. aktivity Zvýšení CK-MM CK-MB CK-BB svaly srdce mozek 94-96 % do 6 % stopy svalové trauma infarkt poranění mozku Biochemie_3_2_enzymy_2 65 Aktivace enzymu částečnou proteolýzou • Aktivní enzym vzniká nevratným odštěpením určité sekvence z molekuly proenzymu • Proteinasy v GIT (pepsinogen  pepsin) • Faktory krevního srážení • Proteinasy (kaspasy) aktivované v průběhu apoptózy Biochemie_3_2_enzymy_2 66 Reverzibilní kovalentní modifikace enzymu • fosforylace, katalyzují kinasy, přenos fosforylu -PO3 2- z ATP na -OH skupinu enzymu (Ser, Thr, Tyr) • vratný děj (defosforylaci) katalyzují fosfatasy, hydrolýza esterově vázaného fosfátu • Jiné modifikace: karboxylace, acetylace, … Biochemie_3_2_enzymy_2 67 Fosforylace a defosforylace enzymu Enzym Serin OH Enzym Serin O P O O O ATP ADP H2O P O O OHO kinasa fosfatasa Biochemie_3_2_enzymy_2 68 Příklad Glykogenfosforylasa • Katalyzuje štěpení glykogenu anorg. fosfátem • Fosforylovaný enzym je aktivní • Defosforylovaný enzym je neaktivní Glykogensynthasa • Katalyzuje syntézu glykogenu z UDP-glukosy • Fosforylovaný enzym je neaktivní • Defosforylovaný enzym je aktivní Biochemie_3_2_enzymy_2 69 Allosterické enzymy jsou oligomerní • více podjednotek, často regulační a katalytická • na enzym se váže efektor strukturně odlišný od substrátu, často produkt • váže se do allosterického místa – jiné než aktivní místo • vazba vyvolá změnu konformace enzymu  změna aktivity - allosterická aktivace nebo inhibice Biochemie_3_2_enzymy_2 70 Allosterické enzymy jsou oligomerní Biochemie_3_2_enzymy_2 71 Saturační křivka allosterických enzymů je sigmoidní [S] vo aktivace inhibicebez efektoru Biochemie_3_2_enzymy_2 72 Kooperativní efekt • u oligomerních enzymů a proteinů • více podjednotek  více vazebných míst • navázání substrátu (nebo jiné látky) na jednu podjednotku indukuje změny konformace u ostatních, že se další molekuly vážou snadněji (obtížněji) • příklad: hemoglobin × myoglobin Biochemie_3_2_enzymy_2 73 Trojí využití enzymů v lékařství 1. enzymy jako indikátory patologického stavu 2. enzymy jako analytická činidla v klin. biochemii 3. enzymy jako léčiva Biochemie_3_2_enzymy_2 74 Příklady enzymů v klinické diagnostice Enzym Referenční hodnoty Interpretace zvýšení ALT CK PSA do 0,9 kat/l do 4 kat/l do 4 μg/l hepatopatie myopatie, infarkt myokardu karcinom prostaty ALT alaninaminotransferasa, CK kreatinkinasa, PSA prostatický specifický antigen Při poškození buněk se zvyšuje aktivita intracelulárních enzymů v extracelulární tekutině Biochemie_3_2_enzymy_2 75 Enzymy jako analytická činidla Enzym Původ enzymu Stanovení Glukosaoxidasa Peroxidasa Lipasa Cholesteroloxidasa Urikasa Bilirubinoxidasa Ureasa Laktátdehydrogenasa Taq polymerasa Aspergillus niger křen (Armoracia sp.) Candida sp. Pseudomonas sp. Candida sp. Myrothecium sp. bob (Canavalia sp.) Pediocus sp. Thermus aquaticus glukosa glukosa triacylglyceroly cholesterol kyselina močová bilirubin močovina ALT, AST PCR metoda Biochemie_3_2_enzymy_2 76 Enzymové stanovení glukosy glukosa + O2  glukonolakton + H2O2 H2O2 + H2A  2 H2O + A