Kinetika enzymových reakcí
3
Rychlost a řád chemické reakce, kinetika reakcí 0. a 1. řádu. Mechanismus enzymové reakce, aktivita a katalytická koncentrace enzymu, faktoiy ovlivňující enzymovou aktivitu, saturační křivka, KM, inhibitory, izoformy.
Kvantifikace enzymu
Vyjádření množství	Jednotka	Rozměr
Katalytická (enzymová) aktivita	Katal (kat)	
	Mezinárodní jednotka (U, IU)	(imol/min
Katalytická koncentrace		
Hmotnostní koncentrace	g/l	g/l
1. Uveďte vztah pro přepočet katalytické aktivity v ukat na IU a opačně. Možnosti stanovení kvantity enzymu
0 5 10 15
t (min)
2.   Charakterizujte základní metody měření enzymové aktivity:
a) kinetická metoda ............................
b) metoda konstantního času ............................
c) imunochemické stanovení ............................
17
3. Laktátdehydrogenasa má katalytickou aktivitu 2 ukat. Kolik molekul laktátu vznikne z pyruvátu za 1 minutu při nadbytku substrátu? (7,23.10")
4. Jaké množství produktu vznikne za 10 minut při reakci katalyzované enzymem o aktivitě 10 ukat? Co je podmínkou toho, aby teoreticky vypočtené množství skutečně vzniklo? (6 mmol)
5. Do reakční směsi obsahující substrát a pufr bylo přidáno 0,1 ml séra. Jaká je katalytická koncentrace enzymu, jestliže po 10 min. měření metodou konstantního času obsahovala reakční směs 6 umol produktu? Bude se výsledek lišit od aktivity stanovené kinetickou metodou? (100 ukat/l)
6. Reakční směs obsahuje: 2,5 ml pufru, 0,2 ml roztoku NAD+, 0,1 ml séra a 0,2 ml roztoku laktátu. Reakce probíhala přesně 10 minut a po této době byla naměřena koncentrace vzniklého NADH 1,2 mmol/1. Vypočtěte katalytickou aktivitu a katalytickou koncentraci enzymu LD. (6 nkat, 60 ukat/l)
7. Určete aktivitu katalasy, bylo-li zjištěno, že při nadbytku H202 v reakční směsi se uvolní po 10 minutách 6,72 ul 02 (za normálních podmínek). (l nkat)
Optický (UV, Warburgův) test
NAD(P)+ NAD(P)H + H+
katalyticlé koncentrace--
Využití optického testu:
a) stanovení aktivity enzymů - NAD(P)-dependentních dehydrogenas (NAD(P)-DH)
- stanovení aktivity ostatních enzymů po spřažení s NAD(P)-DH
b) stanovení koncentrace substrátu - např.: laktátu
8.   Jak se bude měnit absorbance při 340 nm při stanovení laktátu v séru s využitím optického testu?
18
Faktory ovlivňující rychlost enzymové reakce
I. Koncentrace substrátu
Průběh enzymové reakce s jedním substrátem:
E + S
ES
E + P
Saturační křivka
[S] (mol/l)
Ustálený stav: [ES] = konst.
rovnice Michaelise-Mentenové
V0 = ^max
[S] KM+[S]
[S] . . . počáteční koncentrace substrátu Fmax. . . maximální (limitní VL) rychlost
9. Srovnejte: kinetická křivka: závislost.........na.........
saturační křivka: závislost.........na.........
10. Navrhněte uspořádání pokusu, v němž lze zjistit průběh saturační křivky.
11. Jaký je rozměr KM?
12. Charakterizujte koncové úseky saturační křivky pro hodnoty: a) [S] « KM; b) [S] » KM. Jaké jsou řády reakcí za uvedených podmínek?
13. Charakterizujte bod na saturační křivce pro hodnotu [S] = KM.
14. Určete podíl [S]/ KM, při kterém reakce probíhá: a) v0= 90 % Fmax; b) v0= 99 % Vnmx       (a) 9; b) 99)
15. Ke kterému ze substrátů Si, S2 a S3 má enzym s širokou substrátovou specifitou nejvyšší afinitu (Kmi = 400 umol/1, ^M2=1000 umol/1, KM3=60 umol/1)?
