Izolace a purifikace nukleových kyselin METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Nukleové kyseliny DNA - jaderná, mitochondriální, chloroplastová, plasmidová vodíkové vazby v DNA jsou stabilní v rozmezí pH 4-9 RNA – rRNA (80 %), tRNA (10-20 %), mRNA (5 %), miRNA,... 2 Zdroje NK pro izolaci buňky – bakterie (genomová nebo plasmidová DNA), kvasinky virové částice produkty PCR, DNA v gelu po elektroforéze buněčné kultury – izolace genomové DNA, mRNA tkáně a orgány eukaryot klinické laboratoře - leukocyty, amniocyty, buňky z bukální sliznice, buňky z cerebrospinálního moku, vlasové kořínky, bioptický materiál forenzní genetika – tělní tekutiny, vlasy, části tkání nebo orgánů 3 Izolace nukleových kyselin je třeba NK oddělit od ostatních buněčných komponent, které by mohly bránit jejich dalšímu využití a analýze porušení buněčných stěn – lyze buněk, homogenizace vzorků použití enzymů – proteináza K, RNáza, DNáza centrifugace adsorpce NK na silikát (SiO2) fenol-chloroformová extrakce precipitace (srážení) NK 4 Izolace NK – lyze buněk degradace buněčných stěn : enzymatická (lysozym), chemická (detergenty – SDS, Triton X-100) nebo fyzikální (mechanické tření, mražení a rozmrazování, ultrazvuk) 5 http://www.mdpi.com/2072-666X/8/3/83 Homogenizace vzorků 6 http://cellbiologyolm.stevegallik.org/node/74 Metody izolace NK 1. Využití vazby NK na silikátovou kolonu (SiO2) 2. Extrakce a precipitace NK 7 Metody izolace DNA 1. Využití vazby DNA na silikátovou kolonu v přítomnosti chaotropních solí (zvyšujících iontovou sílu, např. NaI) se DNA váže na silikát (SiO2) 8 Izolace DNA na koloně 9 komerčně dostupné kity pro různé druhy a objemy vzorků: rostlinné vzorky, plná krev, plasmidová DNA, celková RNA, mRNA, miRNA, izolace DNA z gelu, přečistění PCR produktů 10 resuspendační pufr lyzační pufr – SDS, NaOH neutralizační pufr - KAc promývací pufr - ethanol eluční pufr – nízká IS Fenol-chloroformová extrakce fenol:chloroform:isoamylalkohol (25:24:1) pH 8,0 EDTA – chelatační činidlo fenol – rozpouštědlo, chloroform – denaturuje proteiny třepáním a centrifugací vznikne fázové rozhraní spodní část (organická fáze, lipidy) rozhraní (vysrážené proteiny) horní část (vodná fáze, polární látky, NK) 11 http://physiology.med.cornell.edu/faculty/mason /lab/zumbo/files/PHENOL-CHLOROFORM.pdf Precipitace DNA přečištění DNA např. po fenol-chloroformové extrakci 1. přidat 3M octan sodný (pH 5,2) do 1/10 celkového objemu 2. přidat 100% ethanol (vychlazený) – 2,5x objem – zmrazit – precipitace DNA 3. centrifugace (11 000 g) 4. odebrat supernatant, přidat 80% ethanol 12 Precipitace DNA 5. centrifugace 6. odebrat supernatant, přidat 80% ethanol 7. centrifugace 8. odebrat supernatant, vysušit, rozpustit ve vodě nebo TE pufru (pro lepší výtěžek lze přidat nosič – tRNA, glykogen) 13 Analýza plasmidové DNA 14 DNA photo-cleaving agents in the far-red to nearinfrared range – a review. RCS Advances DOI: 10.1039/C5RA28102D Analýza plasmidové DNA 15 Petr et. al. Bioscience Reports (2016) 36, e00397, doi:10.1042/BSR20160232 Izolace RNA guanidium thiokyanátfenol-chloroformová extrakce při pH 4,5 !ochrana proti působení RNáz! 16 http://physiology.med.cornell.edu/faculty/mason /lab/zumbo/files/PHENOL-CHLOROFORM.pdf Izolace RNA 17 guanidium thiokyanát-fenol-chloroformová extrakce Izolace mRNA 18 magnetické částice s oligo d(T)25 19 20 Izolace RNA/Protein Integrita RNA 21 Bhaskaran, Shylesh et al.(2011). Breaking Caenorhabditis elegans The Easy Way Using The Balch Homogenizer – An Old Tool For a New Application. Analytical biochemistry. 413. 123-32. 10.1016/j.ab.2011.02.029. RNA integrity following Balch homogenization. Two methods were employed to extract RNA from C. elegans following sample disruption with the Balch homogenizer. (A) Guanidinium isothiocyanate method employing a NucleoSpin RNA Isolation Kit. (B) Trizol (phenol-based) method. In both instances, worm samples were homogenized before molecular disruptants were added. No obvious compromise in RNA integrity was observed in either method. Listed in each panel are DNA marker sizes (bp) and RNA species (28S, 18S, and 5S ribosomal RNA and transfer RNA [tRNA]).