Centrifugační metody separace
biomakromolekul
METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
Metody separace makromolekul
1. chromatografické 2. centrifugační 3. elektromigrační
dělení podle velikosti, tvaru, hustoty, náboje
2
Centrifugační metody
Principem separace je pohyb částic v tekutém prostředí pod vlivem
odstředivé síly, která vzniká při otáčení rotoru centrifugy
Urychlení sedimentace - izolace, purifikace a charakterizace částí buněk
a biomakromolekul
Různé obejmy vzorků, rychlosti rotorů
3
Typy centrifugačních metod
1. Diferenciální centrifugace
směs heterogenních částic v homogenním roztoku
2. Zonální centrifugace
směs částic s podobnými vlastnostmi v gradientním roztoku
- Izokinetická centrifugace – sedimentační koeficient S
- Izopyknická (hustotní) centrifugace – vznášivá hustota ρ
4
Základní vztahy
G = ω2r
ω = 2π rpm/60
G = 4π2 rpm2 r/3600
RCF = 4π2 rpm2 r/3600 × 981
RCF = (1.118 × 10-5) rpm2 r
5
Centrifugační zrychlení
Úhlová rychlost (rpm – otáčky za minutu)
RCF - relativní centrifugační síla
g = 981 cm s-2
RCF vs. rpm – je třeba znát
poloměr rotoru centrifugy
Diferenciální centrifugace
Separace částic s významně odlišnými vlastnostmi v homogenním
roztoku – sedimentace částic různou rychlostí – více opakování
6
Souza, Sergio et al.(2015). 99m-Technetium binding site in bone marrow
mononuclear cells. Stem Cell Research & Therapy. 6. 10.1186/s13287-015-0107-0.
Zonální centrifugace
Homogenní roztok je nahrazen gradientním roztokem – zvyšující se
koncentrace v centrifugační zkumavce od hladiny ke dnu
Jednotlivé složky směsi vytváří v gradientním roztoku oddělené zóny
Gradientní roztoky – např. sacharóza, glycerol, CsCl, Percoll
Separace podle velikosti - např. nukleové kyseliny, ribozomální podjednotky
7
Zonální centrifugace
8
Hustotní gradient
9
http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemistry/ch05s03.html
Sacharóza: 1,0 - 1,3 g/ml CsCl: 1,0 - 1,9 g/ml
Izokinetická centrifugace
Rychlost sedimentace částic je v průběhu centrifugace konstantní
(stoupající hustota roztoku) – je dána především velikostí částice
Separace nukleových kyselin: 5 – 20 % sacharózový gradient
10
Sedimentační koeficient (s)
Je třeba znát ω a polohy částic x1 a x2 ve zkumavce v časech t1 a t2
Rozmezí sedimentačních koeficientů biomakromolekul se pohybuje
mezi 10-11 a 10-13 s
Svedbergova jednotka - 1 S (Svedberg) = 10-13 s
11
http://www.biologydiscussion.com/cell-biology/centrifugation-
theory-sedimentation-rate-coefficient-and-other-details
Sedimentační koeficient
12
http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/
IntroductionToPracticalBiochemistry/ch05s03.html
Izopyknická centrifugace
Částice se dělí podle hustoty (také hustotní centrifugace)
Vytvoření hustotního gradientu v centrifugační zkumavce
Analyzované částice se pohybují v roztoku do místa o stejné hustotě
13
https://www.quora.com/What-is-the-difference-
between-rate-zonal-and-isopynic-centrifugation
Separace superhelikální DNA
Gradient CsCl/EtBr
14
https://www.ifm.liu.se/edu/coursescms/TFKE38/lectures/
Separace organel - izolace DNA
Gradient roztoku Percollu –
separace buněčných částí
Izolace např. mitochondriální
nebo chloroplastové DNA
15
Dunkley, Peter et al. A rapid Percoll gradient procedure for preparation
of synaptosomes. Nature Protocols volume3, pages 1718–1728 (2008)
Výpočet % G+C v DNA
Gradient CsCl
ρ – vznášivá hustota (buoyant density)
- vliv zastoupení bazí v DNA
% G+C = (ρ – 1,66)/0,098 * 100
16