© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 1
3 – Enzymy
Enzymů se v našem těle nachází tisíce – účastní se každé katalyzované reakce a umožňují její
průběh. V této kapitole se zaměříme na jejich obecné vlastnosti, kinetiku a kofaktory.
3.1 Obecné vlastnosti enzymů
O enzymech obecně můžeme říct, že se jedná o bílkoviny, které v našem těle fungují jako
biokatalyzátory. Mají různou specifitu (vzhledem k substrátu i účinku) a jsou vysoce účinné.
Jejich důležitou vlastností je, že fungují již za mírných podmínek a je možné je regulovat.
Kdybychom enzymy z našeho těla chtěli použít in vitro, museli bychom velice jemně nastavit
vnější podmínky, jinak by enzymy nefungovaly.
Na výše zmíněné obecné vlastnosti se nyní podíváme podrobněji.
Enzymy jako proteiny
Enzymy můžeme rozdělit na jednoduché a složené.
Jednoduché enzymy jsou tvořeny pouze bílkovinou, příkladem takových enzymů jsou hydrolasy.
Složené enzymy mají různou stavbu. Může se jednat o:
 proteiny s kovalentně navázanou prostetickou skupinou, či dočasně připojeným koenzymem
 metaloenzymy
 oligomerní multienzymové komplexy (tj. komplexy tvořené více podjednotkami)
 proteiny asociované s membránami
 ...
Enzymy jsou distribuovány různě a to, jak v těle (některé buňky produkují jen určité enzymy),
tak v buňce (některé enzymy najdeme jen v cytoplazmě, jiné jen v mitochondrii). Některé
enzymy tvoří tzv. izoformy, přičemž jedna izoforma se může nacházet v jedné části těla, druhá
izoforma v jiné (příkladem takového enzymu je laktátdehydrogenasa, která tvoří 5 izoforem).
Následující tabulka uvádí několik příkladů enzymů, které se vyskytují jen na určitých místech
v buňce, a proto je možné tyto enzymy použít např. k identifikaci buněčného kompartmentu, ze
kterého pocházejí (využíváno ve výzkumu).
Tabulka 1 - Enzymové markery subcelulárních frakcí
Frakce Enzym Typ enzymu Funkce enzymu
Plazmatická membrána Na+
/K+
-ATPasa hydrolasa transport iontů
Jádro DNA/RNA-polymerasa transferasa syntéza DNA/RNA
ER Glc-6-fosfatasa hydrolasa hydrolýza glc-6-P
ER cyt-b5-reduktasa oxidoreduktasa desaturace MK
GA galaktosyltransferasa transferasa syntéza glykoproteinů
Lyzosom kyselá fosfatasa hydrolasa hydrolýza fosfoesterů
Mitochondrie sukcinátdehydrogenasa oxidoreduktasa sukcinát → fumarát
Peroxisom katalasa oxidoreduktasa rozklad H2O2
Cytosol laktátdehydrogenasa oxidoreduktasa laktát → pyruvát
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 2
Enzymy jako biokatalyzátory
Úkolem enzymů v našem těle je katalyzovat v něm probíhající reakce. Fungují stejně jako
anorganické katalyzátory – snižují aktivační energii, čímž zvyšují rychlost reakce (rychlost reakce
je s enzymem o 106
-1014
rychlejší, než bez něj1
!), nijak neovlivňují rovnovážnou konstantu K.
Kdyby se v našem těle nenacházely enzymy, probíhaly by reakce tak pomalu, že by nedokázaly
zajistit existenci živé hmoty!
Pro zachování existence živé hmoty je důležité i to, že enzymy fungují za mírných podmínek:
 atmosférický tlak
 úzké rozmezí teplot (okolo 37°C)
 úzké rozmezí pH (tzv. pH optimum2
)
V okamžiku, kdy teplota přesáhne 50°C, dochází k denaturaci enzymů (tj. ke změně terciární a
kvartérní struktury, což znemožní enzymu provádět jeho funkci). Ke stejnému ději dojde i vlivem
vyššího, či nižšího pH.
Regulace enzymů
Enzymy je nutné „ovládat“, tedy regulovat. Existují různé způsoby regulace enzymů, hlavními
dvěma jsou:
a) regulace aktivity enzymu
Aktivita enzymu může být ovlivňována aktivátory, inhibitory a kovalentními
modifikacemi (např. fosforylací).
b) regulace množství enzymu
Množství enzymu je možné ovlivnit v místě proteosyntézy (zabráníme nebo urychlíme
syntézu enzymu), či v místě proteolýzy (urychlíme, či zpomalíme odbourávání enzymu).
Na tomto způsobu regulace se podílejí hormony (tzv. induktory nebo represory)
Specifičnost enzymů
Enzymy katalyzují jen určité reakce. Rozlišujeme dva typy specifičnosti:
a) specifičnost účinku
Tzn., že enzymy katalyzují pouze jeden typ reakcí (např. oxidaci, redukci…). Za tuto
specifitu je zodpovědný kofaktor (např. pokud je kofaktor NAD+
, víme, že bude docházet
k dehydrogenaci)
b) specifičnost substrátovou
Tzn., že enzymy katalyzují přeměnu pouze jednoho daného substrátu. Za tuto specifitu
je zodpovědný enzym (do jeho aktivního místa pasuje jen určitý substrát)
Stereospecifita enzymů
Enzymy jsou stereospecifické. V tomto ohledu můžeme rozlišit dva druhy přeměn:
a) přeměna achirálního substrátu na chirální produkt
Tzn. že látka, která není chirální (např. pyruvát) je přeměněna na chirální strukturu
(např. L-laktát). Druhá forma chirální struktury (R x L) nevzniká.
b) přeměna chirálního substrátu na produkt
Tzn. že enzym je vysoce specifický a když si má vybrat, zda přemění L nebo R formu,
vybere se pouze jednu (významné pro farmakologii).
1
Tento fakt je odlišuje od anorganických katalyzátorů, které reakce urychlují o několik řádů méněkrát.
2
V našem těle se nacházejí různé pufračním systémy jako např. systém hydrogenfosfátový,
hydrogenkarbonátový a bílkovinný, které se podílejí na udržování pH optima.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 3
Příklady stereospecifity enzymů:
ADa) Přeměna achirálního produktu na chirální produkt
Př. A1: Hydrogenace pyruvátu
Pyruvát je achirální molekula – neobsahuje uhlík se čtyřmi různými substituenty. Jeho
hydrogenace vede k vytvoření laktátu, který již chirální centrum obsahuje.
In vitro (tedy ve zkumavce) dojde ke vzniku racemické směsi L-laktátu a R-laktátu (nic nebrání
vodíkům připojit se „zleva“ nebo „zprava“):
H
C C
CH3
O
O
HO
H
C
COOH
CH3
HHO + C
COOH
CH3
OHH
L-laktát + D-laktát
In vivo (tedy v našem těle s působením enzymů) vznikne pouze L-laktát, protože enzym zabrání
hydrogenaci „zprava“, která by vedla ke vzniku R-laktátu.
H
C C
CH3
O
O
HO
C
COOH
CH3
HHO
enzym
L-laktát
Př. A2: Hydrogenace D-fruktosy
D-fruktosa je sice chirální molekula, ale obsahuje i achirální uhlík C2 na kterém je dvojná vazba.
Při hydrogenaci fruktosy se tento achirální uhlík přeměňuje na chirální.
In vitro vzniká racemická směs D-glucitolu a D-mannitolu.
In vivo vzniká pouze D-glucitol.
Př. A3: Hydratace fumarátu
Fumarát není chirální sloučeninou, jeho hydratací však vzniká jeden z možných enantiomerů
malátu. V těle je to vždy L-malát.
C
C
COOHH
HOOC H
H
H
O
H
H
O
adice z pravé
strany
C
COOH
CH2COOH
OHHC
COOH
CH2COOH
HHO
adice z levé
strany
L-malát D-malát
C C COOH
H
H
HOOC
H
O
H
Enzym
Substrát
In vitro In vivo
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 4
ADb) Přeměna chirálního substrátu na produkt
Některá léčiva fungují na základě toho, že do těla je vpravena jejich neaktivní forma a až
některou reakcí v těle vzniká forma aktivní. Je velice důležité, aby neaktivní forma „pasovala“ do
enzymu, který ji má za úkol přeměnit (přeměňuje-li enzym L-formu, musí být podána v L-formě).
R R
x
aktivní enantiomer neaktivní enantiomer
R
x
chirální substrát
vazebná
místa enzymu
Obdobně některá léčiva inhibují funkci enzymů – je tedy rovněž nezbytné, aby byla podána ve
vhodné konformaci, která zablokuje jejich aktivní místo.
3.2 Názvosloví enzymů a jejich klasifikace
Názvosloví enzymů rozlišujeme:
a) Triviální
Velice často používané, názvy mají historický původ. Často končí příponou –in nebo –asa.
Např. trypsin, pepsin; amylasa, lipasa
Existují i tzv. doporučené triviální názvy, které by se měly používat a jsou (alespoň některé)
odvozeny od „vlastností“ enzymu (viz dále)
b) Systematické (systémové)
Systematické názvosloví je komplikovanější. Název končí příponou –asa a obsahje informace
o substrátu (substrátech) a typu reakce.