16. Jaká by měla být koncentrace laktosy, aby reakce katalyzovaná p-galaktosidasou, která má ÄľM(laktosa) = 400 umol/1, probíhala podle kinetiky 0. řádu? (> íoo Km, tj. > 40 mmoi/i)
17. Při mutaci enzymu došlo k dvojnásobnému zvýšení KM pro substrát oproti normální hodnotě. Jak se musí změnit koncentrace daného substrátu, aby se rychlost dané reakce nezměnila?
18. L-Asparagin je nezbytný pro proteosyntézu v některých nádorových buňkách. Při léčbě určitých typů leukémie může být mj. podáván enzym asparaginasa, přeměňující Asn na Asp a amoniak. Tím dochází k poklesu koncentrace Asn v oběhu a ke snížení proliferace. Která z uvedených forem asparaginasy by byla pro léčbu nejvhodnější, je-li koncentrace Asn v krvi 0,2 mM?
a) KM = 0,2 mM; Fmax = 0,1 mJVl/h b) KM = 0,2 mM; Fmax = 0,5 íruM/h
c) KM = 2 mM; Fmax = 0,1 mM/h d) KM = 0,1 mM; Fmax = 0,5 mM/h
19. Na příkladu hexokinasy a glukokinasy vysvětlete pojem substrátová specifita.
19
Saturační křivka allosterických enzymů
pozitivní _ bez efektom
Allosterický modulátor (efektor)
nízkomolekulární látka (často meziprodukt nebo produkt dané dráhy)
- vazba v oblasti jiné než aktivní centrum
- změna konformace enzymu -> změna aktivity
Allosterický enzym
- obvykle více podjednotek (často regulační a katalytické)
- regulační funkce v metabolismu
[S]
II. Koncentrace enzymu
Obecně: v0 - k ■ [E],
Pro plně nasycený enzym ([E], = [ES]): v0= Vmax = ACilt • [E],
kde celková (total) koncentrace enzymu [E],= [E] + [ES]; ^ciit = '''max I [E]i molová/molekulámí aktivita (číslo premeny)
20. Sestrojte saturační křivky pro 3 různé koncentrace ([EJ < [E2] < [E3]) téhož enzymu a stejný typ reakce. Jak se změní hodnoty KM, Fmax?
21. Karbonátdehydratasa má molekulární aktivitu 6.105 s_1. Kolik molekul H2C03 vznikne za katalýzy jednou molekulou enzymu za 10 milisekund, je-li enzym saturován substrátem? (6 000)
22. Lysozym má molekulární aktivitu 0,5 s . Kolik glykosidových vazeb hydrolyticky rozštěpí 1 pmol lysozymu za 1 s, je-li nasycen substrátem? (0,5 umoi = 3,oi.io17)
III. Teplota
IV. pH
V. Aktivátory
23. Jakým způsobem ovlivňují aktivitu enzymů a) teplota; b) pH; c) aktivátory? Uveďte příklady.
24. Co je to Taq polymerasa, při které metodě se používá?
20
VI. Inhibitory
25. Vysvětlete rozdíl mezi reversibilní a ireversibilní inhibicí.
26. Uveďte příklady ireversibilní inhibice.
27. Jaké základní typy reversibilní inhibice rozlišujeme?
28. Doplňte do tabulky, jak se mění při inhibici hodnoty KMa Vmax a uveďte příklady inhibitorů.
Parametr	Kompetitivní inhibice	Nekompetitivní inhibice
Km		
v ' max		
Inhibitor		
29. Vyznačte do grafu průběh saturační křivky při kompetitivní a nekompetitivní inhibici. Vyznačte parametry KM, Vma>i.
a) kompetitivní inhibice b) nekompetitivní inhibice
[S] [S]
30. Vysvětlete pojmy: proenzym, izoenzym a izoforma.
31. Uveďte, jaké metody lze použít k rozlišení izoenzymů.
21
Kofaktory enzymů
4
Názvy a struktury základních heterocyklů. Koenzymy, kofaktory, jejich funkce, struktury, příklady reakcí, vztah kofaktorů k vitaminům.
