evropský
sociálni      i---------1
fOndvCR     EVROPSKÁ UNIE      MLÁDEŽE A TĚLOVÝCHOVY      pro konkurenceschopnost
INVESTICE DO ROZVOJE VZDĚLÁVÁNÍ
Izolace genomové DNA z krve
Jestliže v jednom mililitru lidské krve je obsaženo přibližně 4 až 10 milionů leukocytu, kolik pg DNA je možno maximálně izolovat z 200 pl plné krve? Přitom jeden leukocyt obsahuje DNA o celkové délce 2,9 miliardy nukleotidů, a že průměrná molekulová hmotnost jednoho nukleotidu je 325.
Řešení
1) Spočítáme, kolik leukocytu je obsažené ve 200 /jI krve
v 1 ml krve ve 200 ul krve
je obsaženo je obsaženo
4 az 10 x 106 leukocytu X
X = 4 až 10 x 106 /5 = 0,8 až 2 x 106 leukocytu
Ve 200 ul krve je obsaženo 0,8 až 2 x 10 leukocytu
2) Spočítáme hmotnost DNA v jednom leukocytu
6,023 x 1023 nukleotidů 2,9 x 109 nukleotidů
má hmotnost má hmotnost
325 g Y
Y = 2,9 x 109 x 325/6,023 x 1023 = 1,6 x 10"12 g = 1,6 fg V jednom leukocytu je obsaženo přibližně 1,6 fg DNA
3) Spočítáme hmotnost DNA v celkovém množství leukocytu v 1 leukocytu .....
v 0,8 až 2 x 10b leukocytech
je obsaženo je obsaženo
1,6 x 10"12 g DNA Z
Z = 0,8 až 2 x 106 x 1,6 x 10"12 = 1,28 x 10"6 až 3,2 x 10"6 g = 1,28 až 3,2 ug
Odpověď:
Z 200 pl plné krve lze maximálně izolovat přibližně 1,28 až 3,2 pg DNA
Izolace genomové DNA z rostlinných buněk
Doplňte následující tabulku týkající se genomové DNA různých organismů
Organismus	Velikost DNA	Molární	Hmotnost 1	Počet molekul
	(bp)	hmotnost	molekuly	vlg
Člověk	3,0 x 10y			
Drosophila	1,2 x 10s			
Saccharomyces	1,6 x 10'			
cerevisiae				
Escherichia coli	4,0 x 10b			
Bakteriofág X	48 514			
Zea mays	3,9 x 10y			
Poznámka
Molekulová hmotnost jednoho páru bazí M (lbp) = 650. Řešení: (vzorový výpočet pro člověka)
1 )Stanovíme molární hmotnost, tedy hmotnost jednoho molu molekul
= 650 x 3,0 x 109= 1,95 x 1012
2) Spočítáme hmotnost jedné molekuly DNA
6,023 x 1023 molekul 1 molekula
má hmotnost má hmotnost
1,95 x 1012 g Xg
X = 1,95 x 1012/6,023 x 1023 = 3,24 x 10"12 g
3) Stanovíme počet molekul vlg
6,023 x 1023 molekul Y molekul
má hmotnost má hmotnost
1,95 x 1012 g
X = 6,023 x 1023/1,95 x 1012= 3,09 x 1011 g
Odpověď:
Organismus	Velikost DNA (bp)	Molární hmotnost	Hmotnost 1 molekuly	Počet molekul vlg
Člověk	3,0 x 10y	1,95 x 1012	3,24 x 10"12g	3,09 x 1011
Drosophila	1,2 x 10s	7,80 x 1010	1,30 x 10"13g	7,72 x 1012
Saccharomyces cerevisiae	1,6 x 10'	1,04 x 1010	1,73 x 10"14g	5,79 x 1013
Escherichia coli	4,0 x 10b	2,60 x 10y	4,32 x 10"lsg	2,32 x 1014
Bakteriofág X	48 514	3,15 x 107	5,23 x 10"17g	1,91 x 1016
Zea mays	3,9 x 10y	2,54 x 1012	4,22 x 10"12g	2,37 x 1011
2
Izolace plasmidové DNA
1) Jak se můžete přesvědčit o tom, která z forem plasmidu pozorovaná na vašem izolátu po elektroforéze je L-forma?
