BIOCH-9 Anaplerotické reakce CC • doplňují výchozí oxalacetát a další meziprodukty CC • karboxylace pyruvátu → oxalacetát (pyruvátkarboxylása, biotin) • (redukční karboxylace pyruvátu → malát, význam pro tvorbu NADPH +H+) • transaminace aspartátu → oxalacetát • katabolismus Phe, Tyr → fumarát • Asp (synt. močoviny, purinů) → fumarát • katabolismus Val, Ile, Met → sukcinyl-CoA • transaminace glutamátu → 2-oxoglutarát 45 Z řec. ana - opět, znovu, zpět, pleros - plný, naplněný BIOCH-9 Karboxylace pyruvátu (biotin) 46 Biotin COOH H3C C O COOH Biotin H CH2 C O COOHHOOC pyruvát oxalacetát pyruvátkarboxylasa BIOCH-9 Redukční karboxylace pyruvátu 47 Reakce má význam spíše v opačném směru jako zdroj NADPH pro syntézy jablečný enzym (malátdehydrogenasa dekarboxylující) COOH C CH3 O CO O NADPH + H COOH C CH2 HO H COOH L-malát NADP BIOCH-9 CC má amfibolický charakter • terminální dráha katabolická: oxidace acetyl-CoA na CO2 (katabolismus acetyl-CoA) • obsahuje meziprodukty pro anabolické děje: glukoneogeneze, transaminace a další 48 BIOCH-9 Katabolické děje - vstupy do CC 49 syntéza purinů oxalacetát fumarát sukcinyl-CoA 2-oxoglutarát acetyl-CoA Phe, Tyr syntéza močoviny deaminace Glu v cyklu purin. nukleotidů Ile, Val, Met, Thr Arg, Glu, Gln, His, Pro Asp, Asn pyruvát Ala, Cys, Gly, Ser, Thr, Trp Ile, Leu, Lys, Thr mastné kyseliny glukosa CC BIOCH-9 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 238. BIOCH-9 Anabolické děje - výstupy z CC 51 oxalacetát sukcinyl-CoA 2-oxoglutarát CCmalát porfyriny, hem (sběrač aminoskupin) pyruvát + NADPH aspartát puriny pyrimidiny fosfoenolpyruvát glukosa glutamát BIOCH-9 Vzájemné přeměny živin pyruvát glukosa acetyl-CoA nevratná nevratná ketogenní AK CCglukogenní AK MK glycerol TAG 52 a smíšené AK (esenciální) NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 240. BIOCH-9 Vzájemné přeměny živin 53 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 240. sacharidy tuky tuky sacharidyx sacharidyglukogenní AK sacharidy (pyruvát, CC) C skelet neesenc. AK x AKtuky AK tuky (při nadbytku proteinů) BIOCH-9 Tři otázky pro pozorného studenta  (1) Které meziprodukty CC poskytnou transaminací AK? (2) Jak může být CC napojen na syntézu lipidů? (3) Který z enzymů CC není lokalizován v matrix mitochondrie? 54 BIOCH-9 (1) Transaminace 2-oxokyselin 55 oxalacetát 2-oxoglutarát CC aspartát glutamát Které meziprodukty CC poskytnou transaminací AK? BIOCH-9 (2) Citrát přejde do cytosolu 56 malát biosyntéza MK CC mitochondrie citrát cytosol citrát oxalacetát acetyl-CoA jablečný enzym pyruvát CO2 NADPH H + + + + Jak může být CC napojen na syntézu lipidů? BIOCH-9 (3) Sukcinátdehydrogenasa je součástí DŘ ve vnitřní mitochondriální membráně 57 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 249. Q I. II. NADH + H NAD + matrix cytoplazma FAD FAD FAD glycerol-P DHAP sukcinát fumarát alkanoyl-CoA alkenoyl-CoACC I. Který z enzymů CC není lokalizován v matrix mitochondrie? Orgánová lokalizace buněčných dějů Děj Játra CNS Ledviny Sval