Kofaktory oxidoreduktas Nikotinamidadenindinukleotid (NAD+)
XONB,
1. Doplňte zbývající část struktury. Jak se liší NADP+ od NAD+?
2. NAD+ se skládá ze dvou nukleotidů. Uveďte, ze kterých a jak jsou spojeny.
3. Jaká je funkce obou koenzymů?
4. K jaké strukturní změně NAD+ dochází při dehydrogenačních reakcích? Proč redukovaná forma NAD+ nemá kladný náboj?
5. Který vitamin je součástí NAD+, jaké jsou jeho zdroje?
6. Napište rovnice reakce NAD+: a) s laktátem (katalyzované laktátdehydrogenasou);
b) s ethanolem (katalyzované alkoholdehydrogenasou).
NAD -dependentní enzymy, např. (citrátový cyklus): ..... .....
(doplňte) (glykolýza): ..... .....
(detoxikace ethanolu): .....
NADP+-dependentní enzymy, např. (syntéza mastných kyselin): oxoacylreduktasa
(syntéza cholesterolu): HMG-CoA-reduktasa
Flavinové nukleotidy (FMN, FAD)
7. Popište strukturu obou nukleotidů.
8. Které heterocykly jsou obsaženy ve flavinové části kofaktorů?
9. Jak se nazývá znázorněná struktura?
10. Jaká je funkce FAD?
11. Který vitamin je součástí fiavinových kofaktorů?
22
12. Doplňte vzorec redukované formy FAD:
13. Napište rovnicí reakci FAD se sukcinátem.
FMN-dependentní enzymy, např. (dýchací řetězec): NADH-dehydrogenasa
FAD-dependentní enzymy, např. (citrátový cyklus): {doplňte) .....
(oxidační dekarboxylace 2-oxokyselin): pymvátdehydrogenasa
Tetrahydrobiopterin (BH4)
H,N
O
HN <
3
N'
'N H
,CH—CH—CH3 I I OH OH
14. Který heterocyklus je základem struktury BH4?
5,6,7,8-tetrahydrobiopterin
Funkce BH4 u některých hydroxylací katalyzovaných monooxygenasami
R-H
BH4
R-OH
H20
chinoidní-BH;
NAD+ NADH + H+
Enzymy využívající BH4, např. (hydroxylasy aromatických aminokyselin): .................
(doplňte) .................
(syntéza oxidu dusnatého, viz str. 43): NO-synthasa
23
Koenzym Q, Fe-S, hem - viz kapitola Respirační řetězec, str. 75.
Molybdopterin (molybdenový kofaktor)
Enzymy využívající molybdopterin, např.: xanthinoxidasa, sulfitoxidasa
Lipoová kyselina
15. Doplňte chybějící část struktury ■ ■ ■ ■ 16. Jakým způsobem je vázána lipoová kyselina na enzym?
17. Na jakém typu reakcí se lipoová kyselina podílí? S    S 18. Nakreslete strukturu dihydrolipoátu a naznačte vazbu acetylu.
Enzymy závislé na lipoátu, např. (oxidační dekarboxylace 2-oxokyselin): (doplňte) ..........
Glutathion (GSH)
O n
H ?---N-CH
CH;
i ' SH
19. Doplňte chybějící část struktury a její název.
20. GSH se podílí na odstraňování H202 a organických hydroperoxidů v buňce. Napište rovnicí obecné schéma jeho funkce.
21. Jakým způsobem dochází k regeneraci redukované formy glutathionu? Který koenzym je k tomu zapotřebí?
Enzymy závislé na GSH, např. (selenoprotein): glutathionperoxidasa
(nejen oxidoreduktasy)    (konjugace xenobiotik): glutathion-S-transferasa
(membránový transport AK): y-glutamyltranspeptidasa
24
Kofaktory transferas Pyridoxalfosfát (PLP)
22. Který vitamin má vztah k PLP?
23. Který heterocyklus je základem struktury PLP?
24. Jakých dalších forem může PLP nabývat při reakci s aminokyselinami? Nakreslete dílčí struktury.
Schéma vzniku aldiminu při reakci PLP s aminokyselinami (doplňte)
Transaminace
Dekarboxylace
Enzymy závislé na pyridoxalfosfátu, např. (transaminace): ..... .....