Odpověď:
Rozštěpením plasmidové DNA reštrikční endonukleázou, která štěpí plasmid jen lx. Všechny formy se přemění formu lineární.
2) Na uvedeném elektroforetickém snímku vyznačte různé formy plasmidu.
3) Co lze říci o průběhu izolace plasmidové DNA, jestliže je na elektroforetickém gelu vidět pruh denaturované DNA ?
Odpověď:
Že lyže buněk probíhala příliš dlouho nebo za vysokého pH (vyššího než 12,45)
3
Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky
1) Určete koncentraci roztoku DNA u něhož byla hodnota absorbance při 260 nm po 10 násobném zředění rovna 0,15?
Řešení:
Jestliže je absorbance A260 = 1,0, pak má roztok DNA koncentraci 50 ug/ml M(lbp) = 650
1) Určíme koncentraci plasmidové DNA v roztoku
jestliže je A260 = 1,0 ..... pak koncentrace je ..... 50 ug/ml
jestliže je A260 = 10 x 0,15 ..... pak koncentrace je ..... X ug/ml
X= 10x0,15 x50 = 75 ug/ml
2) Kolikrát musíte naředit roztok DNA o koncentraci 100 ug/ml, aby byla jeho absorbance při 260 nm rovna hodnotě 0,2?
Řešení:
Jestliže je absorbance A260 = 1,0, pak má roztok DNA koncentraci 50 ug/ml
koncentrace 50 ug/ml ..... pak absorbance A260 ..... 1,0
koncentrace 100 ug/ml ..... pak absorbance A260 ..... 2,0
2,0/0,2 = 10
Odpověď:
Roztok DNA musíme naředit lOx Poznámka:
Protože závislost absorbance na koncentraci DNA není lineární, je toto číslo jen odhadem
4
Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky
3) Koncentraci RNA lze podobně jako koncentraci DNA stanovit spektrofotometricky. Platí převodní vztah, že ssRNA má koncentraci 40ug/ml, jestliže OD26o v lem kyvetě je rovna 1,0. Přepočtěte tento údaj na molaritu.
Řešení:
M (1 nukleotidu v RNA) = 360
1) Stanovíme počet nukleotidů v 1 ml takového roztoku
6,023 x 1023 nukleotidů v
_XT. ..... má hmotnost ..... 360 g
RNA &
X nukleotidů ..... má hmotnost ..... 40 x 10"9 g
X = 6,023 x 1023 x 40 x 10"9/360 = 6,7 x 1013 nukleotidů
2) Stanovíme molaritu
1 litr 1M roztoku ..... obsahuje ..... 6,023 x 1023 nukleotidů
1 ml 1M roztoku ..... obsahuje ..... 6,023 x 1020 nukleotidů
1 ml Y M roztoku ..... obsahuje ..... 6,7 x 1013 nukleotidů
Y = 6,7 x 1013/6,023 x 1020= 1,11 x 10~7 M = 0,11 x 10~6 M = 0,11 mM
Odpověď: Roztok je 0,11 mM
5
Stanovení koncentrace a čistoty DNA spektrofotometricky
3)   Kolik ředícího roztoku přidáte do 30 ul vzorku DNA o koncentraci 60 ug/ml tak, aby koncentrace DNA po zředění klesla na 15 ng/ul?
Řešení:
60 u g/ml = 60 ng/ul Použijeme směšovacího pravidla
60
w
15
15		1		30
				
				
■		■		■
				
45		3		90
				
DNA
ředící roztok
Odpověď:
Do vzorku DNA přidáme 90 ul ředícího roztoku
6
Reštrikční štěpení plasmidové DNA
1) Jaké množství plasmidu (v ul) přidáte do reakční směsi, potřebujete-li štěpit 500 ng plasmidu a je-li jeho zásobní koncentrace 100 ng/ul ?