Tuk. t. Ery CC + + + + + β-oxidace MK ++ - + ++ - Syntéza MK +++ ± ± ± +++ Ketogeneze + - - - - Oxidace KL* - + + ++ + Glykolýza + +++ + ++ + +++ Glukoneogeneze +++ - + - - - BIOCH-9 * KL = ketolátky 56 Intracelulární lokalizace metabolických dějů Jádro replikace DNA, syntéza RNA (transkripce DNA) Mitochondrie oxidační dekarboxylace pyruvátu, CC, DŘ, β-oxidace MK, synt. ketolátek, močoviny, hemu, Gln, AST reakce Ribosomy syntéza proteinů (translace mRNA) Hrubé ER syntéza proteinů Hladké ER synt. lipidů, chol., desaturace MK, hydroxylace xenobiotik Lysosomy nespecifické hydrolytické degradace různých látek Buň. membr. transport molekul a iontů, přenos informace do buňky (receptory) Golgiho ap. glykosylace proteinů, třídění a export proteinů Peroxisomy tvorba a degradace H2O2 Cytosol glykolýza, glukoneogeneze, glykogen, pentos. cykl., synt. MK, transaminace, synt. močoviny, močové kys., hemu; ALT r., EtOH BIOCH-9 57 BIOCH-9 Játra  Fosforylace glukosy  Glykolýza  Glukoneogeneze  Syntéza glykogenu  Glykogenolýza  Syntéza mastných kys.  Pentosový cyklus Tuková tkáň  Vstup glukosy  Glykolýza  Pentosový cyklus  Oxid. dekarboxylace pyruvátu  Hydrolýza TG v lipoproteinech  Syntéza TG  Lipolýza Svaly  Vstup glukosy  Glykolýza  Syntéza glykogenu  Glykogenolýza  Syntéza proteinů Vliv insulinu 58 BIOCH-9 Játra  Glykolýza  Glukoneogeneze  Syntéza glykogenu  Glykogenolýza  Syntéza mastných kyselin  Oxidation mastných kyselin Adipocyty  Lipolýza Vliv glukagonu (ne ve svalech) 59 BIOCH-9 C H2C COOH COOH O CH3 C O S CoA oxalacetát C H2C COOH COOH OH H2C COOH H2O HS-CoA C CH2 COOHHOOC C COOHH C H2C COOH COOH H CH COOHOH H2O H2O NAD+ NADH+H+ CO2 CH2 H2C COOH C COOHO NAD+ NADH+H+ HS-CoA CO2 CH2 H2C COOH CO S CoA CH2 CH2 COOH COOH GTP GDP + Pi HS-CoA FADH2 FAD C C COOH HOOC H H H2O C H2C COOH COOH HOH NAD+ NADH+H+ citrát cis-akonitát isocitrát 2-oxoglutarát sukcinyl-CoA sukcinát fumarát L-malát 0. Pyruvátdehydrogenáza 1. Citrát syntáza 2. Akonitáza 3. Izocitrát dehydrogenáza 4. α-ketoglutarát dehydrogenáza 5. Sukcinylkoenzym A syntetáza 6. Sukcinát dehydrogenáza 7. Fumaráza 8 . Malát dehydrogenáza BIOCH-9 1. Pyruvátdehydrogenáza Pyruvát dehydrogenáza, Pyruvát dehydrogenázový komplex je komplex tří enzymů uvnitř mitochondrie: pyruvát dehydrogenázy, dihydrolipoyltransacetylázy a dihydrolipoyldehydrogenázy. Komplex pracuje jako celek v přítomnosti koenzymů TPP, NAD+, lipoátu ve formě lipoamidu, FAD a koenzymu A. Pyruvát dehydrogenáza katalyzuje oxidativní dekarboxylaci pyruvátu s navázáním acetylu na TPP, dihydrolipoyltransacetyláza katalyzuje přenesení acetylu z TPP přes lipoamid na koenzym A a dihydrolipoyldehydrogenáza regeneruje lipoamid pomocí FAD, z něhož vzniká FADH2, které regeneruje zase pomocí NAD+, z něhož vzniká NADH + H+. Enzym je inhibován arsenem v oxidačním stavu As(III) (arseničnany,…), který blokuje lipoamid. 2. Citrát syntáza Katalyzuje přenesení acetylu z acetyl-S·CoA na oxalacetát za vniku citrátu. 