(doplňte) (syntéza hemu): £-aminolevulinátsynthasa
Biotin
25. Které heterocykly jsou obsaženy v molekule biotinu?
26. Na jakém typu reakcí se podílí biotin a kterou skupinu přenáší?
27. Vyznačte místo, na které se váže přenášená skupina.
Enzymy závislé na biotinu, např.     (anaplerotická reakce citrátového cyklu): .....
(doplňte) (syntéza mastných kyselin): acetyl-CoA-karboxylasa
28. Který z doposud uvedených kofaktorů (FAD, NAD+, lipoát, biotin) je typickým koenzymem?
R-CH-COO I + NHa
H.c.O I
R'
PLP Aldimin
(Schiffova báze)
25
Tetrahydrofolát (H4-folát)
O
29. Popište strukturu kofaktoru. Doplňte zbývající část molekuly.
H4-folát přenáší jednouhlíkové fragmenty (doplňte):
Methyl Methylen Methenyl Formyl Formimino
-CH=
vazba na H4-folát N5
N5,N10 N5,N10 N10 N5
Tvorba, vzájemné přeměny a utilizace derivátů H4-folátu
H4-folár
His
Listová kyselina
i
H2-folát
H4-folát
Trp
Forrmát
ATP
NH-
Forrnirnino-H4folát —-—>
Fonnyl-H4folát
a
Methenyl H4folát
;T Puriny
Ser, Gly
H4-folat
S-AM "aktivní methyl"
Met
B
12
Methylen-H4 folát
Metliylen-Hjfolát- ^ reduktasa H2-folát
dUMP dTMP
> Hey
Methyl-H4folát
Hey . . . Homocystein, S-AM . . . S-adenosylmethionin
Jednotlivé reakce poskytující jednouhlíkové zbytky - viz kapitola Metabolismus aminokyselin, str. 42.
26
30. Napište dílčí rovnici přeměny methylen-H4 folátu na methyl-H4 folát (kofaktorem je NADH).
31. Uveďte hlavní zdroje jednouhlíkových zbytků v organismu.
32. Uveďte příklad methylační reakce, při které je donorem methylu jednouhlíkový fragment vázaný na H4-folát.
33. Jaký je princip antibakteriálního působení sulfonamidů? Kobalaminy (vitamin Bi2)
R ...
5'-deoxyadenosin (mitochondrie) -OH (cytosol) -CH3 (cytosol)
34. Popište strukturu kofaktoru.
35. Nakreslete strukturu 5'-deoxyadenosinu.
Význam methylkobalaminu
methioninsynthasa
Hcy
methylkobalamin
hydroxykobalamin
Enzymy závislé na vitaminu Bi2, např. (resyntéza methioninu): methioninsynthasa
(utilizace propionátu): methylmalonyl-CoA-mutasa
«
27
36. Proč při nedostatku vitaminu B,2 dochází k vyčerpání tetrahydrolistové kyseliny (vzniká tzv. "folátová past")?
37. Jedna z příčin vzniku anémií (megaloblastické/perniciosní) je nedostatek vitaminu B|2, který se projeví poruchou tvorby DNA a vzniku nových erytrocytu. Vysvětlete.
Thiamindifosfát (TDP)
38. Pojmenujte oba heterocykly obsažené v molekule TDP.
39. Jaká část struktury není znázorněna? Doplňte.
40. Jaká skupina je přenášena a v jaké formě?
41. Na kterém atomu kofaktoru dochází k vazbě přenášené skupiny a proč?
42. Který vitamin je součástí kofaktoru?
43. Na jakém typu reakcí se účastní TDP?
44. Jedním z projevů nemoci beri-beri (singálsky = nemohu) je výrazné zvýšení hladiny pyruvátu v krvi. Vysvětlete, proč. Jak lze příznaky choroby odstranit?
Enzymy závislé na TDP, např. (citrátový cyklus):
(doplňte)
(oxidační dekarboxylace 2-oxokyselin): . transketolasová reakce v pentosovém cyklu
28