Všechny známé enzymy jsou navíc popsány čtyřmístným kódem EC X.X.X.X, kde X je číslo.
První číslo ze čtveřice zařazuje enzym do jedné ze šesti hlavních skupin (viz dále)
Příklady některých názvů:
Doporučený triviální název: alkoholdehydrogenasa
Systémový název: EC 1.1.1.1 ethanol:NAD+
-oxidoreduktasa
Reakce: ethanol + NAD+
→ acetaldehyd + NADH+H+
Doporučený triviální název: alaninaminotransferasa (ALT)
Systémový název: EC 2.6.1.2 L-alanin:2-oxoglutarát-aminotransferasa
Reakce: L-alanin + 2-oxoglutarát → pyruvát + L-glutamát
Enzymy rozdělujeme do následujících 6 hlavních tříd (každá třída má své podtřídy):
1. OXIDOREDUKTASY
2. TRANSFERASY
3. HYDROLASY
4. LYASY
účinné léčivo neúčinné léčivo
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 5
5. ISOMERASY
6. LIGASY
Obecná charakteristika jednotlivých skupin:
AD1) OXIDOREDUKTASY
Katalyzují redoxní přeměny substrátů – používají k tomu různé mechanismy:
 přenos elektronů (např. cytochrom-c-oxidasa)
 přenos dvou atomů H (např. dehydrogenasy)
 zabudování atomu O do substrátu (např. monoexygenasy, dioxygenasy)
Příklady viz výše (uvedené hydrogenace)
AD2) TRANSFERASY
Transferasy katalyzují přenos skupin z jednoho substrátu na druhý. Tyto skupiny mohou být malé
(methyl, aminoskupina, glukosa) i velké (např. nukleotidy…).
Jednou podtřídou transferas jsou kinasy, které katalyzují přenos fosforylové skupiny –PO3
2–
z ATP na –OH skupinu substrátu.
Např. fosforylace glukosy:
AD3) HYDROLASY
Hydrolasy mají za úkol štěpit vazby vzniklé kondenzací za pomoci molekul vody. Následující
tabulka uvádí několik příkladů:
Tabulka 2 - Účinek hydrolas
Hydrolasa Typ štěpené vazby
glukosidasa glykosidová
galaktosidasa glykosidová
hyaluronidasa glykosidová
arylsulfatasa sulfoesterová
lysozym glykosidová
pepsin, trypsin peptidová
kathepsin peptidová
kolagenasa peptidová
elastasa peptidová
ribonukleasa fosfodiesterová
lipasa esterová
fosfatasa fosfoesterová
ceramidasa amidová
Poznámka: Je velice důležité rozlišovat kinasy (přenos fosforylové skupiny) a fosfatasy (hydrolasy odstraňující fosfát):
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 6
AD4) LYASY
Jedná se o další skupinu enzymů, které štěpí různé typy vazeb, avšak jejich štěpení je
nehydrolytické. Navíc vytvářejí vazby C-C, C-O a C-N.
Ze substrátu odštěpují, nebo do něj vnášejí malou molekulu (CO2, H2O…).
Např. fumaráthydratasa (katalyzuje hydrataci fumarátu – vnáší do něj vodu)
C
C
COOH
HOOC
H
H
fumarát
+ OH2
COOH
C
H2C
OH H
COOHH
L-malát
AD5) ISOMERASY
Katalyzují intramolekulové přesmyky atomů.
Např. glukosa-4-epimerasa přemění UDP-glukosu na UDP-galaktosu:
AD6) LIGASY
Ligasám se někdy též říká synthetasy. Katalyzují vznik energeticky náročných vazeb za
současného rozkladu makroergní sloučeniny (nejčastěji ATP).
Např. pyruvátkarboxylasa katalyzuje reakci:
pyruvát + CO2 + ATP + H2O → oxalacetát + ADP + Pi
Praktické poznámky:
Enzymy, které mají co do činění s fosfátem:
Enzym
(třída)
Schéma reakce
Typ reakce
Kinasa
(transferasa)
substrát-OH + ATP → substrát-O-P + ADP
fosforylace = přenos fosforylu na substrát
Fosfatasa
(hydrolasa)
substrát-O-P- + H2O → substrát-OH + Pi
hydrolýza fosfoesterové vazby
Fosforylasa
(transferasa)
(glykogen)n + Pi → (glykogen)n-1 + glukosa-1-P
fosforolýza = štěpení O-glykosidové vazby pomocí Pi (transfer glykosylu na Pi)
„Lýza“ třikrát jinak:
„Lýza“ Popis
Hydrolýza štěpení substrátu vodou, velmi časté v GIT, např:
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 7
sacharosa + H2O → glukosa + fruktosa
(škrob)n + H2O → (škrob)n-2 + maltosa
Fosforolýza štěpení O-glykosidové vazby fosfátem:
(glykogen)n + Pi → (glykogen)n-1 + glukosa-1-P
Thiolýza štěpení vazby C-C sírou z koenzymu A (skupina –SH) např. při β-oxidaci MK
nebo při štěpení ketolátek
R-CH2-CO-CH2-CO-SCoA + CoA-SH → RCH2-CO-SCoA + CH3-CO-SCoA
3.3 Kofaktory enzymů
Kofaktory jsou nízkomolekulární neproteinové sloučeniny, které se podílejí na funkční
specifičnosti enzymů. Většinou se podílejí na přenosu:
 2H nebo e–
(oxidoreduktasy)
 jiných skupin (transferasy)
Kofaktory rozlišujeme na:
a) prostetické skupiny (jsou pevně navázány k enzymu)
b) koenzymy (kosubstráty; jsou vázány volně/dočasně)
Podíváme-li se na obecný průběh enzymové reakce, můžeme říct, že se jí účastní tři hlavní
složky: substrát(y) + enzym + kofaktor
Substráty jsou většinou nízkomolekulární látky, stejně jako kofaktory. Právě s kofaktory
substráty reagují, přičemž dochází k jejich přeměně na produkty a k modifikaci kofaktory.
Enzymy jsou vysokomolekulární látky a jejich úkolem je koordinovat a urychlovat reakci.
(Vše má ale své výjimky a některé reakce probíhají bez kofaktoru – např. reakce hydrolas; jindy jsou zase substráty
vysokomolekulárními látkami).
V dalším textu se budeme věnovat podrobněji vybraným kofaktorům jednotlivých enzymových
skupin.
A) Kofaktory oxidoreduktas
Tabulka 3 - Kofaktory a vitaminy oxidoreduktas
Vitamin Kofaktor Funkce kofaktoru
niacin NAD+ akceptor 2H3
niacin NADPH+H donor 2H
riboflavin FAD, FMN akceptor 2H
tetrahydrobiopterin donor 2H
molybdopterin přenos elektronů
lipoát akceptor 2H
ubichinon přenos 2 elektronů (a 2H+
)
hem cytochromů přenos 1 elektronu
nehemové železo a síra přenos 1 elektronu
2 GSH (glutathion) donor 2H
3
Rozlišujme od sebe donory 2H (=redukční činidla) a akceptory 2H (=oxidační činidla) od donorů H+
(=kyselin) a akceptorů H+
(bází).
vznikají v lidském těle
(nepotřebují vitamin)
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 8
Kofaktory oxidoreduktas se vždy mohou vyskytovat buď ve své redukované formě, nebo ve své
oxidované formě. Oxidovaná a redukovaná forma tvoří redoxní pár charakterizovaný hodnotou
E°‘ (pH=7,00).
NAD+
NAD+
slouží jako dehydrogenační činidlo. Zkratka NAD se odvozuje z názvu
nikotinamidadenindinukleotid, znaménko plus se udává proto, že v molekule NAD+
se vyskytuje
čtyřvazný dusík, který je kladně nabitý.
N
+
CONH2
O
OH OH
H2C O P
O
O
OH
N
O
CH2O
OH
OH
O
P N
N
N
NH2
O R
R = H = NAD
R = P = NADP
pyridinium
ribosa
ribosa
kyselina
difosforečná
adenin
N-glykosidová vazba
ester ester
anhydrid
N-glykosidová vazba
NAD+ je kofaktorem enzymů dehydrogenas. Ze substrátu odjímá 2H (2H = H+
+ H–
). Jeden vodík
v podobě hydridového aniontu (H–
) se napojí do p-polohy pyridinového kruhu a druhý vodík se
ve formě protonu (H+
) uvolní do prostředí (resp. naváže na enzym; proto se redukovaná forma
zapisuje jako NADH+H+
).
