Izolace a purifikace nukleových kyselin Metody molekulární biologie 19.9.2019 Nukleové kyseliny • DNA - jaderná, mitochondriální, chloroplastová, plasmidová • vodíkové vazby v DNA jsou stabilní v rozmezí pH 4-9 • RNA – rRNA (80 %), tRNA (10-20 %), mRNA (5 %), miRNA,... 2 Zdroje NK pro izolaci • buňky – bakterie (genomová nebo plasmidová DNA), kvasinky • virové částice • produkty PCR, DNA v gelu po elektroforéze • buněčné kultury – izolace genomové DNA, mRNA • tkáně a orgány eukaryot • klinické laboratoře - leukocyty, amniocyty, buňky z bukální sliznice, buňky z cerebrospinálního moku, vlasové kořínky, bioptický materiál • forenzní genetika – tělní tekutiny, vlasy, části tkání nebo orgánů 3 Izolace nukleových kyselin • je potřeba oddělit NK od ostatních buněčných komponent, které by mohly bránit jejich dalšímu využití a analýze • porušení buněčných stěn – lýza buněk, homogenizace vzorků • použití enzymů – proteináza K, RNáza, DNáza • centrifugace • adsorpce NK na silikát (SiO2) • fenol-chloroformová extrakce • precipitace (srážení) NK 4 Izolace NK – lýza buněk degradace buněčných stěn : enzymatická (lysozym), chemická (detergenty – SDS, Triton X-100) nebo fyzikální (mechanické tření, opakované mražení a rozmrazování, ultrazvuk) http://www.mdpi.com/2072-666X/8/3/83 5 Homogenizace vzorků 6 Metody izolace NK 1) Využití vazby NK na silikátovou kolonu (SiO2) 2) Extrakce a precipitace NK 7 Metody izolace DNA 1) Vazba DNA na silikátovou kolonu (SiO2) v přítomnosti chaotropních solí (zvyšujících iontovou sílu, např. NaI) 8 Izolace DNA na koloně komerčně dostupné kity pro různé druhy a objemy vzorků: rostlinné vzorky, plná krev, plasmidová DNA, celková RNA, mRNA, miRNA, izolace DNA z gelu, přečistění PCR produktů 9 resuspendační pufr lyzační pufr – SDS, NaOH neutralizační pufr – CH3COOK promývací pufr – ethanol eluční pufr – nízká iontová síla 10 Fenol-chloroformová extrakce • fenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1) pH 8,0 • EDTA – chelatační činidlo • fenol – rozpouštědlo, chloroform – denaturuje proteiny • třepáním a centrifugací vznikne fázové rozhraní • spodní část (organická fáze, lipidy) • rozhraní (vysrážené proteiny) • horní část (vodná fáze, polární látky, NK) 11 Precipitace (srážení) DNA přečištění DNA např. po fenol-chloroformové extrakci 1. přidat 3M octan sodný (pH 5,2) do 1/10 celkového objemu 2. přidat 100% ethanol (vychlazený) – 2,5× objem – zmrazit – precipitace DNA 3. centrifugace 4. odebrat supernatant, přidat 80% ethanol 12 Precipitace (srážení) DNA 5. centrifugace 6. odebrat supernatant, přidat 80% ethanol 7. centrifugace 8. odebrat supernatant, vysušit, rozpustit ve vodě nebo TE pufru (pro lepší výtěžek lze přidat nosič – tRNA, glykogen) 13 Analýza plasmidové DNA DNA photo-cleaving agents in the far-red to near-infrared range – a review. RCS Advances DOI: 10.1039/C5RA28102D 14 Analýza plasmidové DNA Petr et al., Bioscience Reports (2016) 36, e00397, doi:10.1042/BSR20160232 15 Izolace RNA guanidium thiokyanátfenol-chloroformová extrakce při pH 4,5 !ochrana proti působení RNáz! 16 Izolace RNA guanidium thiokyanát-fenol-chloroformová extrakce 17 18 Izolace RNA Izolace mRNA 19 • mRNA obsahuje poly(A) sekvenci na 3' konci • magnetické částice s vázaným oligo d(T)25 20 Izolace RNA a proteinů Integrita RNA Bhaskaran, Shylesh et al.(2011). Breaking Caenorhabditis elegans The Easy Way Using The Balch Homogenizer – An Old Tool For a New Application. Analytical biochemistry. 413. 123-32. doi: 10.1016/j.ab.2011.02.029. RNA integrity following Balch homogenization. Two methods were employed to extract RNA from C. elegans following sample disruption with the Balch homogenizer. (A) Guanidinium isothiocyanate method employing a NucleoSpin RNA Isolation Kit. (B) Trizol (phenol-based) method. In both instances, worm samples were homogenized before molecular disruptants were added. No obvious compromise in RNA integrity was observed in either method. Listed in each panel are DNA marker sizes (bp) and RNA species (28S, 18S, and 5S ribosomal RNA and transfer RNA [tRNA]). 21