PCR Polymerázová řetězová reakce Metody molekulární biologie pro farmaceuty Ing.Dr. Branislav Ruttkay-Nedecký ruttkay-nedeb@vfu.cz POLYMERÁZOVÁ ŘETĚZOVÁ REAKCE PCR umožňuje selektivní zmnožení (amplifikaci) určité oblasti DNA v podmíkách in vitro; a to procesem, který připomíná replikaci DNA in vivo. Targel sequence Cyctei >.:i I-. a ni nľnr i. If"; Genormt DNA Oeiiatursiitffl: Heel i:: f ■ V lo separate strands C-* Annealing; Cool Ig altou priirtíís to fontu hydrogen hcitri wllh er d & ol langet sequence © Eirínslon; IINA pal yjna rau* í :lc s nuelealWea lo 11«! ľ e:irl of t-.lch primer 3! ÖS" / \ 9' C 33' 5' J - Pri Primers ; nuclea-I Tides Cycler yields 4 ■ VO Bí ; \ f Cycle 3 ,iV'Cľ. :i Hioletutes: i -i-; i-.: , (jr> white banes) in.il;:n lárrjfi /1 |\ 1983 - Karry Mullis (Dostal nápad během noční jízdy autem) 1993 - Nobelova cena za chemii http://schoolworkhelper.net/pcr-uses-steps-purpose/ ZÁSADNÍ PŘEDPOKLADY SPRÁVNÉ POLYMERACE Přítomnost tem plátu Polymerace je možná pouze podle známé matrice DNA - templátu- Přítomnost primem Nelze začít z nuly Komplementarita K polymeraci nukleotidů dochází vždy podle komplementární dvojice primer/templát Směr polymerace Připojování nukleotidů je vždy ve směru 5'- 3' 3 PCR - KOMPONENTY • Templát - DNA, která má být namnožena • MgCI2 • Nukleotidy dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) • Primery (forward and reverse primer) Primery-oligonukleotidy ohraničující cílovou sekvenci • Taq DNA polymeráza Zajišťuje připojování nukleotidů STARTING MATERIALS DNA polymerase Primers: 4 Targeted sequence Nucleotides: dATP dCTP H dGTP H ÓTTP PCR - PRŮBĚH DENATURACE DNA Prvním krokem je krátké zahřátí celé směsi na 94°C -96°C. Teplem se poruší vodíkové vazby a oba řetězce DNA se oddělí STARTING MATERIALS DNA polymerase Primers: Targeted sequence Nucleoli des: dATP dCTP dGTP dTTP 3' 3 O Heat briefly to separat* dna strands PCR - PRŮBĚH ANNEALING Druhým krokem je nasedání primerů (annealing). Ochlazení reakční směsi na 50°C - 65°C umožní primerům navázat se na cílovou DNA vodíkovými můstky podle pravidel komplementarity = Primers Q Cool to allow primers to hydrogen^ bond Cycle 1 yields 2 molecules 6 PCR - PRŮBĚH PRIMERY Primery jsou krátké, synteticky vyrobené molekuly jednořetězcové DNA (20-30 nukleotidů), které jsou komplementární ke koncům DNA, která má být amplifikována. Primery tak determinují místo na DNA, které má být zmnoženo (na obrázku označeno modře) STARTING MATERIALS DNA polymerase Primers: ONA S'R? Targeted sequence Nucleotides: dATP dCTP dGTP dTTP 5' / \ 3 3' O Heat briefly to separate DNA strands s- ^ ^ Primers If Q Cool to allow primers to hydrogen-bond Cycle 1 yields 2 molecules PCR - PRŮBĚH EXTENSION Třetí krok: DNA-polymeráza nyní může přidávat nukleotidy k 3'koncům primerů, jako při obvyklé replikaci Směs je zahřátá na 72°C . STARTING MATERIALS DNA polymerase Primers: DNA 5 ? Targeted sequence 3 5' / \ 5r Printers \ 1 \ Nucleotides: dATP dCTP dTTP -I -I -I -K y O Heal briefly to separate dna strands Q Cool to allow