3. Akonitáza Katalyzuje přesmyk citrátu na izocitrát přes cis-akonitát. Její aktivní centrum tvoří kuboidní klastr čtyř atomů síry a čtyř atomů železa, vázaného přes síru z postranních řetězců cysteinu. Tento enzym je stereospecifický s ohledem na prochirální vlastnosti citrátu. (To se dá prokázat značením pyruvátu pomocí uhlíku 14C.) Inhibuje ho (2R,3R)2-fluorocitrát. 4. Izocitrát dehydrogenáza Provádí oxidativní dekarboxylaci karboxylové skupiny na terciárním uhlíku izocitrátu za současné dehydrogenace hydroxy skupiny, přičemž se mění NAD+ na NADH + H+. Tento enzym využívá manganaté či hořečnaté ionty jako koenzym. 5. α-ketoglutarát dehydrogenáza Katalyzuje oxidativní dekarboxylaci za současného navázání α-keto uhlíku na koenzym A. Vzniká tak sukcinyl-S·CoA a NADH + H+ z NAD+. 6. Sukcinylkoenzym A syntetáza Provádí přesně opačnou reakci, než podle které se jmenuje. Katalyzuje hydrolýzu sukcinylkoenzymu A za současné fosforylace na substrátové úrovni, tedy vzniká přímo GTP z GDP (a ne až v dýchacím řetězci). 7. Sukcinát dehydrogenáza Provádí dehydrogenaci sukcinátu. Vzniká FADH2 z FAD. Dehydrogenace je vysoce stereospecifická a vzniká pouze fumarát a ne maleinát. Enzym je kompetitivně inhibován malonátem, který je o uhlík kratší než sukcinát, a proto nemůže dojít k dehydrogenaci. 8. Fumaráza Katalyzuje alkalickou hydrataci fumarátu za vzniku malátu. OH- provádí nukleofilní atak na uhlík, který díky rezonanci πelektronů získal parciální kladný náboj, čímž vniká karbanion, na který se naváže H+. 9. Malát dehydrogenáza Katalyzuje dehydrogenaci malátu na oxalacetát, čímž se substrát celého cyklu regeneruje. Tento enzym také může být zapojen v malátovém člunku. BIOCH-9 0. Pyruvátdehydrogenáza 1. Citrát syntáza 2. Akonitáza 3. Izocitrát dehydrogenáza 4. α-ketoglutarát dehydrogenáza 5. Sukcinylkoenzym A syntetáza 6. Sukcinát dehydrogenáza 7. Fumaráza 8 . Malát dehydrogenáza BIOCH-9 Enzymy klíčové pro regulaci CC a jejich inhibitory/aktivátory Enzym ATPa NADHa Jiný vliv Pyruvátdehydrogenasa - - - acetyl-CoA (inh. prod.) Citrátsynthasa - - citrát (inhibice produktem) Isocitrátdehydrogenasa - - + ADP (alosterická aktivace) 2-OG-dehydrogenasa - - sukcinyl-CoA (inh. prod.) 65 a allosterický inhibitor b zpětnovazebný inhibitor (inhibice produktem) c allosterický aktivátor NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 237. BIOCH-9 C H2C COOH COOH O CH3 C O S CoA oxalacetát C H2C COOH COOH OH H2C COOH H2O HS-CoA C CH2 COOHHOOC C COOHH C H2C COOH COOH H CH COOHOH H2O H2O NAD+ NADH+H+ CO2 CH2 H2C COOH C COOHO NAD+ NADH+H+ HS-CoA CO2 CH2 H2C COOH CO S CoA CH2 CH2 COOH COOH GTP GDP + Pi HS-CoA FADH2 FAD C C COOH HOOC H H H2O C H2C COOH COOH HOH NAD+ NADH+H+ citrát cis-akonitát isocitrát 2-oxoglutarát sukcinyl-CoA sukcinát fumarát L-malát 0. Pyruvátdehydrogenáza 1. Citrát syntháza 2. Akonitáza 3. Izocitrát dehydrogenáza 4. 