N
CONH2
HH
2H -> H+
+ H-
N
+
CONH2
H
OXIDOVANÁ FORMA
aromatický kruh
čtyřvazný dusík
kladný náboj na dusíku
REDUKOVANÁ FORMA
aromaticita porušena
trojvazný dusík
neutrální sloučenina
vysoký obsah energie
Dehydrogenasy, které mají jako kofaktor NAD+
, způsobují vznik dvojné vazby mezi skupinami
(atomy):
 –CH2OH (primární alkoholová skupina)
 >CHOH (sekundární alkoholová skupina)
 >CHNH2 (sekundární aminová skupina)
Př. 1 Dehydrogenace etanolu (alkoholdehydrogenasa)
H
CH3 C
H
OH
ALKOHOLDEHYDROGENASA
NAD+
NADH+H+
CH3 C
H
O
ethanol acetaldehyd
Př. 2 Dehydrogenace glutamátu (glutamátdehydrogenasa)
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 9
H COOH
C
CH2
CH2
COOH
HN
H
GLUTAMÁTDEHYDROGENASA
NAD+
NADH+H+
COOH
C
CH2
CH2
COOH
N
H
glutamát
(2-aminokyselina)
2-iminokyselina
Příklady NAD+
-dependentních enzymů (též zvaných pyridinové dehydrogenasy):
Tabulka 4 - NAD+
-dependentní dehydrogenasy
Metabolická dráha Dehydrogenasa Reakce
citrátový cyklus
isocitrátdehydrogenasa isocitrát → 2-oxoglutarát
2-oxoglutarátdehydrogenasa 2-oxoglutarát → sukcinyl-CoA
malátdehydrogenasa malát → oxalacetát
glykolýza
glyceraldehyd-3-P-dehydrogenasa glyceraldehyd-3-P → 1,3-BPG
laktátdehydrogenasa laktát → pyruvát
oxidace ethanolu
alkoholdehydrogenasa ethanol → acetaldehyd
acetaldehyddehydrogenasa acetaldehyd → kyselina octová
NADPH+H+
Oproti NAD+
, je NADPH+H+
hydrogenačním činidlem (tedy donorem 2H). Účastní se:
 různých redukčních syntéz (např. syntéza mastných kyselin a cholesterolu)
 regenerace GSH v erytrocytech
 jako koreduktant různých hydroxylačních reakcí4
o obecně: R-H + O2 + NADPH+H+
→ R-OH + H2O + NADP+
o příklady: cholesterol → → žlučové kyseliny
kalciol → → kalcitriol
xenobiotikum → hydroxylované xenobiotikum
FAD
FAD je podobně jako NAD+
dehydrogenační činidlo, zkratka pochází z názvu
flavinadenindinukleotid.
4
Hyxdroxylační reakce jsou monooxygenasové reakce – do molekuly substrátu se vnáší pouze jeden
z atomů kyslíku. Druhý atom kyslíku je potřeba odstranit, čehož se chopí NADPH+H+
tak, že věnuje své dva
vodíky a umožní vznik vody.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 10
N
N
NH
N
O
O
CH3
CH3
CH2
HC
HC
HC
CH2
OH
OH
OH
O P O P O CH2
O O
OH OH
N
O
OH
N
N
N
NH2
OH
dimethylisoalloxazin
ribitol
ribosa
adenin
Jedná se rovněž o kofaktor dehydrogenas, konkrétněji se jedná o prostetickou skupinu
(flavinové kofaktory jsou pevně vázány na enzym a většinou se vyskytují na vnitřní
mitochondriální membráně).
Katalyzují vznik dvojné vazby mezi dvěma uhlíky (–CH2–CH2– → –CH=CH–). Odtržené 2H se
vážou na dusíky riboflavinu (naznačeno červenými šipkami).
Redoxní pár kofaktoru:
N
10
N
NH
N
1
O
O
CH3
CH3
N
H
10
N
NH
N
H
1
O
O
CH3
CH3
oxidovaná forma FAD
aromatický systém
neutrální sloučenina
redukovaná forma FADH2
aromaticita narušena
neutrální sloučenina
vysoký obsah energie
Př. Dehydrogenace sukcinátu na fumarát (flavinová dehydrogenasa)
COOH
CH2
CH2
COOH
SUKCINÁTDEHYDROGENASA
FAD FADH2
COOH
CH
CH
COOH
sukcinát fumarát
Tetrahydrobiopterin (TH4)
Tetrahydrobiopterin je hydrogenační činidlo, účastní se hydroxylačních reakcí, při nichž
poskytuje dva vodíky, které „odstraní“ nepoužitý druhý atom kyslíku ve formě vody (podobně
jako u NADPH+H+
). Po odevzdání 2H (oxidaci) se přeměnuje na dihydrobiopterin.
N
NH
N
H
N
H
N
O
CH CH CH3
OH OH
H
H
- 2H
+ 2H
N
NH
N
N
H
N
O
CH CH CH3
OH OH
H
tetrahydrobioterin
(BH4)
dihydrobioterin
(BH2)
Účastní se např. hydroxylace fenylalaninu na tyrosin
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 11
CH2
CH
COOH
NH2
+ O O + BH4
CH2
CH
COOH
NH2
OH
+ + BH2
fenylalanin tyrosin
OH2
Koenzym Q (ubichinon)
Koenzym Q je derivátem 1,4-benzochinonu a je důležitou součástí dýchacího řetězce. Je schopen
postupně přijmout dva elektrony (pochází z živin) a dva protony (pochází z matrix
mitochondrie), čímž se postupně redukuje na semiubichinon a ubichinol.
CH3H3CO
H3CO R
O
O
CH3H3CO
H3CO R
OH
O
CH3H3CO
H3CO R
OH
OH
e+
H+
e+
H+
ubichion
Q
semiubichion
QH
ubichinol
QH2
Poznámka: R ve vzorci je 50C dlouhý isoprenoidní řetězec, který ubichinonu uděluje lipofilní charakter a ukotvuje jej
v membráně.
Hem cytochromů
Hemy cytochromů přenáší jeden elektron – nastává reverzibilní přechod mezi Fe2+
a Fe3+
.
Cytochromy jsou hemové proteiny, které jsou významnou složkou dýchacího řetězce.
Nehemové železo a síra
Proteiny se železem a sírou jsou rovněž významnou složkou dýchacího řetězce, jejich úkolem je
přenášet jeden elektron. I když obsahují více iontů železa (jejich oxidační číslo by se mohlo
měnit), mění se vždy oxidační číslo jen jednoho atomu.
Nehemové železo a síra tvoří klastry Fe2S2 nebo Fe4S4 (podrobněji viz Dýchací řetězec).
S
Fe
3+
S
S
Fe
3+
S
S
S
Cys Cys
CysCys
+ e-
e-
S
Fe
3+
S
S
Fe
2+
S
S
S
Cys Cys
CysCys
oxidovaný stav redukovaný stav
Cys
Fe S
FeS
S Fe
SFe
S
S
S
S
Cys
Cys
Cys
klastr Fe2S2 klastr Fe4S4
Molybdopterin
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 12
Molybdopterin obsahuje ve své molekule pteridin, na který je navázán heterocyklus obsahují
molybden.
N
NH
N
H
N
H
ONH2
O
OPO3
-
S
S
Mo X
OX = O/S
Jedná se o kofakor oxygenas, např. xanthinoxidasy, či sulfitoxidasy.
Př. Reakce katalyzovaná xanthinoxidasou (oxygenace purinů)
N
NH
NH
N
O
hypoxantin
O2
H2O H2O2
XANTHINOXIDASA
N
H
NH
NH
N
O
O
xantin
O2
H2O H2O2
XANTHINOXIDASA
N
H
NH
NH
N
H
O
O
O
kyselina močová
Př.2 Sulfitoxidasa katalyzuje vznik síranového aniontu (sulfátu):
–SH skupina cysteinu je odbourána na HSO3
–
, který je oxidován na SO4
2–
(při této oxidaci vznikají i
protony, které okyselují vnitřní prostředí).
Lipoát
Lipoát je cyklický disulfid, systematickým názvem 1,2-dithiolan-3-pentanová kyselina. Na enzym
je napojen amidovou vazbou na lysin.
Po přijetí 2H, dojde k otevření cyklu a ke vzniku dvou –SH skupin:
1
2
S
3
S
4
5
6
7
CONH - Lysin - Enzym
8
1
2
SH
3
SH
4
5
6
7
CONH - Lysin - Enzym
8
lipoát dihydrolipoát
Lipoát je jedním z kofaktorů komplexu oxidační dekarboxylace 2-oxokyselin (např. pyruvátu)
Glutathion
Jedná se o tripeptid složený z glutamátu, cysteinu a glycinu, systematický název zní
γ-glutamylcysteinylglycin. Jedná se o kofaktor enzymu glutathionperoxidasy (což je enzym
obsahující selenocystein), která má za úkol redukovat peroxidy na vodu.
2 G-SH + H-O-O-H → G-S-S-G + 2 H2O
Praktická poznámka: sloučeniny obsahující –SH skupinu mají vždy redukční vlastnosti.
B) Kofaktory transferas
Tabulka 5 - Kofaktory a vitaminy transferas
Vitamín Kofaktor Přenášená skupina
----- ATP –PO3
2–
----- PAPS –SO3
2–
listová kyselina tetrahydrofolát (H4F) jednouhlíkaté skupiny
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 13
biotin karboxybiotin CO2
thiamin thiamindifosfát (TDP) „aktivní aldehyd“
pyridoxin pyridoxalfosfát –NH2
pantothenová kyselina CoA-SH acyl
----- dihydrolipoát acyl
[methionin] SAM –CH3
kyanokobalamin methylkobalamin –CH3
Všechny kofaktory transferas mají společné to, že jsou na sebe schopny navázat jistou skupinu a
přenést ji na jinou molekulu.