primers to hydrogen-bond Q DNA polymerase adds nucleotides to the 3' end of each primer Cycle 1 yields 2 molecules 8 PCR-PRŮBĚH CYKLY Směs je nyní znovu ohřátá a začíná nové kolo cyklu každé kolo trvá pouze asi 5 minut.Výsledkem je dvojnásobné množství cílové DNA, dlouhé i stovky párů bází tento tříkrokový cyklus je následně opakován znovu a znovu. Za třicet cyklů je možno teoreticky obdržet miliardu kopií STARTING MATERIALS DNA polymerase Primers: DNA fö3' Targeted sequence 3 5' Nucleotides: dATP dCTP dGTP dTTP H H ■\ H 5 3' 3- o Hea1 brie"y to separate DNA strands f ' Prlmws : í Q Cool to allow primers to hydrogen-bond Q DNA polymerase adds nucleotides to the 3' end of each primer fc m s? A A V, Copyrights) Pea/sc-n Education, inc., publlsrilna as Benjamin Cummiriůjs. Cycle 1 yields 2 molecules Cycle 2 yields 4 molecuies POČET CYKLŮ • analytická PCR - ne více než 40 • nejčastěji 25-35 cyklů • vyšší počet cyklů vznik nespecifických artefaktů • vyčerpávání komponent reakce • degradace polymerázy i DNA Například při vyčerpání primem se zbývající nukleotidy účastní syntézy nespecifických produktů, které vznikají po vzájemném annealingu již vzniklých amplikonů a výsledkem jsou delší amplifikační produkty vytvářející „šmouhy" na elektroforetickém gelu 10 ZÁVĚREČNÁ EXTENZE • slouží k dokonalému dosyntetizování všech produktů • probíhá po dobu 5-15 min. při 72°C • poté je možné produkty amplifikace uschovat a následně analyzovat 11 Technické provedení PCR - termocyklery • Mikroprocesorem kontrolované zařízení, které obsahuje kovové reakční bloky vyhřívané a chlazené polovodiči (Peltierova pumpa), vodou, vzduchem nebo mikrovlnami • Termocyklery dokáží automaticky rychle měnit teplotu v reakčních blocích mezi třemi základními teplotami PCR cyklu PCR vyhodnocení GELOVÁ ELEKTROFORÉZA Gelová elektroforéza je metoda, která odděluje jednotlivé fragmenty DNA na základě jejich pohybu gelem. Pohyb je způsoben elektrickým polem. Směr a rychlost pohybu je dán nábojem molekul, jejich velikostí a tvarem a rovněž velikostí náboje elektrického pole a složením gelu. DNA je záporně nabitá , bude se tedy pohybovat ke kladnému konci SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI • Termostabilní DNA polymeráza (1 - 2 U/ reakci; tolerance 0.5 - 5 U/reakci) enzym 5-3' 3-5' Taq ano ne Tth ano ne Pfu ne ano Hot start polymerázy - DNA polymeráza vázaná na protilátku, zabránění polymeraci při RT- 70 °C, nutná počáteční denaturace (2-10 minut / 95 °C) vyšší specifita reakce 14 TEPLOTA PŘIPOJENÍ PRIMERŮ Tm (melting temperature) teplota, při které se bude zhruba 50% primem v reakci vázat k templátu. Tm = (počet G+C)x4 + (počet A+T)x2 Ta (annealing temperature) teplota, při které bude docházet k vazbě většiny primem v reakci k templátu Ta = Tm - 4°C Výpočet Tm a Ta - příklad Jakou Tm a Ta mají tyto primery? Primer forward (dopředný) 5'-AAAGTT CGC TCAGGTACG - 3' Výsledek : Tm = 54°C, Ta = 50°C Primer reverse (reverzní) 5'- CGT ACG CAT CGT GCG AG C - 3' Výsledek : Tm = 60°C, Ta = 56°C Ideální annealingová