BIOCH-9
Citrátový cyklus
1
BIOCH-9
Doporučený poměr živin
Živina
Procento příjmu
energie/den
Škroboviny
Tuky
Bílkoviny
55 – 60 %
 30 %
10 -15 %
2
SAFA  5 %
MUFA  20 % *
PUFA  5 %
Esenciální MK: linolová, α-linolenová
Podmíněně esenc. MK: arachidonová
Esenciální AK: Phe, Trp, Val, Leu, Ile, Met, Thr, Lys
Podmíněně esenc. AK: His, Arg (dětství), Ala, Gln (metab. stres)
* 67 % tuků
Živiny jsou redukované formy uhlíku
protože v nich převažují nízká oxidační čísla uhlíku
O
OH
OH
OH
OH
CH2OH
I
0
0
0
0
-I
H3C
COOH
-II
-III
III
H3C CH
NH2
COOH
-III III0
glukosa: 6,7 % H
Průměrné ox.č. C = 0,0
alanin: 7,9 % H
Průměrné ox. č. C = 0,0
stearová kyselina: 12,8 % H
Průměrné ox. č. C = -1,8  uhlík je nejvíce redukovaný
3
BIOCH-9
4
Fáze
katabolismu
I
II
III
ATP
DŘ
Acetyl-CoA
Pyruvát
Redukované kofaktory
NADH + H+, FADH2
CO2
GTP
GlukosaMastné kyseliny Aminokyseliny
SacharidyLipidy Proteiny
Citrátový
cyklus
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 230.
BIOCH-9
Tři fáze katabolismu živin
I. Hydrolýza složitých molekul (biopolymerů) na zákl. stavební
jednotky probíhá v trávicím traktu - žádný zisk energie
II. Postupná oxidace glukosy, AK na amfibolické meziprodukty pyruvát,
acetyl-CoA (mohou být pro syntézu)
získá se jen malé množství ATP (glykolýza)
beta oxidace MK – acetyl-CoA + redukované kofaktory
III. Oxidace acetyl-CoA (CC) + reduk. kofaktorů (DŘ) největší
zisk energie
5
BIOCH-9
Acetyl-CoA vzniká různým způsobem
•oxidační dekarboxylací pyruvátu
•β-oxidací MK
•katabolismem některých AK
6
BIOCH-9
Různé způsoby dekarboxylace pyruvátu
7
pyruvát
H3C C
COOH
O
dekarboxylace
H3C C
H
O
acetaldehyd
H3C C
OH
O
oxidační
dekarboxylace
in vitro
oxidační
dekarboxylace
in vivo
(mitochondrie)
H3C C
S
O
CoA
octová kyselina
acetyl-CoA
BIOCH-9
1. Thiamindifosfát
2. Lipoát
3. Koenzym A
4. FAD
5. NAD+
Oxidační dekarboxylaci pyruvátu katalyzuje
pyruvátdehydrogenasový komplex:
3 enzymy a 5 kofaktorů
8
chronologické pořadí
mitochondrie
BIOCH-9
Thiamindifosfát
9
N
S
CH3
CH2CH2 O P
O
O
O P
O
O
O
NN
CH3
H2N
reaktivní atom C
váže "aktivní acetaldehyd"
thiazolium
BIOCH-9
Lipoát
• cyklický disulfid
• přijetím 2H vznikne dihydrolipoát s dvěma -SH skupinami
• součást komplexní oxidační dekarboxylace 2-oxokyselin
(pyruvát, 2-oxoglutarát, 2-oxokyseliny z Val, Leu, Ile)
10
S S
COOH
1,2-dithiolan
BIOCH-9
Látková bilance oxidační dekarboxylace pyruvátu
11
CH3-CO-COOH + HS-CoA
CO2 + CH3CO-S-CoA + 2H
vydýchá se CC DŘ
BIOCH-9
(1) Dekarboxylace pyruvátu
12
N
SH
H3C C
COOH
O
CO2
N
SC
H
H3C
OH
hydroxyethyl-TDPTDP
(thiazoliový kruh) "aktivní acetaldehyd"
+
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 231.
BIOCH-9
(2) Transfer acetylu na lipoát
je redoxní reakce
13
• hydroxyethylová skupina se při transferu dehydrogenuje na thioester
• jeden atom H redukuje atom síry lipoátu na –SH skupinu
• druhý atom H se opět naváže na TDP
II
0
S S
N
O
Lys
H
E2
N
SC
H
H3C
OH
lipoát vázaný na enzym
N
SH
N
O
Lys
H
E2
SS
H C
O
CH3
S-acetylhydrogenlipoát
(thioester)
TDP
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 231.
BIOCH-9
(3) Transfer acetylu na koenzym A
14
N
O
Lys
H
E2
SS
H C
O
CH3
HS CoA
N
O
Lys
H
E2
SS
H H
dihydrogenlipoát
S CoAC
O
H3C
acetyl-CoA
makroergní sloučenina
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 230.
BIOCH-9
(4) Postupný transfer 2H na NAD+
15
N
O
Lys
H
E2
SS
H H
S S
N
O
Lys
H
E2
FAD FADH2
NAD
+NADH H
+
+
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 230.