Pyridoxalfosfát
Pyridoxalfosfát je kofaktorem transaminas – podílí se na přenosu –NH2 skupiny z aminokyseliny
na 2-oxokyselinu (reakce se odehrává na skupině označené červenou šipkou; pro přesný popis reakce viz
Metabolismus AK).
NCH3
OH CH2
C
OH
PO
O
OH
OH
pyridoxalfosfát
ATP (adenosintrifosfát)
ATP je sloučenina, která má dvojí význam:
a) jako makroergní sloučenina je schopná dodávat energii do endergonních procesů
b) slouží jako kofaktor kinas (tedy jako fosforylační činidlo)
N
O
O
OH
O
OH
O
P N
N
N
NH2
O
OH
O
POH
OH
O
P
OH
anhydrid
anhydrid
ester
N-glykosidová vazba
adenin
ribosa
Jako kofaktor kinas katalyzuje přenos –PO3
2–
(fosforylové) skupiny.
PAPS (3‘-fosfoadenosin-5‘-fosfosulfát)
PAPS slouží jako sulfatační činidlo. Ve své molekule obsahuje smíšený anhydrid kyseliny
fosforečné a kyseliny sírové.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 14
N
O
O
O
O
O
-
O
P N
N
N
NH2
O
-
O
O
S
OH
O
-
O
O
P
smíšený
anhydrid
ester
ribosa
adenin
fosfát
"aktivovaný"
sulfát
Katalyzuje esterifikaci –OH skupin kyselinou sírovou.
Karboxybiotin
Jedná se o kofaktor karboxylačních reakcí. Aby bylo možné nějakou skupinu karboxylovat, je
nutné nejprve napojit oxid uhličitý na biotin (tato reakce vyžaduje energii v podobě ATP), za
vzniku karboxybiotinu, až po té, je možné –CO2 skupinu přenášet na další sloučeniny.
NH NH
S
O
COOH
biotin
ATP ADP + Pi
CO2
karboxybiotin
C
N NH
S
O
COOH
O
OH
Karboxybiotin se účastní např. karboxylace pyruvátu na oxalacetát.
Pozor! Karboxylace není obrácením dekarboxylace! Karboxylace vyžadují karboxybiotin,
dekarboxylace mohou probíhat spontánně (acetoacetát → aceton), nebo mohou být
katalyzovány enzymově, přičemž se jich účastní pyridoxalfosfát (u AK) nebo TDP (u
2-oxokyselin)!
Koenzym A (CoA-SH)
Koenzym A přenáší acyly vázané na atomu síry thioesterovou vazbou. Acyl-CoA je tzv.
aktivovaný acyl (např. acetyl-CoA).
N
O
O
O
O
O
-
O
P N
N
N
NH2
OH
O
-
O
O
P
CH2
O
-
O
PCH
CH3
CH3
C
OH
C
O
NHCH2 CH2C
O
NHCH2 CH2SH
cysteamin
-alanin
kyselina pantoová adenin
ribosa
vazba
acylu
SAM (S-adenosylmethionin)
Kofaktor metylačních enzymů – přenáší tzv. aktivní methyl navázaný na sulfonovém kationtu
(trojvazné síře). Trojvazná síra vzniká tak, že se methionin naváže na pátý uhlík ribosy právě přes
síru.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 15
N
O
S
+
OH
CH2 CH2
N
N
N
NH2
OH
CH3
HOOC CH
NH2
adenin
ribosa
methionin
aktivní
methyl
Účastní se např. přeměny fosfatidylethanolamin → fosfatidylcholin.
Po předání methylu, dojde k odštěpení homocysteinu od ribosy (homocystein se od methioninu
liší právě oním odevzdaným methylem).
H4F (H4-folát; tetrahydrofolát)
Jedná se o přenašeč jednouhlíkatých skupin:
 methylu (–CH3) (vznik: metabolismus methioninu přes SAM)
 methylenu (–CH2–) (vznik: katabolismus serinu a glycinu)
 formylu (–CHO) (vznik: katabolismus tryptofanu)
 formiminoskupiny (–CH=NH) (vznik: katabolismus histidinu (FIGLU))
 methenylu (–CH=) (vznik: katabolismus histidinu)
Jednouhlíkaté fragmenty se vážou na dusíky 5 a/nebo 10.
N
N
N
H
5
N
H
CH2 NH
10
C
O
NH CH
COO
-
CH2
CH2
COO
-
OH
NH2
tetrahydrofolát
vazba
jednouhlíkatých
skupin
Tetrahydrofolát se uplatňuje při syntéze purinů a při metylaci uracilu.
Methylkobalmin
Methylkobalamin vzniká z vitaminu B12 (=buď kyanokobalamin nebo hydroxokobalmin).
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 16
Poznámka: Povšimněme si, že vitamin B12 ve své struktuře obsahuje korinový cyklus.
Methylkobalamin je důležitý pro:
 regeneraci methioninu (provádí S-methylaci přidáním methylu, který předtím získal z
tetrahydrofolátu)
 regeneraci tetrahydrofolátu (odebírá methyl z methyl-tetrahydrofolátu, čímž jej
zregeneruje na tetrahydrofolát)
 průběh reakce propionyl-CoA → sukcinyl-CoA
Poznámka: Hydroxokobalmin se využívá při otravě kyanidy (váže kyanidové ionty a přeměňuje se na netoxický
kyanokobalmin).
TDP (thiamindifosfát)
Thiamin difosfát vzniká napojením dvou fosfátů na thiamin (tedy vitamin B1). Je přenašečem tzv.
aktivního aldehydu.
TDP je jeden z kofaktorů oxidační dekarboxylace 2-oxokyselin (stejně jako lipoát), např.
pyruvátu na acetyl-CoA a 2-oxoglutarátu na sukcinyl-CoA.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 17
3.4 Mechanismus enzymové reakce
Doposud jsme se bavili o obecných vlastnostech enzymů, jejich názvosloví, klasifikaci a
kofaktorech. Moc jsme si toho ale neřekli o tom, jak přesně probíhá enzymem katalyzovaná
reakce a co se při ní odehrává – to je naším úkolem nyní.
A) Aktivní místo enzymu
Substráty se při reakci vážou do tzv. aktivního místa enzymu. Jedná se o malou část molekuly,
jejíž podoba je udána trojrozměrným uspořádáním aminokyselin (toto uspořádání je ovlivněno
tím, jaké AK se v aktivním místě nacházejí – jejich skupiny se mohou odpuzovat nebo přitahovat).
Obecně lze rozlišit:
a) tvar hluboké štěrbiny (např. amylasa)
b) tvar povrchové prohlubně
Důležité je uvědomit si, že na stavbě aktivního místa se mohou podílet AK, které jsou od sebe
v primární struktuře velice vzdáleny (při úpravě enzymu do jeho konečné terciární struktury se
k sobě tyto AK mohou přiblížit).
Aktivní místo není rigidní struktura – může se přizpůsobit tvar substrátu, pro který je určeno.
B) Teorie indukovaného přizpůsobení
Teorie indukovaného přizpůsobení se týká vazby substrátu na enzym. Vychází z výše uvedeného
faktu, že aktivní místo má možnost trochu pozměnit svou konformaci, která umožní vazbu
substrátu a průběh reakce.
Po přiblížení substrátu k aktivnímu místu enzymu, vyvolá substrát odpovídající konformační
změnu v aktivní místě a napojí se na enzym, čímž se vytvoří komplex enzym-substrát (ES):
Vazbu substrátu v aktivním místě je poměrně slabá.
C) Počet substrátů
Počet substrátů, které se reakce účastní, ovlivňuje katalytický mechanismus působení enzymu.
Monosubstrátové reakce probíhají podle následujícího schématu:
S + E ↔ {ES … … … EP} ↔ P + E
Substrát se naváže na enzym, přemění se na produkt a oddělí se od enzymu.
Dvousubstrátové reakce probíhají následujícím způsobem:
SA + SB + E ↔ {ESAB … … … EPAB} ↔ PA + PB + E
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 18
Uvědomme si, že druhým substrátem reakce je ve velkém množství případů kofaktor.
Průběh dvousubstrátových reakcí může být dvojí, rozlišujeme:
a) sekvenční reakce
a. uspořádané
b. nahodilé
b) ping-pongové reakce
Při sekvenční reakci se oba substráty navážou na enzym, pak proběhne chemická přeměna a
následně uvolnění produktů.
Je-li sekvenční reakce uspořádaná, napojují se substráty na enzym v určitém pořadí a stejně tak
se z něj v určitém pořadí uvolňují produkty.
Např. Přeměna pyruvátu na laktát:
Je-li sekvenční reakce nahodilá, je jedno, v jakém pořadí se substráty napojí. Reakce proběhne
v obou případech.
Např. Vznik fosfokreatinu:
Při ping-pongových reakcích, které jsou typické pro aminotransferasy, dojde k navázání jednoho
substrátu, jeho přeměně, uvolnění (na enzymu většinou zůstane část molekuly prvního substrátu, která má být
přenesena na druhý substrát) a následně k tomu stejnému s druhým substrátem.
Např. Transaminace:
D) Katalytické skupiny aktivního místa
Chemickou přeměnu v aktivním místě katalyzují katalytické skupiny pocházející z aminokyselin,
které aktivní místo tvoří.