Řešení:
1 ul zásobní koncentrace ..... obsahuje ..... 100 ng plasmidu
X ul zásobní koncentrace ..... obsahuje ..... 500 ng plasmidu
X = 500/100 = 5 ul
Odpověď:
Do reakční směsi přidáme 5 ul plasmidu
2) Jedna jednotka reštrikční endonukleázy (značí se u) je množství enzymu, které rozštěpí lug DNA fága X za optimálních reakční ch podmínek při 37°C za 1 hodinu. Na molekule DNA fága X je celkem 6 štěpných míst pro restriktázu Hinfl. Jaké množství plasmidu pUC18 rozštěpí 1 jednotka restriktázy Hinfl za jednu hodinu, jestliže je na tomto plasmidu jen jedno reštrikční místo ? Velikost plasmidu pUC18 je 2 686 bp.
Řešení:
Velikost DNA fága X = 48 502 bp
1) Spočítáme počet molekul fágaX, které enzym Hinf I rozštěpí
6,023 x 1023 molekul ..... má hmotnost ..... 650 x 48 502 g
X molekul ..... má hmotnost ..... 1 x 10"6 g
X = 6,023 x 1023 x 1 x 10"6/ 650 x 48 502 = 1,91 x 1010 molekul
2) Molekul plasmidu, které enzym Hinf I rozštěpí je 6x více
6 x 1,91 x 1010= 11,46 x 1010 molekul
3) Spočítáme hmotnost 11,28 x 1010 molekul plasmidu pUC18
6,023 x 1023 molekul ..... má hmotnost ..... 650 x 2 686 g
11,46 x 1010 molekul má hmotnost ..... Y
Y= 11,46 x 1010x 650x2 686/6,023 x 1023 = 3,32 x 10"7g = 0,332 x 10"6g = 332 ng
Odpověď:
Jedna jednotka Hinfl rozštěpí za daných podmínek 332 ng plasmidu
Reštrikční štěpení plasmidové DNA
3) Jak dlouho bude štěpit lu reštrikční endonukleázy Hind III 200 ng plasmidu pUC18 ? Na tomto plasmidu je jediné reštrikční místo pro restriktázu Hind III.
Řešení:
Vyjdeme z výsledků předchozího příkladu
Podmínky štěpení Hind III jsou stejné jako v případě Hinfl
1 u Hind III rozštěpí ..... 332 ng plasmidu ..... za 60 minut
1 u Hind III rozštěpí ..... 200 ng plasmidu ..... za X minut
X = 200 x 60/332 = 36
Odpověď:
Restriktáza Hind III bude štěpit plasmid 36 minut
8
Ostatní enzymy
1) Jedna jednotka zpětné transkriptázy z Moloney Murine Leukémia Viru (M-MuLV) inkorporuje lnmol dTTP do struktury DNA na RNA matrici za 10 minut při 37°C. Za předpokladu, že podobnou rychlostí inkorporuje ostatní deoxyribonukleotidy stanovte rychlost v nukleotidech za sekundu.
Řešení:
1) Stanovíme množství inkorporováných nukleotidů
lmol ..... je ..... 6,023 x 1023 nukleotidů
1 nmol ..... je ..... X nukleotidů
X ribonukleotidů ..... má M ..... 108 000
X = 6,023 x 1023 x 1 x 10"9 = 6,023 x 1014 nukleotidů
2) Vypočteme rychlost inkorporace
za 10 minut ..... je začleněno ..... 6,023 x 1014nukleotidů
za 1 sekundu ..... je začleněno ..... Y nukleotidů
Y = 6,023 x 1014/ 10 x 60 = 1 x 1012 nukleotidů/s
Odpověď:
Rychlost začleňování je 1 x 1012 deoxyribonukleotidů/sekundu
2) Uvažujte rychlost syntézy DNA zpětnou transkriptázou podle zadání v předchozí úloze č. 12/1. Kolik ul zpětné transkriptázy ze zásobního roztoku o koncentraci 20 000 u/ml použijete k přípravě molekul DNA o průměrné délce 500 nukleotidů tak, aby teoretický výtěžek při 10% účinnosti syntézy činil 500 ng DNA?
