Restrikční endonukleázy METODY MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE Enzymy v molekulární biologii Polymerázy – syntéza nového polynukleotidového řetězce dle matrice Nukleázy – štěpení polynukleotidového řetězce Kinázy – fosforylace substrátu – připojení fosfátové skupiny na 5‘ konec Fosfatázy – defosforylace substrátu – odštěpení fosfátové skupiny z 5‘ konce Ligázy – spojení dvou konců polynukleotidového řetězce Transferázy – připojení funkční skupiny nebo nukleotidu (bez matrice) 2 Nukleázy katabolické enzymy, štěpení polynukleotidového řetězce DNA (RNA) od konců (exonukleázy) nebo uvnitř řetězce (endonukleázy) DNA nukleázy (DNázy): Bal31, Exonukleáza fága lambda (λ), Nukleáza ExoIII, DNáza I, Nukleáza S1, Restrikční endonukleázy RNA nukleázy (RNázy): RNáza A, RNáza H, RNáza T1 Nukleázy využívané pro editaci genomu: Cas9 – CRISPR/Cas9, ZFN, TALEN 3 5‘ PO3 3‘ OH PO3 5‘ OH 3‘ EXO 5‘-3‘ EXO 3‘-5‘ ENDO Restrikční endonukleázy 1970: objev první RE – HindII (bakterie Haemophilus influenzae) bakteriální enzymy, spolu s metylázami součásti restrikčněmodifikačních systémů: ochrana bakteriálních buněk před cizorodými molekulami DNA omezují propagaci bakteriofágů 4 Vasu and Nagaraja Microbiol Mol Biol Rev. 2013 77(1):53-72. doi: 10.1128/MMBR.00044-12. Restrikčně-modifikační systém 5 Action of a Type II restriction–modification system. (A) Restriction enzyme and modification enzyme. The modification enzyme protects the restriction enzyme targets through DNA methylation. (B) Attack on incoming DNA lacking proper methylation. (C) Enforcement of an epigenetic state. After loss of the restriction–modification gene complex or imbalance between restriction and modification, DNA methylation decreases. The restriction enzyme will attack exposed sites, killing the cell. Chromosome breakage may be repaired or may generate a variety of mutated and rearranged genomes, some of which might survive. Ds, double strand; rm, restriction–modification gene complex; RM, restriction modification. Ishikawa et al. DNA Research 2010 17(6):325-42 · DOI: 10.1093/dnares/dsq027 sekvenčně specifické nukleázy produkované bakteriemi štěpí obě vlákna dvouřetězcové DNA většinou rozeznávají palindromy využití: příprava rekombinantních molekul DNA studium struktury, organizace, exprese a evoluce genomu základ genového inženýrství 6 Restrikční endonukleázy založena na struktuře enzymu, kofaktorech a charakteru štěpené sekvence Typ I: vyžadují kofaktory ATP, Mg2+ a S-adenosyl-L-methionin, mají restrikční i metylázovou aktivitu Typ II: vyžadují Mg2+, pouze restrikční aktivita, rozpoznávají většinou palindrom dlouhý 4-8 bp – využití v genovém inženýrství Typ III: vyžadují ATP, tvoří komplex s metyltransferázou Typ IV: rozpoznávají metylovanou DNA Typ V: např. cas9-gRNA komplex, využití tzv. guide RNA 7 Klasifikace RE vážou se na specifická cílová místa (4-8 bp), která mají často povahu palindromu štěpí dvouřetězcové molekuly DNA hydrolýzou fosfodiesterových vazeb obou řetězců v restrikčním místě, které je uvnitř cílového místa nebo v jeho bezprostředním sousedství 8 Restrikční endonukleázy typu II https://microbenotes.com/restriction -enzyme-restriction-endonuclease/ rotační symetrie - palindromy 9 Cílová místa RE typu II záleží na směru řetězce DNA (5’-3’ nebo 3’-5’) 10 Orientace cílových míst tupé („blunt“) konce (po štěpení obou řetězců ve stejném místě) kohezní (lepivé, „sticky“) konce (po štěpení řetězců v místech obvykle vzdálených 1-4 nukleotidy) 5´-kohezní nebo 3´-kohezní („overhang“) 11 Produkty štěpení RE spojování různých fragmentů s komplementárními kohezními konci – tvorba rekombinantní DNA 12 Spojování fragmentů DNA např. EcoRI 1. písmeno: počáteční písmeno rodu produkční bakterie (Escherichia) 2. a 3. písmeno: první dvě písmena druhu produkční bakterie (coli) 4. písmeno: (ne vždy) označení kmene produkční bakterie (RY13) 5. římská číslice vyjadřuje pořadové číslo endonukleázy izolované z dané bakterie Je známo více než 3500 restrikčních endonukleáz typu II 13 Názvosloví RE 14 Cílová místa některých RE 15 Cílová místa některých RE https://microbenotes.com/restriction- enzyme-restriction-endonuclease/ 16 Restrikční místa v genomech 17 Izoschizomery a neoschizomery Izoschizomery - RE se stejným cílovým místem a stejným typem štěpení např. SphI (CGTAC/G) and BbuI (CGTAC/G) – jiný druh bakterií mohou se lišit ve schopnosti štěpit nemetylovanou a metylovanou DNA Neoschizomery - RE se stejným cílovým místem, ale odlišným místem rozštěpení DNA např. SmaI (CCC/GGG) and XmaI (C/CCGGG) 18 Izokaudamery různé RE, které mají odlišné cílové sekvence, ale vytvářejí stejné lepivé konce spojování různých molekul DNA – vytvoření asymetrické sekvence, která už není restrikčními enzymy štěpená NotI GC*GGCC GC CG CCGG*CG Bsp120I G*GGCC C C CCGG*G GCGGCCC CGCCGGG 19 Jednotka aktivity RE Množství RE, které zcela rozštěpí 1 μg DNA za 1 hodinu v 50 μl reakci při optimální teplotě a v optimálním prostředí (New England Biolabs) 20 Hvězdičková (star) aktivita schopnost RE štěpit kromě cílového místa také jiné - příbuzné sekvence za optimálních podmínek je specificita RE velmi vysoká – např. u EcoRI mezi GAATTC a TAATTC je rozdíl 105 za neoptimálních reakčních podmínek (pH, iontová síla, koncentrace glycerolu) jsou RE méně specifické https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning- learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/molecular- cloning/restriction-enzymes/restriction-enzyme-key-considerations.html Hvězdičková aktivita RE 21 https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/cloning- learning-center/invitrogen-school-of-molecular-biology/molecular- cloning/restriction-enzymes/restriction-enzyme-key-considerations.html 22 https://www.thermofisher.com/cz/en/ home/life-science/cloning/cloning- learning-center/invitrogen-school-of- molecular-biology/molecular- cloning/restriction-enzymes/restriction- enzymes-genome-mapping.html