Rozlišujeme katalytické skupiny:
a) nukleofilní (cystein-SH, serin-OH)
b) kyselé (aspartát, glutamát)
c) bazické (histidin, arginin, lysin)
Podle charakteru katalytické skupiny pak probíhají reakce různými mechanismy:
a) acidobazické reakce (přenáší se proton)
b) vytvoření přechodné kovalentní vazby
c) katalýza kovovým iontem (metaloenzymy)
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 19
d) elektrostatické interakce (bez vody)
e) deformace substrátu
Fungování katalytických skupin si vysvětlíme na příkladu chymotrypsinu, enzymu, který štěpí
peptidovou vazbu.
V jeho aktivním místě se nachází histidin (poloha 57) a serin (poloha 195). –OH skupina serinu
provede nukleofilní atak na karbonylový uhlík peptidové vazby. Tím se s ním spojí a oddělí jej od
dusíku, který se na sebe naváže vodík z histidinu. Aby vodík histidinu nechyběl, sebere si jej od
-OH skupiny serinu.
před působením enzymu výsledek (rozštěpená peptidová vazba)
3.5 Metaloenzymy
Metaloenzymy obsahují ve své molekule kovové ionty. Můžeme rozlišit dvě skupiny enzymů:
a) enzymy, které obsahují funkční kovové ionty, které se přímo účastní katalyzované
reakce (v tomto případě jsou ionty kovů na enzym pevně navázány)
b) enzymy, které potřebují ionty kovů pouze k aktivaci (v tomto případě jsou ionty kovů na
enzym navázány slabě; většinou se jedná o dvojmocné ionty jako Ca2+
u koagulačních
faktorů, nebo Mg2+
některých kinas)
Kation kovu je součástí tzv. ternárního komplexu (tj. komplexu obsahujícího tři složky):
 enzym (Enz)
 substrát (S)
 kationt kovu (M)
V komplexu mohou být složky různě napojeny:
 Enz-S-M
 Enz-M-S
Podle způsobu napojení mohou vznikat i cyklické komplexy, případně chaláty.
Ionty kovu mohou reakci katalyzovat různými mechanismy:
 do svých vakantních orbitalů přijmou elektronový pár nukleofilu, čímž vznikne σ-vazba
 napojí se na vhodné skupiny enzymu či substrátu (vytvoří chelát), čímž deformují jejich
strukturu, což se může projevit jako pnutí, které usnadní chemickou přeměnu (tj. napjaté
molekuly jsou méně stabilní – je snazší na ně něco napojit, nebo z nich něco odebrat)
 kolem každého kationtu kovu je jistá koordinační sféra, která působí jako trojrozměrný
templát, což může sloužit pro stereospecifickou kontrolu (tj. kov upraví aktivní místo enzymu tak, že
bude odpuzovat jednu z konformací a do reakce vpustí jen tu správnou konformaci).
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 20
Kationty kovů, které se uplatňují v metaloenzymech:
Molybden
Je součástí některých oxidoreduktas – např. může být složkou kofaktoru molybdopterinu.
Ten je kofaktorem: xanthinoxidasy (xantin → kyselina močová)
sulfitoxidasy (HSO3
–
→ SO4
2–
)
Zdroje molybdenu: luštěniny, celozrnné obiloviny
Zinek
Zinek je součástí velkého množství enzymů, např:
 alkoholdehydrogenasa (ethanol → acetaldehyd)
 karbonátdehydratasa (H2O + CO2 ↔ H2CO3)
 karboxypeptidasy (štěpení polypeptidů od C-konce)
 Cu,Zn-superoxiddismutasa (cytosolová izoforma SOD; 2·O2
–
+ 2H+
→ O2 + H2O2)
Zdroje zinku: červené maso, korýši, luštěniny, slunečnicová a dýňová semínka, celozrnné obilniny
Měď
Je součástí mnoha oxidoreduktas:
 ceruloplazmin (též ferrooxidasa; Fe2+
→Fe3+
)
 cytochrom-c-oxidasa (DŘ, přenos elektronů na kyslík)
 monoaminooxidasy (MAO; aktivují biogenní aminy přeměnou na aldehydy; vzniká H2O2)
 dopaminhydroxylasa (dopamin → noradrenalin)
 lysyloxidasa (vyzrávání kolagenu; lysin →allysin)
Zdroje mědi: játra, maso, kakao, luštěniny, ořechy
Mangan
Je součástí hydroxylas, dekarboxylas a transferas.
 Mn-superoxiddismutasa (mitochondriální forma SOD)
 arginasa (arginin → močovina + ornithin)
 syntéza proteoglykanů a glykoproteinů
Zdroje manganu: luštěniny, celozrnné obilniny, ořechy
Železo
Je součástí hemových enzymů, či nehemových přenašečů elektronů.
 katalasa (hem; H2O2 → H2O + ½ O2)
 myeloperoxidasa (hem; neutrofily; H2O2 + Cl–
+ H+
→ HClO + H2O)
 cytochromy (hem; přenašeče elektronů v DŘ)
 Fe-S proteiny (nehem; přenašeče elektronu v DŘ)
Zdroje železa: výrobky z vepřové, husí a kachní krve, (červené) maso, játra, žloutek, ořechy
Selen
Selen obsahuje několik enzymů, které obsahují ve své molekule AK selenocystein. Účastní se
redoxních reakcí.
 glutathionperoxidasa (2 GSH + H-O-O-H → 2 H2O + G-S-S-G)
 dejodasy thyroninů (tyroxin T4 → trijodthyronin T3)
 thioredoxin reduktasy (ribosa → deoxyribosa)
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 21
 selenoprotein P (plazma; antioxidační funkce)
Zdroje selenu: hlavonožci, mořské ryby, luštěniny
3.6 Kinetika enzymových reakcí
Kinetika je oblast chemie, která se zabývá tím, jak reakce probíhají. Základní veličinou v tomto
ohledu bude rychlost chemické reakce (reakční rychlost), která je dána jako úbytek koncentrace
substrátu za určitý čas, respektive příbytek koncentrace produktů za určitý čas (obecně řečeno:
změna koncentrační složky za čas).






sl
mol
Δt
Δ[P]
Δt
Δ[S]
v 5
Jedná se o vždy kladnou veličinu, jejíž jednotkou je mol/l.
s.
Další možností, jak rychlost reakce vyjádřit, je využití kinetické rovnice, která udává závislost
reakční rychlosti na koncentraci reaktantů.
Pro reakci S → P je její tvar následující:
1
[S]k[S]kv 
kde k je rychlostní konstanta.
Index „na prvou“ u koncentrace substrátu udává řád reakce – jedná se tedy o reakci 1. řádu, při
níž je rychlost reakce přímo úměrná koncentraci substrátu (grafické znázornění závislosti
velikosti rychlosti na koncentraci substrátu je přímka).
Během reakce dochází k poklesu koncentrace substrátu a k nárůstu koncentrace produktu. Při
vynesení koncentrace (substrátu/produktu) na osu y a při vynesení času na osu x, získáme tzv.
kinetickou křivku, která nám popisuje časovou závislost koncentrace reaktantů na čase.
Kinetická křivka se vždy týká pouze jedné reakce.
Z kinetické křivky je možné odvodit rychlost chemické reakce tak, že k ní vytvoříme tečnu,
zvolíme si čas 1 a čas 2 a k nim odpovídající hodnoty koncentrace, které následně odečteme
5
Tato definice platí pro průměrnou rychlost, pro výpočet okamžité rychlosti bychom museli vycházet
z derivací, tedy nekonečně malých čísel.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 22
(získáme rozdíl času ∆t a rozdíl koncentrace ∆[S] nebo ∆[P]) a takto získané hodnoty pak
vydělíme.
Zvláštním typem reakce je reakce 0. řádu:
k1k[S]kv 0

Rychlost takovéto reakce není závislá na koncentraci substrátu, je konstantní a odpovídá
rychlostní konstantě.
Reakce 0. řádu nastávají při velkých nadbytcích substrátu (tzn. jeho úbytek je prakticky
zanedbatelný) a v těle neprobíhají. Je možné je uskutečnit pouze v laboratorních podmínkách.
Počáteční rychlost
Počáteční rychlost v0 je rychlost změřená na začátku reakce, ještě dříve, než stihne vzniknout
významnější množství produktu. Jedná se o nejvyšší hodnotu rychlosti, není ovlivněna úbytkem
substrátu ani vratnou přeměnou produktu. Stanovujeme ji z kinetických křivek.