Řešení:
Rychlost začleňování je (podle zadání úlohy č. 12/1) 1 x 1012 deoxyribonukleotidů/sekundu jednou jednotkou zpětné transkriptázy
1) Spočítáme, kolik nukleotidů musí být nasyntetizováno jednou jednotkou při 10%% účinnosti
6,023 x 1023 nukleotidů má hmotnost ..... 325 g
X nukleotidů ..... má hmotnost ..... 500 x 10"9 g
X = 6,023 x 1023 x 500 x 10"9/325 g = 9,27 x 1014 nukleotidů
9
Ostatní enzymy
2) Při 10% účinnosti je to
9,27 x 1013 nukleotidů
3) Spočítáme kolik jednotek zpětné transkriptázy je zapotřebí
12
1 jednotka Y jednotek
syntetizuje syntetizuje
1 x 10 deoxyrib onukl eoti dů
9,27 x 1013 deoxyrib onukl eoti dů
Y = 9,27 x 1013/1012 = 92,7 jednotky
4) Spočítáme objem zpětné transkriptázy
1 000 ul Zul
obsahuje obsahuje
20 000 u 92,7 u
Z = 92,7 x 1 000/20 000 = 4,6 ul
Odpověď:
Použijeme asi 4,6 ul zpětné transkriptázy a syntéza bude ukončena za 1 sekundu
3) Kolika jednotkám T4 DNA ligázy od firmy New England Biolabs odpovídá 1 Weissova jednotka ?
Řešení:
Jedna jednotka T4 DNA ligázy od firmy New England Biolabs je množství enzymu, které spojí 50% Hind lil fragmentů DNA fága X (koncentrace 5'-konců 0,12 uM, 300 ug/ml) ve reakci o objemu 20 ul za 30 minut při 16°C. Takto definovaná jedna jednotka je ekvivalentní 0,015 Weissovým jednotkám.
1 jednotka NEB X jednotek NEB
je je
0,015 jednotek Weissových 1 jednotka Weissova
X = 1/0,015 = 67 jednotek NEB
Odpověď:
Jedna Weissova jednotka odpovídá 67 jednotkám T4 ligázy od firmy NEB
10
Polymerázová řetězová reakce
1) Limit detekce DNA na transluminátoru je přibližně 5ng. Kolik cyklů PCR musí proběhnou, aby bylo možno detekovat amplifikační produkt mutantní alely CCR5 A32 o délce 130 bp, jestliže na počátku reakce máte ve směsi pouze jedinou kopii genu pro CCR5 A32?
Řešení:
M(lbp) = 650
1) Spočítáme, kolik molekul amplikonu o délce 130 bp je obsaženo v 5ng
6,023 x 1023 molekul ..... má hmotnost ..... 650 x 130 g
X molekul ..... má hmotnost ..... 5 x 10"9 g
X = 6,023 x 1023 x 5 x 10"9/ 650 x 130 = 3,56 x 1010 molekul
2) Spočítáme, kolik molekul amplikonu vzniká v různých cyklech
Počet nově vzniklých molekul při amplifikaci lze vyjádřit vzorcem
A = (2n-2n)x
kde    n = počet cyklů PCR reakce
x = počet kopií původní matrice
Předpokládejme, že X = 1, tedy že na počátku byla v reakci jediná kopie alely
Cyklus č. (n)	Amplikony (2n-2n)x
20	10 485 438
30	1,07 x 109
31	2,15 x 109
32	4,29 x 109
33	8,59 x 109
34	1,72 x 101U
35	3,44 x 1010
36	6,87 x 101U
40	1.10 x 1012
Odpověď:
Musí proběhnout alespoň 36 cyklů PCR
11
Polymerázová řetězová reakce
2) Jak dlouhý amplikon může vzniknout na níže popsaném úseku DNA (je uveden pouze jeden z komplementárních řetězců) pokud má experimentátor k dispozici následující dvojici primerů?