BIOCH-9
Pyruvátdehydrogenasa je inhibována
konečnými produkty:
acetyl-CoA + NADH
16
BIOCH-9
Citrátový cyklus
•terminální metabolická dráha
•tři typy produktů:
•CO2  vydýchá se
•redukované kofaktory  DŘ
•GTP  ATP
17
mitochondrie
BIOCH-9
(1) Oxalacetát + Acetyl-CoA
18
C
CH2
COOHO
COOH
+ CH3 C
O
S CoA
H2O
- CoA-SH
oxalacetát acetyl-koenzym A citrát
C
CH2
COOH
COOH
HO
CH2 COOH
Typ reakce: kondenzace Enzym: citrátsynthasa
Kofaktor: koenzym A Poznámka: nevratná
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 233.
BIOCH-9
(2) Citrát  Isocitrát
19
Typ reakce: izomerace Enzym: akonitasa Kofaktor: Fe-S
Poznámka: ve skutečnosti dvě reakce, meziprodukt cis-akonitát
C
CH2
COOH
COOH
CH2
HO
COOH
CH
CH2 COOH
CH
COOH
HO COOH
terciární
hydroxylová skupina
sekundární
hydroxylová skupina
citrát isocitrát
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 233.
BIOCH-9
(2a) Dehydratace citrátu
20
citrát
C
CH2
COOH
COOH
C
HO
COOH
H
H
H2O
C
C
COOHH
CH2 COOHHOOC
cis-akonitát
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 233.
BIOCH-9
(2b) Hydratace cis-akonitátu
21
CH
CH2 COOH
CH
COOH
HO COOH
C
C
COOHH
CH2 COOHHOOC
cis-akonitát
H2O
isocitrát
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 233.
BIOCH-9
(3) Isocitrát  2-oxoglutarát
22
Typ reakce: dehydrogenace + dekarboxylace Enzym: isocitrátdehydrogenasa
Kofaktor: NAD+ Poznámka: nevratná
+ NAD
+
CH
CH2 COOH
CH
COOH
HO COOH
CH2
CH2 COOH
C COOHO
- CO2
NADH + H
+
+
isocitrát 2-oxoglutarát
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 234.
BIOCH-9
(4) 2-Oxoglutarát  sukcinyl-CoA
23
Typ reakce: oxidační dekarboxylace Enzym: 2-oxoglutarátdehydrogenasa
Kofaktory: TDP, lipoát, CoA, FAD, NAD+
Poznámka: nevratná, mechanismus podobný oxid. dekarboxylaci pyruvátu
CH2
CH2 COOH
C COOHO
+
NADH + H
+
NAD
+
-
CH2
CH2 COOH
CO S CoA
+ CO2
2-oxoglutarát sukcinyl-koenzym A
thioester
makroergní meziprodukt
HS CoA
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 234.
BIOCH-9
(5) Sukcinyl-CoA + GDP + Pi
24
+CH2
CH2 COOH
CO S CoA
+ +GDP Pi CH2
CH2 COOH
CO OH
GTP
sukcinyl-koenzym A sukcinát guanosintrifosfát
Typ reakce: substrátová fosforylace
Enzym: sukcinyl-CoA-syntethasa Kofaktor: koenzym A
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 234.
BIOCH-9
GTP vzniká třístupňovou reakcí
Chemická energie makroergního sukcinyl-CoA
je postupně transformována do dvou makroergních
meziproduktů a nakonec do makroergního GTP
(Passing a hot potato)
25
BIOCH-9
(5a) Adice fosfátu na sukcinyl-CoA
26
fosfát má čtyři O
smíšený anhydrid karboxylové
a fosforečné kyseliny
P
O
O
O
OH
COO
CH2
CH2
C
O S CoA
HS CoA
COO
CH2
CH2
C
O O P
O
O
O
sukcinyl-CoA sukcinylfosfát
+
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 235.
BIOCH-9
(5b) Fosforylace His
v aktivním místě enzymu
27
substituovaný
fosfoamid
N
NH
EnzymCOO
CH2
CH2
C
O O P
O
O
O
COO
CH2
CH2
C
O O
sukcinylfosfát sukcinát fosfo-His
N
N
Enzym
P
O
O
O
H
+
++
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 235.
BIOCH-9
(5c) Fosforylace GDP
28
N
N
N
N
O
H2N
H
O
OH OH
OPO
O
O
P
O
O
O
N
N
Enzym
P
O
O
O
N
N
N
N
O
H2N
H
O
OH OH
OPO
O
O
P
O
O
OP
O
O
O
guanosindifosfát guanosintrifosfát
N
NH
Enzym
H
+
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 235.
BIOCH-9
Rozlišujte!