I počáteční rychlost je závislá na koncentraci substrátu – tuto závislost popisuje rovnice
Michaelise a Mentenové (platí ale pouze pro jednosubstrátové reakce).
m
max0
K[S]
[S]
Vv


kde: Vmax je maximální rychlost (pro danou koncentraci enzymu [E])
Km je Michaelisova konstanta
Grafickým znázorněním rovnice Michaelise a Mentenové je saturační křivka (neplést s křivkou
kinetickou!). Ta popisuje závislost počáteční rychlosti na koncentraci substrátu a získává se tak,
že provedeme mnoho měření se stále stejnou koncentrací enzymu, avšak měníme koncentrace
substrátu (tímto způsobem získáme sadu kinetických křivek, ze kterých odečteme počáteční
rychlosti a ty graficky zaznačíme k příslušným koncentracím substrátu). Tvar saturační křivky
odpovídá hyperbole.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 23
Z rovnice Michaelise a Mentenové vyplývají následující fakta:
1) Je-li koncentrace enzymu [S] mnohem menší, než Michaelisova konstanta, řídí se reakce
kinetikou prvního řádu
Je-li [S]<<Km, lze rovnici zapsat takto:
2) Je-li koncentrace enzymu [S] mnohem větší, než Michaelisova konstanta, řídí se reakce
kinetikou nultého řádu
Je-li [S]>>Km, lze zapsat rovnici takto:
0
maxmaxmax0 k[S]1V
[S]
[S]
V
[S]
[S]
Vv
mK



3) Je-li koncentrace enzymu [S] rovna Michaelisově konstantě, probíhá reakce polovinou
maximální rychlosti
Je-li [S]=Km, lze zapsat rovnici takto:
2
V
2[S]
[S]
V
[S][S]
[S]
Vv max
maxmax0 


Výše popsané skutečnosti lze znázornit i na saturační křivce. Hodnota Km ji více méně rozděluje
na dvě poloviny – v levé polovině běží reakce „kinetikou nultého řádu“, v právě polovině běží
„kinetikou prvního řádu“.
Michaelisova konstanta KM
1
m
max
m
max0 [S]k[S]
K
V
K
[S]
Vv
[S]



© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 24
Rozměr Michaelisovy konstanty je stejný jako rozměr koncentrace (mol/l), jelikož Michaelisova
konstanta udává koncentraci substrátu, při které reakce probíhá polovinou maximální rychlosti
(viz případ 3). To také znamená, že při této koncentraci substrátu je enzym z poloviny nasycen.
Další význam Michaelisovy konstanty tkví v tom, že je nepřímo úměrná afinitě enzymu pro daný
substrát (tzn., že existuje-li více strukturně podobných substrátů, tak ten, který má nejnižší
hodnotu KM se považuje za nejpřirozenější pro daný enzym, tedy bude nejsnáze podléhat reakci;
lze říci, že jej „enzym bude preferovat“)
Hodnoty Km a Vmax charakterizují kinetické vlastnosti enzymu. Dají se snadno zjistit
z linearizovaného grafu. Graf zlinearizujeme dvojitým reciprokým vynesením podle
Lineweaver-Burka. 1/v0 se vynáší proti 1/[S].
Matematicky lze reciproký vztah odvodit následovně:
m
max0
K[S]
[S]
Vv











[S]
K
[S]
[S]
V
1
[S]
K[S]
V
1
v
1 m
max
m
max0
[S]
1
V
K
V
1
v
1
max
m
maxo

Takto získaný vztah je již rovnicí přímky, přičemž:
 1/v0 je závisle proměnná
 1/[S] je nezávisle proměnná
 KM/Vmax je směrnice přímky
 1/Vmax je úsek na ose závisle proměnné
Linearizovaný graf by vypadal následovně:
Koncentrace enzymu
Doposud jsme se bavili o tom, jak koncentrace substrátu ovlivňuje průběh reakce. Ale průběh
reakce je ovlivněn i koncentrací enzymu.
Počáteční rychlost je přímoúměrná celkové koncentraci enzymu:
t0 [E]kv 
kde: [E]t je celková (totální) koncentrace enzymu
Od koncentrace enzymu se odvíjí i tvar saturační křivky:
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 25
Povšimněme si, že enzym neovlivňuje hodnotu KM, ale mění se hodnota Vmax.
Stanovení množství enzymu v biologickém materiálu
Stanovit množství enzymu, nacházející se např. v krevním séru, je velmi obtížné hned z několika
důvodů:
 ve vzorcích se nacházejí stopové koncentrace enzymů
 ve vzorcích se nachází velké množství dalších proteinů
 nelze využít běžné chemické důkazové reakce (nelze podle jejich výsledků rozlišit
jednotlivé enzymy)
Pro stanovení množství enzymu v biologickém materiálu se užívají dva typy metod:
a) nepřímé stanovení
Při nepřímém stanovení stanovujeme produkt enzymové reakce.
Využíváme veličinu zvanou katalytická koncentrace (µkatal/l).
Tímto způsobem se stanovuje většina klinicky významných enzymů.
b) přímé stanovení
Při přímém stanovení stanovujeme rovnou množství enzymu (označíme jej jako antigen, či
imunochemicky).
Využíváme veličinu hmotnostní koncentrace (µg/l).
Tímto způsobem se stanovují jen některé specifické enzymy, např. tumorové markery.
Katalytická aktivita enzymu
Jedná se o veličinu, jejíž jednotkou je katal [kat = mol/s]. Jeden katal je katalytická aktivita
enzymu, při které se v reakci přemění jeden mol substrátu za jednu sekundu.
Kromě katalu se pro vyjádření katalytické aktivity využívá i tzv. mezinárodní jednotka IU
(international unit), kterou definujeme pomocí vztahu: 1 IU = µmol/min.
Z definičního vztahu vyplývají i následující vztahy převodní:
 1 µkat = 60 IU
 1 IU = 16,6 nkat
Katalytická koncentrace enzymu
Tato jednotka se využívá při nepřímém stanovení a je definována jako katalytická aktivita
vztažená na objem biologické tekutiny (např. krevní sérum).
Jednotkou je mkat/l, či µkat/l.
Warburgův (optický, UV) test
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 26
Warburgův test je možné využít pro stanovení aktivity NAD(P)-dependentních dehydrogenas
nebo pro stanovení aktivity ostatních enzymů, po té, co je reakce jimi katalyzovaná spřažena
s některou z NAD(P)-dependentní dehydrogenasou.
Jak je tedy patrné, je možné využít tento test pouze
pro reakce, kterých se účastní NAD(P)+
.
Warburgův test totiž vychází z následujícího
předpokladu: NAD(P)+
a NAD(P)H+H+
absorbují při
vlnové délce 340 nm značně odlišná množství
procházejících paprsků (mají jinou absorbanci A).
Absorbance je veličina, kterou je možné měřit kontinuálně, tedy během testu. To nám umožňuje
pozorovat nárůst koncentrace NAD(P)H+H+
(absorbance se zvyšuje) nebo úbytek jeho
koncentrace (absorbance se snižuje).
Katalytickou koncentraci (tedy aktivitu enzymu v biologickém materiálu) pak lze odvodit od
rychlosti nárůstu absorbance (čím větší aktivita enzymu, tím rychleji absorbance roste):
Δt
ΔA
ekoncentracákatalytick 340

Např. Stanovujeme-li katalytickou koncentraci enzymu laktátdehydrogenasy (LD), která bude
katalyzovat reakci: pyruvát + NADH+H+
↔ laktát + NAD+
, bude absorbance klesat.
V laboratořích se ve skutečnosti při stanovování katalytické aktivity postupuje následovně:
 jsou zajištěny optimální podmínky (teplota, pH, dostatek kofaktorů)
 měří se ∆[S] nebo ∆[P] v určitém časovém intervalu:
o je-li to možné průběžně – např. s využitím Warburgova testu
o není-li průběžné měření možné, využívají se konstantní časové úseky; viz dále
 reakční podmínky jsou nastaveny tak, aby reakce probíhala kinetikou 0. řádu ([S]>>KM), tedy
aby byla rychlost reakce konstantní a přibližovala se Vmax
6
Pro stanovení katalytické koncentrace se tedy využívají dvě metody:
a) Metoda kinetická
Používá se u reakcí, u kterých lze průběžně měřit [S] nebo [P], např. po deseti sekundách.
Tímto měřením můžeme sestrojit kinetickou křivku, ze které zjistíme v0. Jedná se o metodu
velmi přesnou, ale bohužel není proveditelná u všech enzymů.
6
Koncentrace substrátu [S] by měla být asi 100x větší, než Km.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 27
b) Metoda konstantního času
Používá se tam, kde nelze použít metodu předchozí. Měříme [P] po proběhnutí reakce.
Kinetickou křivku nejsme tedy schopni sestrojit (známe jen konečné hodnoty). Z naměřených
hodnot však získáme průměrnou rychlost (∆[P]/∆t). Metoda je méně přesná.
3.7 Příklady
1) Laktát dehydrogenasa má katalytickou aktivitu 2 μkat. Kolik molekul laktátu vznikne
z pyruvátu za 1 minutu při nadbytky substrátu?
Katalytická aktivita 2 μkat znamená, že za sekundu vzniknou 2 μmoly laktátu.
Za 60 sekund vznikne 60*2 μmol = 120 μmol = 120*10-6
mol.
Látkové množství vynásobíme Avogadrovou konstantou a získáme výsledek: 7,23 *1019
molekul
2) Jaké látkové množství produktu vznikne za 10 minut při reakci katalyzované enzymem o
aktivitě 10 μkat? Co je podmínkou toho, aby teoreticky vypočtené množství skutečně vzniklo?
Při aktivitě 10 μkat je daný enzym schopný vytvořit 10 μmol dané látky za sekundu. Za 10
minut (tedy 600 sekund) vznikne 6000 μmol dané látky, po převedení pak 6 mmol.
