Metody přenosu DNA do buněk Mgr. Zuzana Bábková Ústav molekulární biologie a farmaceutické biotechnologie 1 Proč je výhodné přenášet DNA do buněk? • vhodné pro studium • funkce genů a mechanismů řídících genovou expresi • biotechnologie • produkce proteinů ve velkém rozsahu • genové terapie • a další … 2 Zdroj: http://desispeaks.com/gene-therapy/ Transfekce nebo transformace? • přenos izolované DNA do buněk • transformace: přenos DNA do prokaryotických buněk • transfekce: přenos DNA do eukaryotických buněk • transfekuje/transformuje se buňka, nikoliv DNA! 3 Klasifikace transfekčních postupů Podle stability transgenu • transfekce přechodná • transfekce stabilní Podle způsobu penetrace membrány • postupy biochemické • postupy fyzikální • postupy biologické 4Kim, T. et al. 2010 Transfekce dle stability transgenu • přenášená DNA se dostává do buňky, ale zůstává v extrachromozomálním stavu, transgen se přepisuje po omezenou dobu • jedna transfekovaná buňka může obsahovat větší počet kopií transfekční DNA (vyšší exprese transgenu) • vhodná pro studium přenášených genů a produkci proteinů v malém rozsahu • experimentování je časově omezeno z důvodu postupného vyředění exogenu • přenos izolované DNA do buněk 5 1. Transfekce přechodná Transfekce dle stability transgenu • přenášená DNA se začleňuje do chromozomu hostitelské buňky (tento děj nastává s nízkou frekvencí 10-5 – 10-6) • nízká pravděpodobnost výskytu dvou nebo více kopií transgenu v jedné buňce • zajistí dlouhodobou a reprodukovatelnou expresi exogenu • vhodná pro studium funkce genů a mechanismy jejich regulace, produkci proteinů ve velké rozsahu, genovou terapii 6 1. Transfekce stabilní • vyředění exogenu nehrozí, v genomu se udržuje jako stabilní znak • přenášený gen musí překonat plazmatickou i jadernou membránu • místo integrace může rozhodovat o účinnosti exprese (integrace do heterochromatinu vede k nízké nebo žádné expresi) • lze řešit dodáním specifických sekvencí do vektoru, které umožní místně specifickou integraci 7 Transfekce dle stability transgenu 1. Transfekce stabilní Biochemické transfekční postupy • DNA se smíchá s chloridem vápenatým ve fosfátovém pufru • vytvoří se jemná sraženina DNA a fosforečnanu vápenatého • precipitát je pohlcován buňkami endocytózou • účinnost transfekce je relativně vysoká: až 50% buněk může cizorodou DNA přijmout • „hrubostí“ sraženiny lze regulovat poměr cytotoxicity a účinnosti transfekce • Použití: • přechodná i stabilní transfekce fibroblastů a jiných adherujících i neadherujících buněk 8 1. Transfekce zprostředkovaná fosforečnanem vápenatým: Transfekce srážením a endocytózou 9Zdroj: Šmarda J., 2015 Plasmidová DNA Gen zájmu Biochemické transfekční postupy • Dietylaminoetyl(DEAE)-dextran: • vysokomolekulární kladně nabitý polymer • slouží jako most mezi negativně nabitou DNA a povrchem buňky • Princip: • negativně nabitá DNA se váže ke kationtům DEAE- dextranu • komplex se přidá k buňkám, do kterých proniká endocytózou • Použití: • adherující i neadherující buňky (značná variabilita účinnosti u různých typů buněk) • nevhodné pro stabilní transfekci (toxicita) • jednoduchost, rychlost, spolehlivost • omezuje růst, způsobuje morfologické změny, vyžaduje dočasné snížení koncentrace séra 10 2. Transfekce zprostředkovaná DEAE-dextranem Biochemické transfekční postupy • Princip: • transfekčním činidlem je lipofilní molekula, která obklopí přenášenou DNA • transfekční činidlo má pozitivně nabité skupiny – usnadnění vazby k negativně nabité DNA • lipidy s navázanou DNA fúzují s buněčnou membránou a zajistí tak přenos DNA do buňky • Použití: • rozmanité buněčné typy, často velmi dobrá účinnost 11 3. Transfekce lipofekcí Fyzikální transfekční postupy • Princip: • nastřelování buněk kovovými projektily pokrytými DNA • Použití: • pro transfekci rostlinných buněk • je třeba optimalizovat řadu parametrů: • počet buněk vystavených transfekci (buněčnou hustotu, rychlost proliferace buněk) • typ média • stupeň vakua ve střelné komoře • míru tlaku hélia na mikroprojektily • vzdálenost mezi puškou a buňkami • velikost mikroprojektilů (obvykle částice zlata nebo wolframu o průměru 0,6- 1,6 μm) 12 1. Transfekce genovou pistolí („gene gun“) Mikroprojektilová pistole 13Dostupné z https://groisman.physics.ucsd.edu/Gene%20guns.html Fyzikální transfekční postupy • Princip: • DNA a buňky se smísí v empiricky definovaném pufru • směs se vystaví krátkému