Daniel Renčiuk
BFU AV ČR, v.v.i.
Elektroforetické metody
VFU, Brno
04.10.2018
Elektroforéza
Migrace nabitých částic v elektrickém poli
Rychlost migrace částice = elektroforetická mobilita částice x síla elektrického pole
[cm.s-1] [cm2.V-1.s-1] [V.cm-1]
• velikost
• tvar
• náboj
• pH média
• teplota
• viskozita
• …
2
Elektroforéza – dělení + terminologie
Uspořádání
• Verikální
• Horizontální
• Kapilární
Separační médium - nosič
• Akrylamid
• Agaroza
• Speciální polymery
• …
Podmínky elektroforézy
• Denaturační (vyšší struktura biomolekul zničena)
• Nativní (zachována vyšší struktura biomolekul)
Metoda
• Zónová elektroforéza
(na nosiči – gel)
• Volná elektroforéza
(v roztoku)
3
Historie
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius
Laureate
The Nobel Prize in Chemistry 1948
Prize Motivation: "for his research on electrophoresis and
adsorption analysis, especially for his discoveries
concerning the complex nature of the serum proteins"
Born: 10 August 1902, Stockholm, Sweden
Died: 29 October 1971, Uppsala, Sweden
Field: Physical chemistry Analytical biochemistry
4
Elektroforéza
V molekulární biologii se standardně používá gelová elektroforéza
Výhody gelové elektroforézy
• Jednoduchost, rychlost, cena
• Snadná izolace separovaných molekul
• Snadná změna podmínek – jiné chování
biomolekul
• Široká škála množství materiálu –
preparativní x analytická
Požadavky na separační medium (gel)
• Homogenita
• Inertnost
• Reprodukovatelnost
• Snadná příprava
• Transparentnost - vizualizace
Používané gely
• Akrylamidový
• Agarozový
• Speciální polymery
5
Elektroforéza
6
DNA sekvenační gel
SDS-PAGE proteinů
K čemu elektroforéza nukleových kyselin?
Separace molekul
• Velikost
• Náboj
• Sekundární (vyšší) struktura
Proč separovat nukleové kyseliny?
• Ověření výsledků enzymatických reakcí (polymerace,
štěpení, ligace, …) – nativní x denaturační gel
• Ověření konformace nukleových kyselin – nativní gel
• Kvalita syntetických oligonukleotidů – denaturační gel
• Purifikace nukleových kyselin – denaturační gel
Proč separovat proteiny?
• Identifikace přítomnosti proteinů (při izolaci
rekombinantních proteinů) – SDS-PAGE
• Proteomika – 2D-DIGE
• Ověření kvality nativních proteinů – nativní PAGE
7
Náboj makromolekul
Nukleové kyseliny Proteiny
• Náboj z cukr-fosfátové páteře
• Celkový náboj úměrný velikosti/délce molekuly
• Náboj z nabitých a polárních aminokyselin
• Celkový náboj silně závisí na primární sekvenci
aminokyselin – tzv. izoelektrický bod (pI) proteinu
N
O
O
O
P
OH
O
OH
N
O
O
O
P
O
OH
N
O
O
OH
P
O
OH
N
NH2
O
N
NH
N
NH2
O
NH
O
O
CH3
8
Náboj proteinu – Izoelektrický bod
Celkový náboj proteinu je sumou nábojů jednotlivých aminokyselin v sekvenci proteinu, ale
Náboj aminokyselin je determinován pH roztoku
Izoelektrický bod (pI) = pH při kterém má aminokyselina (protein) nulový náboj
Pozitivní a negativní náboje se vzájemně kompenzují
• Při pH vyšším než pI –protein má celkový náboj záporný – migrace k anodě
• Při pH nižším než pI - protein má celkový náboj kladný – migrace ke katodě
lysine
9
Elektroforéza dle podmínek
• Sekundární struktura zničena
• Migrace dle velikosti/délky
• 7M močovina + formamid + 50°C
• 100s – 1000s V
ProteinyNukleové kyseliny
DenaturačníNativní
MS2S1
S1-G4-22b S2-DX-2x12b
• Sekundární struktura zachována
• Migrace dle velikosti, tvaru, molekularity
• Nativní podmínky
• 10s – 100s V
MS2S1
30
20
10
30
20
10
S1-G4-22b S2-DX-2x12b
b
b
• Vyšší struktury zničeny
• Migrace dle velikosti/délky