Aby mohlo výše vypočtené množství, je potřeba, aby byl v reakční směsi nadbytek substrátu.
3) Do reakční směsi obsahující substrát a pufr bylo přidáno 0,1 ml séra. Jaká je katalytická
koncentrace enzymu, jestliže po 10 minutách měření metodou konstantního času obsahovala
reakční směs 6 μmol produktu?
Ze zadání vyplývá, že za 10 minut (600 sekund) vzniklo 6 μmol produktu. Za 1 sekundu tedy
vznikne 0,01 μmol, z čehož vyplývá, že katalytická aktivita je 0,01 μkat.
Katalytickou koncentraci získáme tak, že katalytickou aktivitu podělíme objemem séra, tedy:
0,01/0,0001 = 100 μkat/l.
4) Určete aktivitu katalasy, bylo-li zjištěno, že při nadbytku H2O2 v reakční směsi se uvolní po 10
minutách 6,72 μl O2 (za normálních podmínek).
Nejdříve zjistíme, kolik molů O2 se uvolnilo: 6,72 μl= 6,72 μdm3
= [6,72*10-6
]/22,4 dm3
= 0,3
μmol
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 28
0,3 μmol vzniklo za 10 minut (600 sekund), za 1 sekundu vzniklo tedy 0,5 nmol O2.
Reakce probíhá dle rovnice: 2 H2O2 → 2 H2O + O2
Z rovnice vyplývá, že aby mohl vzniknout 1 mol kyslíku, musí kataláza rozložit 2 moly H2O2.
Vzniklo-li tedy 0,5 nmol O2, bylo potřeba rozložit 1 nm H2O2 a aktivita katalasy je tedy 1 nkat.
5) Při enzymové reakci byl do roztoku substrátu v pufru přidán vzorek obsahující enzym (0,1 ml).
Po 5 minutách bylo stanoveno 0,2 mmol produktu. Jaká je katalytická koncentrace enzymu?
Za 5 minut (300 sekund) vzniklo 0,2 mmol produktu. Za 1 sekundu by tedy vzniklo 0,67 μmol.
Reakce proběhla v 1 ml roztoku, po převedení na litry získáme katalytickou koncentraci:
0,67 μmol/ 0,0001 l = 6700 μkat = 6,7 mkat/l.
6) Reakční směs obsahovala:
2,5 ml pufru 0,1 ml krevního séra
0,2 ml roztoku koenzymu NADH 0,2 ml roztoku substrátu
Po 60 sekundách byl pokles absorbance koenzymu ΔA=0,03. Víme, že εNADH=6220 l/mol·cm,
šířka kyvety byla 1 cm. Jaká je katalytická koncentrace enzymu?
Dle Lambert-Beerova zákona víme, že lcΔεΔA  (vyjádříme si Δc). Navíc víme, že k této
změně došlo za 60 sekund (= Δt; tento čas zahrneme do vzorečku)
μmol/s0,08
6016220
0,03
Δtlε
ΔA
Δt
Δc





Musíme si uvědomit, že enzym, který nás zajímá se nacházel v krevním séru (0,1 ml), objem
vzorku s ostatními přísadami je ale 3 ml, sérum je tedy 30x zředěno! Toto zředění
započítáme: 0,08 μmol/s * 30 = 2,4 μkat/l
3.8 Inhibice enzymů
Inhibitory jsou látky, které snižují aktivitu enzymů.
Inhibici můžeme rozdělit na:
 ireverzibilní (nevratnou)
 reverzibilní (vratnou)
o kompetitivní
o nekompetitivní
Ireverzibilní inhibice
V případě nevratné inhibice dochází k trvalému poškození enzymu, který již nadále není schopen
plnit svou funkci. Inhibitory se pevně naváží do aktivního místa (kovalentní vazbou) a zabrání
navázání substrátu.
Příkladem ireverzibilních inhibitorů jsou:
 organofosfáty (inhibují např. acetylcholinesterázu)
 ionty těžkých kovů (navazují se na –SH a –OH skupiny)
 kyanidy (vytvářejí komplexy s kationty kovů; inhibují např. cytochrom-c-oxidasu)
Reverzibilní inhibice
V případě vratné inhibice se inhibitory volně váží do aktivního místa enzymu nebo mimo něj.
Dochází ke vzniku rovnováhy v reakci E + I ↔ EI.
Inhibitor lze z enzymu odstranit pomocí dialýzy, gelové filtrace apod.
Rozlišujeme dva základní typy reverzibilní inhibice: kompetitivní a nekompetitivní.
Kompetitivní inhibice
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 29
V případě kompetitivní (od slova compete – soutěžit), je inhibitor strukturně podobný
substrátu. Stejně jako substrát se váže do aktivního místa a soutěží s přirozeným substrátem o
toto místo (většinou vyhrává ten, který se v okolí enzymu nachází ve vyšší koncentraci).
Př. Inhibitor sukcinátdehydrogenasy je malonát
(Sukcinátdehydrogenasa je enzym citrátového cyklu; katalyzuje reakci: sukcinát → fumarát)
CH2
CH2
COO
-
COO
-
CH2
COO
-
COO
sukcinát
malonát
Kompetitivní inhibice se (z pohledu kinetiky)
projevuje tak, že maximální rychlosti je
dosaženo za vyšších hodnot koncentrace
substrátu7
:
 Vmax se tedy nemění
 Km se ale zvyšuje8
Nekompetitivní inhibice
V tomto případě nedochází k žádné soutěži.
Inhibitor se váže mimo aktivní místo enzymu –
váže se tedy stejnou měrou jak na samotný enzym,
tak na komplex enzym-substrát. Z pohledu kinetiky
to vypadá, jakoby enzymu bylo méně, což se
projeví tak, že:
 Vmax se snižuje
 Km se nemění
Využití inhibitorů v lékařství
Mnohá léčiva slouží jako inhibitory různých enzymů:
 kyselina acetylsalicylová, či ibuprofen slouží jako inhibitor enzymu cyklooxygenasy (COX)
 statiny inhibují HMG-CoA-reduktasu (snižují syntézu cholesterolu; př. lovastatin)
 inhibitory ACE (angiotensin konvertujícího enzymu) slouží k léčbě hypertenze (př. enalapril)
 reverzibilní inhibitory acetylcholinesterázy se užívají k léčbě nervosvalových chorob, či
pooperační atonii střev (př. neostigmin)
 selektivní inhibitory mozkové acetylcholinesterázy slouží k léčbě Alzheimerovy choroby
(př. rivastigmin, galantamin)
Jiné inhibitory jsou využívány jako antibiotika:
 peniciliny inhibují bakteriální transpeptidasy (zabraňují tak výstavbě buněčné stěny)
7
Lze říci, že při kompetitivní inhibici to vypadá, jakoby enzym ztrácel afinitu k substrátu (zmenšuje-li se
afinita, zvyšuje se Km)
8
Km je taková koncentrace substrátu, při které reakce probíhá polovinou maximální rychlosti… zvýší-li se
koncentrace potřebná pro dosažení maximální rychlosti, zvýší se i Km
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 30
 tetracykliny, makrolidy, chloramfenikol inhibují proteosyntézu
 fluorované chinoliny inhibují bakteriální gyrasy, které slouží k uvolňování superstáčení
během replikace DNA, čímž replikaci zastaví (např. ciprofloxacin)
Závěr a doplnění z kapitol 3.6 a 3.8:
Ve zmíněných kapitolách jsme se bavili o enzymové kinetice a o faktorech, které ovlivňují
rychlost enzymem katalyzované reakce. Zmínili jsme následující:
 koncentraci substrátu [S]
 koncentraci enzymu [E]
 přítomnosti aktivátorů a inhibitorů
Dalšími faktory, které rychlost reakce ovlivňují, jsou teplota (při vysokých teplotách enzymy
denaturují) a pH (rovněž při vysokém/nízkém pH enzymy denaturují, pracují pouze při tzv. pH
optimum).
3.9 Regulace enzymové aktivity
Obecně je možné enzymovou aktivitu regulovat třemi způsoby:
a) regulace množství molekul enzymu
b) regulace biologické aktivity enzymu
c) dostupnost a koncentrace substrátu a/nebo kofaktoru9
Regulace množství enzymu
Množství enzymu, které se v daném okamžiku nachází v organismu, je výslednicí dvou dějů:
syntézy a odbourávání.
Proteosyntézu je možné ovlivnit na každém jejím kroku:
 na úrovni exprese genů
o konstitutivní exprese (enzym je syntetizován neustále v určitém množství)
o indukovaná exprese (enzym je syntetizován pouze na podnět)
 na úrovni transkripce
o lze ovlivnit rychlost transkripce
o lze ovlivnit posttranskripční úpravy RNA (např. sestřih RNA)
 na úrovni translace
o lze ovlivnit rychlost translace
o lze ovlivnit posttranslační úpravy proteinu (např. metylace, glykace…)
Degradaci enzymu je rovněž možné ovlivnit – např. v buňce se nachází celá řada specifických
proteinas, které rozkládají jen konkrétní enzym, nebo typ enzymu (a opět je možné řídit i
syntézu těchto proteinas…).