elektrickému pulzu o vysokém napětí • následkem elektrického šoku dojde k přechodnému otevření pórů v plazmatické membráně • póry proniká do buňky DNA • Použití: • metoda je rychlá a použitelná pro mnoho typů adherujících i neadherujících buněk 14 2. Transfekce elektroporací Fyzikální transfekční postupy • Princip: • Mechanický přenos DNA do buněk jemnou jehlou mikromanipulátoru pod kontrolou mikroskopu (2 – 5 pikolitrů) • Použití: • Vhodnými objekty jsou velké buňky jako oocyty 15 3. Transfekce mikroinjekcí Dostupné z http://www.well.ox.ac.uk/ben-davies Biologické transfekční postupy • transdukce • nejdříve musí dojít k úpravě virů (odstranění patogenních genů, ale zachování genů udržujících správný životní cyklus viru) • živé vektory • mají vysokou účinnost přenosu do buněk • jsou vhodné pro genové manipulace s živočišnými buňkami bez plasmidu • každý druh viru je limitován svojí klonovací kapacitou (maximální možné množství bazí, které lze vložit do genomu viru) • především v genové terapii • adenoviry s dsDNA, adeno-asociované viry se ssDNA, retroviry s ssRNA, lentivirus (retrovir, ale začlení se i do nedělících se buněk) a herpesviry s dsDNA 16 1. Virové vektory Biologické transfekční postupy • rekombinantní DNA lze sbalit do kapsidů a přenést do hostitelských buněk infekcí (vyšší účinnost) • vhodné pro klonování větších fragmentů DNA (tvorba genových knihoven) • vektory pro eukaryotní buňky • kvasinky • nejvýznamnějším je bakteriofág λ • má dsDNA • klonovací kapacita je až 23 kbp (asi dvakrát více než u plasmidových vektorů) 17 2. Fágové vektory Selekční systémy eukaryotických buněk • podmínka izolace vzácných stabilních transfektantů • původně založeny na obnovení porušených metabolických drah v buňce (70. léta 20. století) • například: mutantní buňky s inaktivní tymidinkinázou (znemožněna syntéza tymidinu) byly transfekovány genem HSVTK (herpes virus simplex TK) • nevýhoda: nutnost inaktivace TK v cílových buňkách 18 Selekční systémy eukaryotických buněk • 80. léta 20. století • objev dominantních selekčních markerů • bakteriálních enzymů využitelných u eukaryot • není třeba používat mutantní buněčné linie • guanin-fosforibozyltransferáza (gpt) • aminoglykozid-fosfotransferáza (neo) • hygromycin β-fosfotransferáza • puromycin-N-acetyltransferáza 19 Hypoxantin/guanin-fosforibozyl transferáza • katalyzuje syntézu GMP/IMP • za přítomnosti aminopterinu a kyseliny mykofenolové, kdy je blokována syntéza GMP de novo, je přežití buňky závislé na integraci a expresi gtp • aminopterin inhibuje dihydrofolát reduktázu • kyselina mykofenolová specificky inhibuje inosinát dehydrogenázu • tento blok lze uvolnit xantinem, pokud mají buňky k dispozici funkční produkt genu gtp E. coli 20 (HGPRT) Aminopterin • inhibitor dihydrofolát reduktázy • enzym nezbytný pro syntézu nukleotidových prekurzorů DNA a RNA • aminopterin je syntetický analog kyseliny foliové, obsazuje vazebné místo dihydrofolát reduktázy a vytěsňuje tak přirozený substrát reakce (folát) • výsledkem působení aminopterinu je inhibice replikace DNA, transkripce a translace • první chemoterapeutikum pro léčbu dětské leukémie (Sidney Farber, 1947) 21 Aminoglykozid-fosfotransferáza • poskytuje hostitelským buňkám rezistenci na antibiotikum G418 – geneticin (strukturně příbuzné gentamicinu) • produktem je Micromonospora rhodorangea • pokud se do růstového média přidá G418 (geneticin) závisí přežití buněk na stabilní integraci a expresi genu neo • G418 narušuje funkci ribozomů a tak blokuje proteosyntézu v prokaryotických i eukaryotických buňkách • bakteriální aminoglykosid-fosfotransferáza pozměňuje G418 do netoxické formy 22 Další selekční markery • PAC (N-acetyl transferáza) • zdroj: Streptomyces alboniger • princip: poskytuje rezistenci na puromycin • HPH (hygromycin β aminoglykozid fosfotransferáza) • zdroj: E. coli • princip: poskytuje rezistenci na hygromycin β • DHFR (dihydrofolát reduktáza) • mutantní varianta, která neváže metotrexát • zdroj: myš • princip: poskytuje rezistenci na metotraxát 23 Účinnost transfekce lze sledovat reportérskými geny • Reportérský systém • uměle vytvořený konstrukt DNA, který obsahuje promotor a potenciální regulační signály jednoho genu připojené k jinému genu, který kóduje snadno detekovatelný produkt (například: GFP) • transfekce buněk reportérským konstruktem a analýza jeho exprese umožňuje kvantifikaci účinnosti transfekce 24 Děkuji za pozornost 25