Primer forward: Primer reverse:
5ATG TGA GCG GTC TAC TGG - 3' 5GAT AGC TAG AAT TGA TAG - 3'
Sekvence na které probíhá amplifikace:
5'- ATG TGA GCG GTC TAC TGG AAA TGC AGT GCA TCA GTC AGC GAT GGG TGA GTC ACC CCC GTC ACG TCA GAT TCA TGA CTA AGC GTC CGT GCT TGA TCG AGT CTA TCA ATT CTA GCT ATC ATC ATG GTT GAC ATC - 3'
Řešení:
1) Primer forvard má stejnou sekvenci i orientaci jako zadaná sekvence
2) Primer reverse je třeba obrátit a vytvořit jeho komplementární sekvenci, je tedy třeba na zadané sekvenci hledat následující posloupnost:
5'- CTA TCA ATT CTA GCT ATC - 3'
Pozice primerů jsou vyznačeny podtržením
5'- ATG TGA GCG GTC TAC TGG AAA TGC AGT GCA TCA GTC AGC GAT GGG TGA GTC ACC CCC GTC ACG TCA GAT TCA TGA CTA AGC GTC CGT GCT TGA TCG AGT CTA TCA ATT CTA GCT ATC ATC ATG GTT GAC ATC - 3'
Vzdálenost mezi ATG a ATC je 117 bp
Odpověď:
Na popsaném úseku DNA může vzniknout amplikon o délce 117 bp
12
Polymerázová řetězová reakce II
1) Taq polymeráza připojuje nukleotidy rychlostí 150 nukleotidů/sekundu. Jak dlouho trvá tomuto enzymu, než nasyntetizuje fragmenty o délce 190 a 490 bp?
Řešení:
150 nukleotidů ..... je připojeno za ..... ls
190 nukleotidů ..... je připojeno za ..... Xs
X= 190/150= 1,27 s X = 490/150 = 3,27 s
Odpověď:
Fragmenty jsou teoreticky nasyntetizovány za 1,27 sekundy a 3,27 sekundy
2) Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje lOnmol nukleotidů za 30 minut při teplotě 72°C. Přepočtěte tuto hodnotu na počet inkorporovaných nukleotidů za minutu.
Řešení:
10 x 10"9 mol ..... je připojeno za ..... 30 min.
X mol ..... je připojeno za ..... 1 minutu
X = 10 x 10"9/30 mol
1 mol ..... je ..... 6,023 x 1023 nukleotidů
10 x 10"9/30 mol ..... je ..... Y nukleotidů
Y = (10 x 10"9/30) x 6,023 x 1023/1 [mol x nukleotidů/mol] = 2 x 1014 nukleotidů = 200 x 1012 nukleotidů
Odpověď:
Jedna jednotka enzymu Taq polymerázy inkorporuje přibližně 200 x 1012 nukleotidů za minutu
13
Polymerázová řetězová reakce II
3) Jestliže frekvence začlenění chybného nukleotidu činí u Taq polymerázy 285 x 10~6, kolikrát může tento enzym chybovat při syntéze 200 ng amplikonu o délce 500 bp? Co můžete říct o počtu chybných amplikonu v takovém výsledném vzorku DNA?