glukosaoxidasa peroxidasa bezbarvý chromogen barevný produkt (měří se absorbance) Princip stanovení glukosy v analyzátorech Biochemie_3_2_enzymy_2 77 Osobní glukometry • určené pro osobní kontrolu u diabetiků • glukosaoxidasa je zakotvena na pevné fázi • vznikající H2O2 se stanovuje jiným způsobem (pomocí Pt-elektrody) • na displeji se ukáže koncentrace glukosy (mmol/l) Biochemie_3_2_enzymy_2 78 Osobní glukometr Biochemie_3_2_enzymy_2 79 Pankreatické enzymy v terapii • směs enzymů (lipasy, amylasy, proteinasy) získaná z vepřových pankreatů • indikace: sekreční nedostatečnost pankreatu různé etiologie, cystická fibróza • užívání: 3 × denně při jídle • řada přípravků volně prodejných acidorezistentní tobolky, rozpadají se až v duodenu Biochemie_3_2_enzymy_2 80 Asparaginasa v terapii leukémie • Katalyzuje hydrolýzu amidové skupiny asparaginu • Asn + H2O  Asp + NH3 • L-asparagin je nezbytný pro proteosyntézu některých nádorových buněk, Hydrolýza Asp vede k omezení proliferace • Indikace: akutní lymfoblastické leukemie, viz Semináře str. 19 Enzymová fibrinolytika • léčiva, která rozpouštějí krevní sraženiny v cévách • streptokinasa (bakteriální, není enzym), urokinasa (lidská) • štěpí plazminogen na plazmin – ten vyvolá degradaci fibrinu a trombolýzu • indikace: žilní trombóza, plicní embolie, akutní IM Biochemie_3_2_enzymy_2 81 Proteasy v lokální a systémové terapii • Lokální působení: fibrinolyzin, chymotrypsin, kolagenasa • po lokální aplikaci vedou k lýze nekrotické tkáně, nepoškozují zdravé buňky (obsahují inhibitory proteas) • hnisavé rány, bércové vředy, diabetické gangrény, dekubity apod. • Celkové působení: Trypsin, chymotrypsin, rostlinné proteasy - papain (papaya), bromelain (ananas) • některé studie naznačují protizánětlivý účinek, ovlivnění imunity u autoimunitních onemocnění • indikace: pomocná léčiva při revmatoidní artritidě, traumatické záněty a otoky, lymfedémy, záněty žil apod. • volně prodejné přípravky (Wobenzym, Phlogenzym aj.) Biochemie_3_2_enzymy_2 83 Příklad 1 Při enzymové reakci byl do roztoku substrátu v pufru přidán vzorek obsahující enzym (0,1 ml). Po 5 min bylo stanoveno 0,2 mmol produktu. Jaká je katalytická koncentrace enzymu ve vzorku? Biochemie_3_2_enzymy_2 84 Příklad 1 - Řešení t = 5 min = 5. 60 s = 300 s za 300 s … vzniklo 0,2 mmol produktu za 1 s … x = 0,2/300 = 6,7 .10-4 mmol / na 0,1 ml vzorku na 1 litr vzorku = 6,7 . 10-4 . 104 = 6,7 mmol/l.s = 6,7 mkat/l Biochemie_3_2_enzymy_2 85 Příklad 2 Reakční směs obsahovala: 2,5 ml pufru 0,2 ml roztoku koenzymu NADH (optický test) 0,1 ml krevního séra 0,2 ml roztoku substrátu Po 60 s byl pokles absorbance koenzymu A = 0,03. NADH = 6220 l/mol.cm, šířka kyvety l = 1 cm. Jaká je katalytická koncentrace enzymu? Biochemie_3_2_enzymy_2 86 Příklad 2 - Řešení Vzorek séra byl zředěn: Vkon/Vpuv = 3,0 / 0,1 = 30 Lambertův-Beerův zákon: A =  c l / za urč. čas t  z toho odvodíme změnu koncentrace za 60 s: Nutno násobit zředěním: 30 . 8 .10-8 = 2,4 . 10-6 mol/l.s = 2,4 . 10-6 kat/l = 2,4 kat/l mol/l.s10.8 6016220 03,0 8        tl A t c  Biochemie_3_2_enzymy_2