2-oxoglutarát dehydrogenáza 5. sukcinyl-CoA-syntethasa 6. Sukcinát dehydrogenáza 7. Fumaráza 8 . Malát dehydrogenáza Schéma regulace citrátového cyklu • Popis: • červenými tečkami jsou označeny reakce, o jejichž regulaci se zajímáme • červené šipky naznačují alosterickou inhibici, která je zajištěna ATP a NADH+H+ (oranžové šipky naznačují, které reakce NADH+H+ produkují • fialové šipky naznačují inhibici produktem • zelená šipka naznačuje alosterickou aktivaci pomocí ADP BIOCH-9 NOVÁK, Jan. Biochemie I. Brno: Muni, 2009, s. 238. 41 BIOCH-9 Jména a struktury sloučenin, enzymy, popis regulací, Kofaktory… BIOCH-9 Jména a struktury sloučenin, enzymy,popis regulací BIOCH-9 1. Pyruvátdehydrogenáza Pyruvát dehydrogenáza, Pyruvát dehydrogenázový komplex je komplex tří enzymů uvnitř mitochondrie: pyruvát dehydrogenázy, dihydrolipoyltransacetylázy a dihydrolipoyldehydrogenázy. Komplex pracuje jako celek v přítomnosti koenzymů TPP, NAD+, lipoátu ve formě lipoamidu, FAD a koenzymu A. Pyruvát dehydrogenáza katalyzuje oxidativní dekarboxylaci pyruvátu s navázáním acetylu na TPP, dihydrolipoyltransacetyláza katalyzuje přenesení acetylu z TPP přes lipoamid na koenzym A a dihydrolipoyldehydrogenáza regeneruje lipoamid pomocí FAD, z něhož vzniká FADH2, které regeneruje zase pomocí NAD+, z něhož vzniká NADH + H+. Enzym je inhibován arsenem v oxidačním stavu As(III) (arseničnany,…), který blokuje lipoamid. 2. Citrát syntáza Katalyzuje přenesení acetylu z acetyl-S·CoA na oxalacetát za vniku citrátu. 3. Akonitáza Katalyzuje přesmyk citrátu na izocitrát přes cis-akonitát. Její aktivní centrum tvoří kuboidní klastr čtyř atomů síry a čtyř atomů železa, vázaného přes síru z postranních řetězců cysteinu. Tento enzym je stereospecifický s ohledem na prochirální vlastnosti citrátu. (To se dá prokázat značením pyruvátu pomocí uhlíku 14C.) Inhibuje ho (2R,3R)2-fluorocitrát. 4. Izocitrát dehydrogenáza Provádí oxidativní dekarboxylaci karboxylové skupiny na terciárním uhlíku izocitrátu za současné dehydrogenace hydroxy skupiny, přičemž se mění NAD+ na NADH + H+. Tento enzym využívá manganaté či hořečnaté ionty jako koenzym. 5. α-ketoglutarát dehydrogenáza Katalyzuje oxidativní dekarboxylaci za současného navázání α-keto uhlíku na koenzym A. Vzniká tak sukcinyl-S·CoA a NADH + H+ z NAD+. 6. Sukcinylkoenzym A syntetáza Provádí přesně opačnou reakci, než podle které se jmenuje. Katalyzuje hydrolýzu sukcinylkoenzymu A za současné fosforylace na substrátové úrovni, tedy vzniká přímo GTP z GDP (a ne až v dýchacím řetězci). 7. Sukcinát dehydrogenáza Provádí dehydrogenaci sukcinátu. Vzniká FADH2 z FAD. Dehydrogenace je vysoce stereospecifická a vzniká pouze fumarát a ne maleinát. Enzym je kompetitivně inhibován malonátem, který je o uhlík kratší než sukcinát, a proto nemůže dojít k dehydrogenaci. 8. Fumaráza Katalyzuje alkalickou hydrataci fumarátu za vzniku malátu. OH- provádí nukleofilní atak na uhlík, který díky rezonanci πelektronů získal parciální kladný náboj, čímž vniká karbanion, na který se naváže H+. 9. Malát dehydrogenáza Katalyzuje dehydrogenaci malátu na oxalacetát, čímž se substrát celého cyklu regeneruje. Tento enzym také může být zapojen v malátovém člunku.