Řešení:
M(lbp) = 650
1) Spočítáme počet nukleotidů v daném množství amplikonu
6,023 x 1023 nukleotidů má hmotnost ..... 650 g
X nukleotidů ..... má hmotnost ..... 200 x 10"9 g
X = 6,023 x 1023 x 200 x 10"9/ 650 = 1,85 x 1014 nukleotidů
2) Stanovíme podíl chybné začlenených nukleotidů
1,85 x 1014 x 285 x 10"6 = 5,27 x 1010 nukleotidů
3) Stanovíme podíl chybných amplikonu
5,27 x 1010 /500 = 1,05 x 108 amplikonu = 105 x 106 amplikonu
Odpověď:
Chybně bude začleněno 5,27 x 1010 nukleotidů 105 milionů amplikonu bude chybných
Poznámka:
Ve skutečnost bude počet chybných amplikonu vyšší, protože chyba v prvních cyklech se přenese i do dalších amplikonu.
4) Stanovte teplotu annealingu pro primery LEP2 a LEP530. Řešení:
Pro výpočet teploty annealingu použijeme jednoduchou aproximaci
Tm = 4 x (obsah G+C) + 2 x (obsah A + T)
V našem případě
LEP2 =5'- CTT CTT GGG AAG GAA AAT GC - 3' = (9 x 4) + (1 lx 2) = 58°C
14
Elektroforéza nukleových kyselín v agarózovém gelu
LEP530 = 5'- GTA GAC TTG CAG GAA GAG TG - V = (10 x 4) + (lOx 2) = 60°C Odpoveď:
Teplota annealingu primeru LEP2 je 58°C a primeru LEP530je 60°C
15
Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu
1) Závislost velikosti DNA na elektroforetické není lineární. V určitém zjednodušení může být vyjádřena logaritmickou funkcí. Stanovte délku amplifikačního produktu z obrázku výsledné elektroforézy.
START
Elektroforetická pohyblivost amplikonu = 36,5 mm
Standard A   B C    D E
Velikost standardů
A = 500bp
B = 400bp
C = 300bp
D = 200bp
E =lOObp
Elektroforetická pohyblivost
29,0 mm
32,5 mm
35,5 mm
38,0 mm
45,0 mm
Návod řešení:
Vyneste hodnoty přirozeného logaritmu velikosti standardů a elektroforetické pohyblivosti do grafu a z něho pak odečtěte velikost amplikonu.
\ = ln X
kde
N = elektroforetická pohyblivost v cm X = velikost DNA fragmentu v bp
16
Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu
Řešení:
1) Vytvoření grafu závislosti velikosti fragmentu na elektroforetické pohyblivosti
Závislost InX na vzdálenosti
6,5 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
6,3 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
6,1 | | | | l j>] I I I I I I I I I I I I I
5,9 | | | | | | | | | ||| | | | | | | | |
5,7 | | | | | | | | | | | | | | | | | |
c 5.5 | | | | | | | | | | | ||| | | | | | | | |
5,3 | | | | | | | | | | | Hl |J | | | | | |
5,1 | | | | | | | | | | | JI | |>J | | | |
4,9 | | | | | | | | | | | JI | | | l\ \ | |
4,7 | | | | | | | | | | | JI | | | | | ||J
4,5 |  I I I  I | I  I I I  | l[l I  I | I  I I I T
25 30 35 40 45
Vzdálenost v mm
2) Vynesení hodnoty 36,5 mm
3) Odečtená hodnota lnX= asi 5,55
Odpověď:
Délka amplifikačního produktu je 257 bp
■ Radal
50
17
69999999999998^
Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu
2) Jaká je výsledná koncentrace ethidiumbromidu ve Vámi připraveném agarózovém gelu? Řešení:
Přidáváme roztok ethidium bromidu (0,15 mg/ml) tak, že množství přidaného objemu roztoku ethidiumbromidu v mikrolitrech musí být stejné jako objem gelu v mililitrech.
Řešme pro případ, že je náš objem gelu roven 100 ml
Přidáme 100 ul roztoku ethidiumbromid do 100 ml gelu Roztok ethidiumbromid tedy ředíme 1 OOOx
Zásobní roztok: 0,15 mg/ml = 150 ug/ml Zředěný roztok: 150 ng/ml
Odpověď:
Výsledná koncentrace ethidiumbromid v námi připraveném gelu je 150 ng/ml
18
Elektroforéza nukleových kyselin v agarózovém gelu
3) Kolik ml zásobního roztoku ethidiumbromidu (10mg/ml) použijete pro přípravu 100 ml roztoku o koncentraci 0,15 mg/ml?