• SDS-PAGE - dodecyl sulfát sodný
• 100s V
MS2S1
S2-1x825AA-pI 5
150
100
50
kD
• Vyšší struktury zachovány
• Migrace dle velikosti (multimery) a pI proteinu
• Nativní podmínky
• 100s V
S1-4x500AA-pI 5 S2-1x825AA-pI 5
S1-4x500AA-pI 5
S3
S3-1x825AA-pI 10
S3-1x825AA-pI 10
MS2S1
150
100
50
kD
S3
10
Polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE)
• Gel je směsí monomerů akrylamidu (polymerizuje do dlouhých lineárních řetězců) a N,N’-metylen bisakrylamidu
(propojuje lineární řetězce akrylamidu) – monomery jsou neurotoxiny
• Standardní poměr mono : bis = 29 : 1 or 19 : 1 nižší poměr = hustší gel (menší póry)
• Standardní celkový obsah mono+bis 4 až 20 % w/v vyšší koncentrace = hustší gel (menší póry)
• Polymerace iniciována přídavkem amonium persulfátu (APS) a tetrametylen diaminu (TEMED) ve finální koncentraci 0,1 %
- radikálová polymerace
• Standardně vertikální uspořádání
• Vizualizace variabilní dle typu biomolekul
Nukleové kyseliny
Proteiny
11
Denaturační x nativní PAGE nukleových kyselin
AATGGGTGGGTGGGTGGGTAA
• Sekvence mají stejnou délku – 21 nt a
velice podobnou velikost (1x G/T)
• Odlišná migrace na nativním gelu dána
odlišnou konformací (T3) nebo
molekularitou (T11)
• Na denaturačním gelu migrace identická
Nativní PAGE DNA tvořící kvadruplex
• 16% PAG, 10mM K-fosfát pufr, pH7 + 85 mM KCl
• 40V, 15 h, 20°C
• StainAll
AATGGGTGGGTGGGTGGGTAA
Denaturační PAGE DNA tvořící kvadruplex
• 20% PAG, 1xTBE, 7M urea
• 500V, 1 h, 50°C
• StainAll
12
Agarozová elektroforéza nukleových kyselin
Nativní agarozová elektroforéza PCR
amplifikovaných fragmentů promotoru genu oct4
• 1,5% agaroza, 1xTAE pufr, pH 7
• 80V, 45 min, 25°C
• Ethidium bromid v gelu + UV transiluminace
• Matrix gelu tvořen agarozou – kopolymer manózy a galaktózy
izolovaný z mořských řas
• Standardně se používá 0,3 – 4 % w/v + nativní podmínky
• Čím vyšší koncentrace tím vhodnější pro menší fragmenty
• Varem v roztoku pufru dojde k tání agarozy – následně nalití do
formy a během chladnutí agaroza polymeruje
• Elektroforéza standardně v horizontálním uspořádání
• Obvykle barva pro vizualizaci přímo v gelu (EtBr, SYBR, …) –
přidává se během tuhnutí agarozy
13
Pulzní gelová elektroforéza
• Elektroforetická metoda pro separaci velkých molekul DNA (>30 kbp) – agarozový gel
• Molekuly NK>20-30 kbp migrují v (agarozovém) gelu při elektroforéze v konstantním elektrickém poli stejně,
nezávisle na svoji velikosti – nerozlišitelné
• Pokud měníme v průběhu elektroforézy orientaci elektrického pole (tzv. pulzní pole), větší molekuly se re-orientují
obtížněji – výsledný přímý pohyb je pomalejší - dochází k separaci i velkých molekul NK (horní limit až 10 Mbp –
celé kvasinkové chromozomy, …)
• Standardní uspořádání směrů elektrického pole – možná jsou i jiná uspořádání
14
Separace nukleových kyselin
Separace molekul DNA dle
velikosti v agarozovém gelu
• Pro menší molekuly se využívá akrylamidový gel
• Pro větší molekuly se využívá agarozový gel
15
Vizualizace – nukleové kyseliny
Metoda Detekce Citlivost Konformační
selektivita
Signál vztažen na Typ gelu
Přímé značení
NK
Fluorescence,
radiodetekce
Velmi vysoká(pmol-fl.,
fmol-radio.)
Ne Značku = řetězce
NK
PAG + agar.
UV shadowing
(žádná značka)
epi UV (254) +
TLC deska
Nízká (0.3 µg) Ne Báze NK PAG
Blot +
hybridizace
Fluoresnce,
radiodetekce
Velmi vysoká Ne Značku = řetězce
NK
Barvenípoelektroforéze
Ethidium
bromid
Fluorescence trans
UV (254)
vysoká (0.1 ng dsDNA)
až nízká (konformace)
Vysoká Báze NK Agar. (PAG)
SYBR
Gold/Green,...