29
-PO3
2- HPO4
2- (Pi)
sloučenina reálně existující
skupina neschopná existence
anorganický fosfát
P
O
O
O
P
O
O
O
OH
fosforyl fosfát
BIOCH-9
GTP rychle konvertuje na ATP
30
GTP + ADP ATP + GDP
nukleosid-difosfátkinasa
BIOCH-9
(6) Sukcinát  fumarát
31
COOH
CH2
CH2
COOH
+ FAD
C
C
COOHH
HOOC H
-II
-II
-I
-I
+ FADH2
sukcinát fumarát
Typ reakce: dehydrogenace (-CH2-CH2- vazby)
Enzym: sukcinátdehydrogenasa Kofaktor: FAD
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 236.
BIOCH-9
(7) Fumarát  L-malát
32
Typ reakce: hydratace Enzym: fumarasa Kofaktor: žádný
Poznámky: 1) adice vody na dvojnou vazbu je stereospecifická
2) hydratace není redoxní reakce
-II
+ H2O
COOH
C H
CH2
HO
COOH
0
fumarát L-malát
S =-II S = -II
C
C
COOHH
HOOC H
-I
-I
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 236.
BIOCH-9
Rozlišujte!
33
Hydratace:
adice vody na dvojnou vazbu
substrát + H2O → produkt
Hydrolýza:
štěpení různých vazeb (C-O, C-N) vlivem H2O
substrát + H2O → produkt1 + produkt2
BIOCH-9
Hydratace fumarátu in vivo
34
C C COOH
H
H
HOOC
H
O
H
Enzym
Substrát
Vznikne pouze jeden enantiomer (L-malát)
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 26.
BIOCH-9
Hydratace fumarátu in vitro
35
C
C
COOHH
HOOC H
H
H
O
H
H
O
adice z pravé
strany
C
COOH
CH2COOH
OHHC
COOH
CH2COOH
HHO
adice z levé
strany
L-malát D-malát
Vznikne racemický D,L-malát
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 26.
BIOCH-9
(8) L-malát  oxalacetát
36
Typ reakce: dehydrogenace
Enzym: malátdehydrogenasa Kofaktor: NAD+
COOH
C H
CH2
HO
COOH
+ NAD
+
COOH
C
CH2 COOH
O + NADH H
+
+
L-malát oxalacetát
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 236.
BIOCH-9Citrátový cyklus. [online]. [cit. 2014-08-20]. Dostupné z: http://cs.wikipedia.org/wiki/Citr%C3%A1tov%C3%BD_cyklus
36
BIOCH-9
Látková bilance citrátového cyklu
38
CH3-CO-S-CoA + 3NAD+ + FAD + 2H2O + H+ + HPO4
2- +
2 CO2 + CoA-SH + 3 NADH + 3H+ + FADH2 +
• dva atomy uhlíku jsou kompletně oxidovány na 2 CO2
• uvolní se přitom 8 atomů vodíku ve formě čtyř redukovaných
kofaktorů (3 × NADH+H+, 1 × FADH2)
P
O
O
O O P
O
O
O Rib
G
P
O
O
O O P
O
O
O Rib
G
P
O
O
O
BIOCH-9
Energetická bilance CC
Vznik v CC
1 × GTP
3 × NADH + H+
1 × FADH2
Ekvivalent ATP (DŘ)
1
9
2
Celkem 12 ATP
39
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 237.
Reakce GTP / Redukované kofaktory Ekvivalent ATP
isocitrát → 2-oxoglutarát 1 NADH+H+ 3 ATP
2-oxoglutarát → sukcinyl-CoA 1 NADH+H+ 3 ATP
sukcinyl-CoA → sukcinát 1 GTP 1 ATP
sukcinát → fumarát 1 FADH2 2 ATP
L-malát → oxalacetát 1 NADH+H+ 3 ATP
CELKEM 12 ATP
BIOCH-9
Obecné vlivy na regulaci citrátového cyklu
• energetický stav buňky rozhoduje o průběhu CC
• poměr ATP/ADP a NADH+H+/NAD+
• allosterická inhibice
• inhibice produktem
• CC může probíhat jen za aerobních podmínek (pokud nemá
buňka dostatek kyslíku je CC zastaven, NADH+H+ inhibuje),
hypoxie způsobuje zástavu
40
BIOCH-9
Enzymy klíčové pro regulaci CC a jejich
inhibitory/aktivátory
Enzym ATPa NADHa Jiný vliv
Pyruvátdehydrogenasa - - - acetyl-CoA (inh. prod.)
Citrátsynthasa - - citrát (inhibice produktem)
Isocitrátdehydrogenasa - - + ADP (alosterická aktivace)
2-OG-dehydrogenasa - - sukcinyl-CoA (inh. prod.)
41
a allosterický inhibitor
b zpětnovazebný inhibitor (inhibice produktem)
c allosterický aktivátor
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 237.
Schéma regulace citrátového cyklu
• Popis:
• červenými tečkami jsou
označeny reakce, o jejichž
regulaci se zajímáme
• červené šipky naznačují
alosterickou inhibici, která je
zajištěna ATP a NADH+H+
(oranžové šipky naznačují,
které reakce NADH+H+
produkují
• fialové šipky naznačují
inhibici produktem
• zelená šipka naznačuje
alosterickou aktivaci pomocí
ADP
BIOCH-9
NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 238.
41
BIOCH-9
BIOCH-9