Řešení:
1) Spočítáme hmotnost ethidiumbromidu ve 100mi roztoku
v 1 ml roztoku ..... je ethidiumbromidu ..... 0,15 mg
ve 100 ml roztoku ..... je ethidiumbromidu ..... X mg
X = 0,15xl00=15 mg ethidiumbromidu
2) Stanovíme nezbytný objem zásobního roztoku
v 1 ml zásobního roztoku ..... je ethidiumbromidu ..... 10 mg
v Y ml zásobního roztoku ..... je ethidiumbromidu ..... 15 mg
Y = 15/10= 1,5 ml
Odpověď:
Použijeme 1,5 ml zásobního roztoku
19
Centrifugace
1) Při jakých otáčkách budete centrifugovat bakteriální buňky, jestliže máte rotor o poloměru 10 cm a buňky sedimentuj i při 1 OOOg ?
Řešení:
RCF = 1,119 x 10"5 x rpm2 x r
Z toho plyne, že rpm = (RCF/1,119 x 10"5 x r)1/2
rpm = (l 000/1,119 x 10"5 x 10)1/2 rpm = 2 989
2) Jakému přetížení budou vystaveny částice, které centrifugujete v rotoru o poloměru 15 cm, jestliže se rotor otáčí rychlostí 50 000 otáček za minutu?
Řešení:
RCF = 1,119 x 10"5 x rpm2 x r
RCF = 1,119 x 10"5 x (50 000)2x 15
RCF = 419 635g
20
Záfcíaaní informace
Při výpočtech vycházíme z následujících informací o nukleových kyselinách a proteinech:
Počet částic v jednom molu = 6,023 x 10 Průměrná molekulová hmotnost páru bazí v DNA = 650 Průměrná molekulová hmotnost bazí v RNA = 360 Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny =110 Pro dsDNA když A26o= 1,0 v lem kyvetě, pak koncentrace dsDNA Pro ssDNA když A26o= 1,0 v lem kyvetě, pak koncentrace ssDNA Pro ssRNA když A26o= 1,0 v lem kyvetě, pak koncentrace ssRNA : Molekulová hmotnost dsDNA = (počet bp) x 650 Počet molů konců dsDNA = 2 x (hmotnost DNA v gramech) / (molekulová hmotnost)
Počet molů konců vytvořených restrikčním štěpení
a) kružnicová DNA = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst)
b) lineární DNA      = 2 x (moly DNA) x (počet štěpných míst) + 2 x (moly DNA)
lug DNA o délce 1 000 bp = 1,5 pmol = 9,1 x 1011 molekul lug DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 0,57 pmol = 3,4 x 1011 molekul lHg DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 0,35 pmol = 2,1 x 1011 molekul lHg DNA fága M13mpl8/19 (délka 7 249 bp) = 0,21 pmol = 1,3 x 1011 molekul lHg DNA fága X (délka 48 502 bp) = 0,03 pmol = 1,8 x 1010 molekul
1 pmol DNA o délce 1 000 bp = 0,66 ug 1 pmol DNA plasmidu pUC18/19 (délka 2 686 bp) = 1,77 ug 1 pmol DNA plasmidu pBR322 (délka 4 361 bp) = 2,88 ug 1 pmol DNA fága M13mpl8/19 (délka 7 249 bp) = 4,78 ug 1 pmol DNA fága X (délka 48 502 bp) = 32,01 ug
DNA o délce 1,0 kb má kódovací kapacitu 333 aminokyselin = protein o M = 37 000 Protein o M = 10 000 může být kódován DNA o velikosti 270 bp Protein o M = 50 000 může být kódován DNA o velikosti 1,55 kb
= 50 ug/ml = 0,15mM = 33 ^g/rnl = 0,1 OmM = 40 ug/ml = 0,11 mM
21