Fluorescence -
VIS
Vysoká (0.02 ng dsDNA)
až nízká (konformace)
Vysoká Báze NK Agar. (PAG)
StainsAll
(Sigma)
Foto - VIS Střední až nízá (100-1
ng)
Nízká Báze NK PAG
Stříbro Foto - VIS Vysoká (pg) Střední Báze NK PAG
Barvav
gelu
EtBr a další barvy mohou být přidány přímo do gelu – mohou ovlivňovat migraci při detekci je vyšší pozadí, ale práce je
jednodušší 16
Vizualizace – nukleové kyseliny
Ethidium bromid
• Interkalační barvivo
• 20-30x nárůst fluorescence po
interkalaci – UV 254, 312 nm
• 1 EtBr / 4-5 bp DNA
• RNA i DNA, preferenčně ds -
0,1ng (dsDNA) – 5 ng (RNA)
• Akrylamid zháší EtBr fluorescenci
• Silně mutagenní
SYBR Green I
• Interkalační barvivo
• 1000x nárůst fluorescence po
interkalaci – UV 300, VIS 490 nm
• RNA i DNA, preferenčně ds -
0,05ng (dsDNA) – 1 ng (RNA)
• Konformační selektivita
• Mnohem méně mutagenní
Stříbro
• Přímá vizualizace - viditelné
• RNA, DNA i proteiny
• Citlivost obdobná EtBr
• Vhodné i pro akrylamidové gely
• Složitější barvení – fixace, …
Stains All
• Přímá vizualizace - viditelné
• RNA, DNA i proteiny
• Citlivost nižší než EtBr
• Vhodné pro akrylamidové gely
17
Denaturační PAGE DNA - barvení
Přímá vizualizace vzorků
Některé značené 5‘-FAM
Typhoon FLA9300 skener
• Laser 473 nm
• Emisní filtr LBP (long-pass blue)
Post-elektroforetické barvení Stains-All
Barví vše
Klasický skener – viditelné světlo
Značené vzorky
DNA správná,
ale zřejmě poškozená značka
Nečistoty–špatně
syntetizovanéfragmenty
18
Denaturační PAGE proteinů – SDS
{Bio-Rad}
• Migrace proteinů za nativních podmínek je ovlivněna velikostí, konformací a především nábojem (pI) – na rozdíl od NK
– obtížná interpretace elektroforetogramu za nativních podmínek
• Konstantního náboje a linearizace molekuly proteinu je docíleno obalením molekulami detergentu – dodecylsulfátu
sodného (SDS) – protein je denaturován
• SDS se váže poměrně konstantně – náboj daný SDS zhruba odpovídá molekulové hmotnosti proteinu – separace pouze
dle velikosti
• Disulfidové vazby v proteinech se eliminují redukčním činidlem (β-merkaptoetanol, dithiothreitol) a následným varem
SDS-PAGE frakcí lyzátu buněk E.coli – barvení Comassie
19
Denaturační PAGE proteinů – SDS
{Bio-Rad}
Running gel
• Separace proteinů dle velikosti
• 4-20% akrylamid + SDS
• Tris.Cl pufr, pH 8.8
Stacking gel
• Zostření směsi proteinů do jednoho
úzkého proužku – při následné separaci
dle velikosti startují zároveň
• Silně porézní gel (málo akrylamidu)
• cca 5% akrylamid + SDS
• Tris.Cl pufr, pH 6.8
Elektroforetický pufr
• Tris-glycin, pH 8.3
pH 8.3 – glycinát negativně nabitý – rychlý
pH 6.8 – glycinát = zwitter-ion – migrace nakonci
pH 6.8 – Cl- – migrace v čele
pH 6.8 – proteiny v SDS – migrace uprostřed
Hranice - změna
Hranice – změna – proteiny tlačeny vpřed
glycinátovou zónou, která v pH 8.8 začíná
migrovat rychle
pH 8.8 – glycinát negativně nabitý – rychlý
-
+
Izotachoforéza
• Iso-tacho = stejná rychlost
• Glycinate (na konci) – proteiny (uprostřed) – chloridy (v čele) migrují stejnou rychlostí
• Stabilní uspořádání v průběhu migrace stacking gelem – jednotlivé komponenty jsou omezeny v možnosti přecházet do
jiných zón (pH x pI, síla el. pole, …) 20
Gradientové polyakrylamidové gely
{Bio-Rad}
• Zvyšující se koncentrace akrylamidu v gelu směrem ke spodní části gelu
• Vetší rozsah molekulových hmotností separovaných gelem