teplota této dvojice primerů bude 50°C SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI • Oligonukleotidové primery koncentrace v reakční směsi 0.1 - 1.0 mM (optimalizace - qPCR) 20 - 30 nukleotidů, CG - 40 - 60%, podobná Tm primery by neměly být vzájemně komplementární, hlavně na 3'konci Effett of Primer-Dirmíř FormaHon 1 S ih SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI Oligonukleotidové primery Extended Hyper-variable Segment 1(15919-16569) 115919 _____160301 -TGTAAACCGGAGATGAAAACCTTTTTCCAAGGACAAATCAGAGAAAAAGTCTTTAACTCC^ -ACATTTGGCCTCTACTTTTGGAAAAAGGTTCCTGTTTAGTCTCTTTTTCAGAAATTGAGGTGGTAATCGTGGGTTTCGATTCTAAGATTAAATTTGATAAGAGACAAGAAAG-|1 5'-TAACTCCACCATTAGCACCC-3'^( 1121 116031 _ _ 161421 -ATGGGGAAGCAGATTTGGGTACCACCCAAGTATTGACTCACCCATCAACAAC^ -TACCCCTTCGTCTAftACCCATGGTGGGTTCATAACTGAGTGGGTAGTTGTTGGCGATACATAAAGCATGTAATGACGGTCGGTGGTACTTATAACATGCCATGGTATTTATG-|113 224| 116143 162401 CTGTAGTACATAAAAACCCAATCCACATCAAAA--C----CCCCT-C-C-CC--A-TGCTTACAAGCAAGTACAGCAATCAACC-CTCAACTATCACÄCATCAA- ICAT CAT GTAT TTTTGGGT TAGGT GTAGT T T T--G----GGGGA-G-G-GG--T-ACGaUtCGTTCATGTCGTTAGTTGG-GAGTTGATAGTGTGTAGTT- |225 323| 116241 163481 -CTGCAACTCCAAAGCCAC-CCC-TCACCCACTAGGATACCAACAAACCTACC^ -GACGTTGAGGTTTCGGTG-GGG-AGTGGGTGATCCTATGGTTGTTTGGATGGG-TGGGAATTGTCA-TGTATC-ATGTATTTCGGTAAATGGCATGTATCGTGTAATGTCAG-|324 430| 116349 JM3'-GTGGTAGGAGGCACTTTAG-5' 164601 -AAATCCCTTCTCGTCCCCATGGATG&CCCCCCTCAG&TAGGGGTCCC^^ -TTTAGGGAAGAGCAGGGGTACCTACTGGGGGGAGTCTATCCCCAGGGAACTGGTGGTAGGAGGCACTTTAGTTATAGGGCGTGTTCTCACGATGAGAGGAGCGAGGCCCGGG- |431 _ 542| 116461 _ _1 • -^JrfjMjMjMgjltJdMJJ!B- 5'___165691 -ATAACACTTGGGGGTAGCTAAAGTGA&CTGTATCCGACATCTGGTTCCTACTTCAGGGTCATAAAGCCTAAATAGCCCACACGTTCCCCTTAAATAAGACATCACGATG-3' - -TATTGTGAACCCCCATCGATTTCACTTGACATAGGCTGTAGACCAAGGATGAAGTCCCAGTATTTCGGATTTATCGGGTGTGCAAGGGGAATTTATTCTGTAGTGCTAC-5f -I5 4 3 651| -TTGACCACCTG -§ftCTGG|G§fl.C end end tvorba nežádoucích sekundárních struktur (vlásenky), hlavně CG bohaté Programy na návrh PCR primem: Integrated Gene Technologies Gene Script Primer Design VizPrimer, CODEHOP, GeneFisher, Primer3, BioMath (kalkulace Tm) Komerční sety primem pro modelové organismy: Roche SABiosciences (Qiagen) SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI • dNTP (dTTP, d ATP, dCTP, dGTP), ~ 200 \M každý (50 - 500 \M) dUTP místo dTTP - jedna z metod prevence kontaminace DNA s dUTP - degradace uracil-N-glykosylázou přidána před zahájením reakce, inaktivace během prvního cyklu nelze použít s polymerázami s „proofreading" aktivitou (Pfu) • Templátová DNA Nemusí být známa kompletní sekvence, ale aspoň úseky pro návrh primem 1 - 10 ng bakteriální DNA 0.1-1 ng plasmidové DNA 1 - 200 ng genomové DNA 2\x\ cDNA/50 \x\ 18 SLOŽENÍ REAKČNÍ SMĚSI Mg2+ - nezbytné pro aktivitu polymeráz, zvyšují Tm koncentrace pro Taq polymerázy 1.5 mM (200 juM dNTPs) nutno optimalizovat (1-10 mM) nebo použít komerční pufr Reakční pufr složka koncentrace úloha síran amonný 5-30 mM usnadňuje rozvolnění DNA BSA 50-500 ng / 50 |J vazba inhibitorů (ze vzorku) DMSO 