Centrifugační metody separace biomakromolekul Metody molekulární biologie 26.9.2019 Metody separace biomakromolekul 1. chromatografické 2 . centrifugační 3. elektromigrační 2 rozdělení molekul podle velikosti, tvaru, hustoty, náboje Centrifugační metody • Principem separace je pohyb částic v kapalném prostředí pod vlivem odstředivé síly, která vzniká při otáčení rotoru centrifugy • Urychlení sedimentace - izolace, purifikace a charakterizace částí buněk a biomakromolekul • Různé obejmy vzorků, rychlosti rotorů 3 Typy centrifugačních metod 1. Diferenciální centrifugace směs heterogenních částic v homogenním roztoku 2. Zonální centrifugace směs částic s podobnými vlastnostmi v gradientním roztoku - Izokinetická centrifugace – sedimentační koeficient S - Izopyknická (hustotní) centrifugace – vznášivá hustota ρ 4 Základní vztahy G = ω2r ω = 2π rpm/60 G = 4π2 rpm2 r/3600 RCF = 4π2 rpm2 r/3600 × 981 RCF = (1.118 × 10-5) rpm2 r 5 Centrifugační zrychlení Úhlová rychlost (rpm – otáčky za minutu) RCF - relativní centrifugační síla g = 981 cm.s-2 RCF vs. rpm – je třeba znát poloměr rotoru centrifugy Diferenciální centrifugace Separace částic s významně odlišnými vlastnostmi v homogenním roztoku – sedimentace částic různou rychlostí – více opakování 6 Suhett et al.(2015). 99m-Technetium binding site in bone marrow mononuclear cells. Stem Cell Research & Therapy. 6. 10.1186/s13287-015-0107-0. Zonální centrifugace • Homogenní roztok je nahrazen gradientním roztokem – zvyšující se koncentrace v centrifugační zkumavce od hladiny ke dnu • Jednotlivé složky směsi vytváří v gradientním roztoku oddělené zóny • Gradientní roztoky – např. sacharóza, glycerol, CsCl, Percoll • Separace podle velikosti - např. nukleové kyseliny, ribozomální podjednotky 7 Zonální centrifugace 8 Hustotní gradient 9 Sacharóza: 1,0 - 1,3 g/ml CsCl: 1,0 - 1,9 g/ml https://www.tankonyvtar.hu/en/tartalom/tamop412A/2011- 0073_introduction_practical_biochemistry/ch05s03.html Izokinetická centrifugace • Rychlost sedimentace částice je během centrifugace konstantní (stoupající hustota roztoku) – závisí především na hmotnosti částice • Separace nukleových kyselin: 5 – 20 % sacharózový gradient 10 Sedimentační koeficient • Je třeba znát ω a polohy částic x1 a x2 ve zkumavce v časech t1 a t2 • Rozmezí sedimentačních koeficientů biomakromolekul se pohybuje mezi 10-11 a 10-13 s • Svedbergova jednotka - 1 S (Svedberg) = 10-13 s 11 http://www.biologydiscussion.com/ cell-biology/centrifugation-theory- sedimentation-rate-coefficient-and- other-details Sedimentační koeficient 12 https://www.tankonyvtar.hu/en/tartalom/tamop412A/2011- 0073_introduction_practical_biochemistry/ch05s03.html Izopyknická centrifugace 13 • Částice se dělí podle hustoty (také hustotní centrifugace) • Vytvoření hustotního gradientu v centrifugační zkumavce • Analyzované částice se pohybují v roztoku do místa o stejné hustotě https://www.quora.com/What-is-the-difference- between-rate-zonal-and-isopynic-centrifugation Separace superhelikální DNA 14 Gradient CsCl/EtBr https://www.ifm.liu.se/edu/coursescms/TFKE38/lectures/ Separace organel pro izolaci DNA 15 • Gradient roztoku Percollu – separace buněčných částí • Izolace např. mitochondriální nebo chloroplastové DNA Dunkley, Peter et al. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nature Protocols volume 3, pages 1718–1728 (2008) Výpočet % G+C v DNA 16 Gradient CsCl ρ – vznášivá hustota (buoyant density) vliv zastoupení bazí v DNA % G+C = (ρ – 1,66)/0,098 * 100 Vyvažování zkumavek v centrifuze 17 https://druckerdiagnostics.com/knowledge/a-guide-to-balanced-centrifuge-loads/ Vyvažování zkumavek v centrifuze 18