• Lepší rozlišení proteinů o podobné molekulové hmotnosti
21
Nativní x Denaturační
• Sekundární struktura zničena
• Migrace dle velikosti/délky
• 7M močovina + formamid + 50°C
• 100s – 1000s V
ProteinyNukleové kyseliny
DenaturačníNativní
MS2S1
S1-G4-22b S2-DX-2x12b
• Sekundární struktura zachována
• Migrace dle velikosti, tvaru, molekularity
• Nativní podmínky
• 10s – 100s V
MS2S1
30
20
10
30
20
10
S1-G4-22b S2-DX-2x12b
b
b
• Vyšší struktury zničeny
• Migrace dle velikosti/délky
• SDS-PAGE - dodecyl sulfát sodný
• 100s V
MS2S1
S2-1x825AA-pI 5
150
100
50
kD
• Vyšší struktury zachovány
• Migrace dle velikosti (multimery) a pI proteinu
• Nativní podmínky
• 100s V
S1-4x500AA-pI 5 S2-1x825AA-pI 5
S1-4x500AA-pI 5
S3
S3-1x825AA-pI 10
S3-1x825AA-pI 10
MS2S1
150
100
50
kD
S3
22
Vizualizace proteinů – SDS-PAGE
Nespecificky
• Barvení všech proteinů v gelu nespecifickým barvivem
Specificky
• Přenos proteinů z gelu na membránu (nitrocelulóza, …) – western blot – někdy příště
• Barvení membrány prostřednictvím protilátek
Stříbro
• Přímá vizualizace - viditelné
• RNA, DNA i proteiny
• Citlivost obdobná EtBr
• Vhodné i pro akrylamidové gely
• Složitější barvení – fixace, …
Comassie brilliant blue
• Přímá vizualizace - viditelné
• Proteiny – SO32- reaguje s pozitivními AK,
benzen s negativními AK
• Nutné odbarvení - destain
23
Izoelektrická fokusace (IEF)
3 10pI
• Gel připraven s fixním gradientem pH (immobilized pH gradiend – IPG) – směs amfolytů (slabé kyseliny či báze) kovalentně
vázaných do struktury gelu – IPG stripy komerčně dostupné
• Akrylamidový gel s velkými póry – nemá separační účinek – separace pouze dle pI proteinu, ne velikosti
• Při migraci proteinu gelem s pH gradientem se mění náboj proteinu – v oblasti kde pI = pH protein ztratí náboj a přestane
migrovat
24
Dvourozměrná (dvoudimenzionální) PAGE
• Souběžná analýza velkého množství proteinů (>1000) – proteom
• Nejprve izoelektrická fokusace v IPG stripu – separace dle pI
• Následně SDS-PAGE v kolmém směru – separace dle velikosti
• Následně barvení
• Každý protein má unikátní pozici
• Obtížná interpretace
25
Diferenční 2D gelová elektroforéza (2D-DIGE)
{Diez R. et al. in Neuroproteomics, ed. Alzate O. 2010}
• Extrakty proteinů získané např. za různých podmínek
kultivace označeny různými fluorescenčními
značkami
• Třetí fluorescenční značkou označen kontrolní
experiment
• Vše smícháno, následně 2D-PAGE
• Analýza výsledku v jednotlivých barevných kanálech
pro použité fluorescenční barvy – 2D-DIGE
• Rozdíly indikují změny v expresi příslušných proteinů
26
Elektroforetická retardační analýza
• Electromobility shift assay (EMSA)
• Srovnání elektroforetické migrace např. molekuly DNA samotné a při
interakci s vazebným proteinem – vázaný protein zvyšuje velikost
komplexu - rozdíl v migraci – kvantifikovatelné
• Tzv. Supershift assay – k interagujícímu proteinu je přidána příslušná
protilátka – podstatné zvýšení velikosti komplexu – výraznější
zpomalení
{Petr M. et al., Biosci Rep, 2016} 27
Kapilární gelová elektroforéza
• Gel (komerční syntetický polymer) umístěn v kapiláře; výrazně vyšší napětí (desitky kV)
• Nutné menší množství vzorku, lepší rozlišení
• Variabilní možnosti detekce – standardně fluorescence – možnost vícebarevného značení x interní velikostní standard
• Možnost automatizace a paralelizace – kapilární sekvenátory
28