Regulace biologické aktivity enzymu
Regulace biologické aktivity je zajištěna:
 Existencí izoenzymů10
9
Poslední zmíněný způsob nemá in vivo větší význam
10
Existuje i pojem izoforma, který je obecnější, než pojem izoenzym. Izoforma v obě zahrnuje i tzv.
pseudoizoenzymy, či různé posttranslační varianty daného enzymu.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 31
Izoenzymy jsou takové enzymy, které katalyzují stejnou reakci, ale liší se primární strukturou
a tedy i fyzikálně-chemickými a kinetickými vlastnostmi. Mají (velmi často) rozdílnou
tkáňovou distribuci, přičemž v každé tkáni může být daný izoenzym regulován jiným
způsobem.
V laboratořích je stanovujeme pomocí elektroforézy.
Např. Kreatinkinasa je dimer, který vytváří 3 izoenzymy složené z podjednotek M – muscle a
B – brain:
Tabulka 6 - Izoformy kreatinkinasy (CK)
Izoenzym Výskyt Procento celkové aktivity Zvýšení
CK-MM svaly 94-96% svalové trauma
CK-MB srdce do 6% infarkt
CK-BB mozek stopy poranění mozku
 Aktivací enzymů částečnou a nevratnou proteolýzou
Enzym je nasyntetizován ve své neaktivní formě (=proenzym) a až po té, co je z něj
odštěpena část molekuly se stává aktivním. Tento způsob aktivace enzymu je typický pro
enzymy GIT (např. pepsinogen → pepsin), pro faktory krevního srážení a pro proteinasy
(kaspasy), které se účastní apoptózy.
 Aktivací/deaktivací enzymu kovalentní modifikací
V předchozím případě byl enzym upraven tak, že jsme z něj něco odstranili, v tomto případě
na něj něco přidáváme. Nejběžnější kovalentní modifikací enzymů je fosforylace, tedy
přenos fosforylové skupiny z ATP na –OH skupinu serinu, treoninu, či tyrosinu katalyzovaný
kinasami. Jedná se o vratný děj, opačnou reakci (defosforylaci) katalyzují enzymy fosfatasy
(hydrolyzují vazbu mezi enzymem a fosforylovou skupinou).
Dalšími příklady kovalentní modifikace enzymů jsou např. karboxylace, acetylace, methylace
apod.
Enzymy, které podléhají fosforylaci a defosforylaci jsou např. glykogenfosforylasa a
glykogensynthetasa (viz Kapitola 5 – Metabolismus sacharidů)
 Allosterickým ovlivňováním
Allosterické enzymy jsou zvláštní skupinou enzymů, které se vždy skládají z více
podjednotek. Kromě aktivního místa můžeme na jejich molekule najít i tzv. allosterické
místo, do kterého se váže allosterický modifikátor11
(inhibitor nebo aktivátor). Svým
navázáním změní konformaci enzymu a tím sníží/zvýší jeho aktivitu.
Saturační křivka alosterických enzymů je podobná té, kterou jsme viděli u hemoglobinu
(hemoglobin se rovněž skládá z více podjednotek), má tedy sigmoidní tvar:
11
Allosterickým modifikátorem je často produkt reakce; v takovém případě mluvíme o inhibici/aktivaci
produktem.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 32
Stejně jako u hemoglobinu hovoříme i zde o kooperativním efektu – allosterické enzymy
mají více podjednotek, tedy více vazebných míst pro substrát nebo allosterické modifikátory.
Navázání substrátu/aktivátoru/inhibitoru na jednu podjednotku indukuje změny konformace
u ostatních podjednotek a další molekuly (substrátu/aktivátoru/inhibitoru) se vážou snadněji
nebo obtížněji.
3.10 Využití enzymů v lékařství
Enzymy mají v lékařství trojí využití:
a) jako indikátory patologického stavu
b) jako analytická činidla v klinické biochemii
c) jako léčiva
Příklady enzymů v klinické diagnostice
Při poškození buněk (z různých patologických důvodů), dochází k tomu, že se zvyšuje aktivita
intracelulárních enzymů v extracelulární tekutině. Zvýšenou aktivitu je možné zjistit z rozboru
krevního séra.
Tabulka 7 - Enzymy jako indikátory patologických procesů
Enzym Referenční hodnoty Interpretace zvýšení
ALT
(alaninaminotransferasa)
do 0,9 µkat/l hepatopatie
CK
(kreatinkinasa)
do 4 µkat/l myopatie, infarkt myokardu
PSA
(prostatický specifický antigen)
do 4 µg/l karcinom prostaty
NSE
(neuron specifická enolasa)
do 13 µg/l bronchogenní karcinom
Poznámka: povšiměme si, že první dva enzymy (ALT, CK) se stanovují pomocí nepřímých metod (např. metodou
konstantního času), další dva (PSA, NSE) jsou tumorové markery, které se stanovují přímou metodou (např.
imunobiochemicky).
Enzymy jako analytická činidla
Enzymy sloužící jako analytická činidla většinou pracují tak, že jistou látku (kterou chceme
stanovit) přeměňují na jinou látku, přičemž koncentraci této „jiné látky“ je možné nějak měřit
(vznikne-li např. látka barevná, je možné měřit absorbanci apod.)
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 33
Tabulka 8 - Enzymy jako analytická činidla
Enzym Původ enzymu Stanovovaná látka/ Metoda
Glukosaoxidasa Aspergillus niger glukosa
Peroxidasa křen (Armoracia sp.) glukosa
Lipasa Candida sp. triacylglyceroly
Cholesteroloxidasa Pseudomonas sp. cholesterol
Urikasa Candida sp. kyselina močová
Bilirubinoxidasa Myrothecium sp. bilirubin
Ureasa bob (Canavalia sp.) močovina
Laktátdehydrogenasa Pediocus sp. ALT, AST
Taq polymerasa Thermus aquaticus PCR metoda
Podrobněji se zaměříme na enzymové stanovení glukosy:
A) Stanovení v analyzátorech
Využíváme při něm dva enzymy – glukosaoxidasu a peroxidasu.
Glukosaoxidasa katalyzuje dehydrogenaci glukosy: glukosa + O2 → glukonolakton + H2O2
Peroxidasa katalyzuje rozklad peroxidu vodíku: H2O2 + H2A → 2 H2O + A
Látka H2A je bezbarvá, ale reakcí s peroxidem vodíku z ní vzniká látka A, která je barevná a je
možné měřit její absorbanci.
B) Osobní glukometry
Další možností je využití osobního glukometru, které slouží k osobní potřebě diabetiků.
Glukosaoxidasa je zakotvena na pevné fázi přístroje, vznikající H2O2 se stanovuje pomocí
platinové elektrody. Na displeji se následně ukazuje koncentrace glukosy v mmol/l.
Enzymy jako léčiva
Enzymy sloužící jako léčiva mají velmi široké spektrum užití. O některých dalších příkladech se
občas objeví zmínka i v jiných kapitolách než této.
Pankreatické enzymy
Jedná se o směs enzymů (lipasy, amylasy, proteinasy), která se získává z vepřových pankreatů.
Užívají se v případě sekreční nedostatečnosti pankreatu (která může mít různý původ) a při
cystické fibróze, 3x denně při jídle.
Jsou volně prodejné ve formě acidorezistentních tobolek (tobolka se rozpadne až v duodenu).
Asparaginasa
Asparaginasa je enzym, který se využívá v terapii leukémie (konkrétně lymfoblastické leukémie).
Enzym katalyzuje hydrolýzu amidové skupiny asparaginu: asparagin + H2O → aspartát + NH3
L-asparagin je nezbytný pro proteosyntézu některých nádorových buněk – tím, že jej
hydrolyzujeme, omezíme tak jejich proliferaci.
Enzymová fibrinolytika
Jedná se o léčiva, která rozpouštějí krevní sraženiny v cévách, např. enzymy streptokinasa
(bakteriální původ) a urokinasa (lidský enzym). Štěpí plazminogen na plazmin, který následně
vyvolá degradaci fibrinu a trombolýzu.
Využívají se při léčbě žilních trombóz, plicních embolií a akutním infarktu myokardu.
© JN 2009 Kapitola 3 – Enzymy 34
Proteasy
Slouží v lokální terapii a systémové terapii.
V lokální terapii se jedná např. o enzymy fibrinolyzin, chymotrypsin a kolagenasu. Po lokální
aplikaci způsobí lýzu (rozklad) nekrotické tkáně a nepoškozují zdravé buňky (zdravé buňky totiž
obsahují inhibitory těchto proteas).
Využívají se v chirurgii pro léčbu hnisavých ran, bércových vředů, diabetických gangrén,
dekubitů, pooperačních ran apod.
V systémové terapii se využívají např. enzymy trypsin a chymotrypsin, dále pak rostlinné
proteázy papain (papaya), či bromelin (ananas). Některé studie naznačují jejich protizánětlivý
účinek a ovlivnění imunity u autoimunitních onemocnění.
Využívají se jako pomocná léčiva při revmatoidní artritidě, u léčby traumatických zánětů a otoků,
lymfedémů, zánětů žil apod.
Jedná se i o některé volně prodejné přípravky (Wobenzym, Phlogenzym), které jsou dosti drahé a
některé je potřeba konzumovat v množství až 30 tablet denně.