2-10% (v/v) snižuje Tm, usnadňuje annealing DMF < 10% (v/v) snižuje Tm, usnadňuje annealing formamid 1.25-10% (v/v) snižuje Tm, vyšší specifíta stabilizace polymerázy glycerol 0.01-0.1% (v/v) stabilizace polymerázy PEG6000 5-15% (v/v) stabilizace polymerázy SDS <0.01% zabraňuje agregaci polymerázy spermidin redukce nespecif. vazby polymerázy Triton X-100 0.01% (v/v) zabraňuje agregaci polymerázy močovina 1-1.5 M snižuje Tm, usnadňuje annealing REAKČNÍ PODMÍNKY • Denaturace 95 °C (92 - 98 °C), 15 s pro krátké fragmenty (do ~1 kb) 30 - 60 s pro dlouhé fragmenty delší časy - aktivace polymerázy, inaktivace glykosylázy Denaturace dvouvláknové DNA • Nasedání(hybridizace) primem 50 - 55 °C (podle Tm duplexu DNA:primer) OPTIMALIZACE! 20 - 30 s • Syntéza DNA 72 °C (70 - 74 °C) doba závislá na délce fragmentu (do 1 kb 30 - 60 s 6- 10 kb až 10 min) Počet cyklů: 25 - 35, vždy negativní kontrolu!!! faktor zmnožení 2n Cyklery 20 OPTIMALIZACE TEPLOTY NASEDÁNÍ PRIMERŮ Gradientova PCR - sada PCR s postupně se zvyšující teplotou nasedání primerů Gradientovo cyklery Kontrola všech parametrů PCR - qPCR - kalibrační křivka - účinnost reakce 21 TYPY PCR - NESTED PCR „Nested" PCR: Amplifikace, templát - genomová DNA. Reamplifikace - templátem je produkt první reakce. Nested PCR I Iry primer Nested primer Target Primář/ PCR product Nested PCR product karthikumarbt@kcetvnr.arg r 26 22 TYPY PCR -PCR-RFLP RFLP = Restriction fragment length polymorphism Gen etics Tech n iq u es: RFLP & PCR AP Biology-Unit 3 Normal [l-globin alien? 1^ M '|*175 bp*'*—201 lip —h|*— Largo IraflmOnt—nj Oďŕl Dtíŕl Odd iWc'l Sickíe-ccEl mulnnl jl-yiohiii ;i!lp|p _i * t_t, I ^^^^^M ., I |>-37* hp--|-— Large fragment —»| (a) OtfeJ restriction: tiles in normal arid sieVfc-ce 11 altelea ol [l-globin gone L.irqr r-.!i_:i:-|->:-- 2ti bp 175 bp 376 bp lb) Electrophoresis of reslricllori fragments from normal and sickíí-CĽll alleles Tií'lPl É 1h.ii1i 4 (in tihi\m bci«i 1m rfr Dri-i wrrth oneW AAAAAA degradace RNA íRNasa H) REVERZNÍ TRANSKRIPTÁZY enzym délka (kb) teplotní optimum citlivost "difficult templates" RNaseH modif. nucleotidy Transcriptor (Roche) 14 42-65 +++ +++ A A Expand (Roche) 14 42-50 ++ + N A AMV 12 42 (až 60) ++ + A A M-MuLV 10 37 + +(+) A A C. therm. 3 60-70 ++ +++ N A Tth 1 55-70 + + N A 26 PRIMERY PRO RT mRNA N BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTTTTTTT oligo(dT)18 plnodélková cDNA chyby - templáty s oligo(a) mRNA (m)RNA NBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA NVTTTTTTTTTTTTTTTTTT ukotvené oligo(dT)18 N BAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA plnodélková cDNA zabraňují nasedání na vnitřní části polyA vysoká specifita vhodné pro one-step RT-PCR genově specifické primery (m)RNA NNNNNN NNNNNN NNNNNN proporcionální přepis všech templátů n b aa a a a a a aa a a aa a aa a a aa vYsoká koncentrace - pro krátké templáty se sekundárními strukturami náhodné hexamery 27 KVALITA TEMPLÁTU (RNA) Analýza transkripce genů - izolace mRNA (smír 0.5 - 800 kb, většina 1.5-2 kb) Celková RNA - bandy 18S, 28S rRNA rostlinná RNA (A thaliana) 28 JEDNOKROKOVÁ RT-PCR Reverzní transkripce a PCR v jedné reakci Vysoce kvalitní RNA, množství do reakce musí být stanoveno empiricky (dle množství transkriptu a použitého enzymu) Sekvenčně specifické primery • RT při 50 - 60 °C • počáteční denaturace • PCR 29 KVANTITATIVNÍ RT-PCR Současná amplifikace a detekce produktu v přítomnosti fluorescenční látky • rychlejší (bez elfo) • spolehlivé výsledky, citlivá detekce http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://www.bio-equip.cn/ Exponenciální fáze: Nn = N0 * (E^,)" End-point fáze: Nn = N0 x (Evar)n SEKVENČNĚ NESPECIFICKÁ ANALÝZA Annealing phase ^ • . • Extension phase (I) ^TF1 ^ľ*- Extension phase (II) End of PCR cycle SYBR Green I • fluorescence výrazně roste po vazbě na dsDNA • signál při 530 nm, detekce na konci každého cyklu • relativně snadný návrh primem a optimalizace PCR • pozor na nespecifické produkty (dimery primem)!!! - vždy na konci melting analýza - detekce fluorescence za vyšší teploty • RT s oligo-dT nebo random nonamery, analýza více genů z jedné cDNA • hand-made mixy s hot start polymerázou (náročné na přesnost pipetování - reproducibilita) • komerční mixy - přidávají se pouze primery a templát • reakce v multiplikátech (nejméně triplikáty), biologické repliky Van der Velden et al., Leukemia 2003 31 SEKVENČNĚ SPECIFICKÁ ANALÝZA Využití oligonukleotidových sond komplementárních k PCR produktu Vysoce specifická analýza Fluorophore Quencher Prabe Reverse PGR primer Polymerization Amplification Assay Fluorescence Probe displacement and deavage Result PCR Products fluorescence Cleavage Products Hydrolytické próby • reportérovy fluorochrom v blízkosti zhášeče • během amplifikace - hydrolýza próby - oddělení fluorochromu a zhášeče - detekce fluorescence • během PCR exponenciálně roste množství volných fluorochromu Ta q M a n próby: Firemní knihovny Validované sety (primery + próba) pro kvantifikaci transkripce v modelových organismech (člověk, myš, krysa, primáti, Drosophila, Caenorhabditis elegans, Arabidopsis) 32 SEKVENČNE SPECIFICKÁ ANALÝZA Hybridizační próby • dvě próby, jedna značená (3') donorovým fluorochromem (fluorescein), druhá (5') akceptorovým fluorochromem, homologní k vnitřní části amplifikovaného úseku • po hybridizaci - próby v těsné blízkosti • fluorescein je excitován modrým svétllem -emise zeleného světla - emitované světlo excituje akceptorivý fluorochrom - detekce • amplifikace - může hybridizovat více prób - vyšší signál detekované fluorescence FRET - fluorescence resonance energy transfer Výhoda: próby jsou během PCR stabilní 33 METODY KVANTIFIKACE Ct (CP) - cyklus, ve kterém fluorescence stoupne nad detekční limit přístroje závisí na počáteční koncentraci templátu: nižší koncentrace templátu - vyšší Ct vyšší koncentrace templátu - nižší Ct D 10 20 30 4D 50 PCR tyt lei http://www.bio-equip.cn/ 34 ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE Koncentrace templátu je vyjádřena v absolutních číslech (kopie, \xgl\x\) KALIBRAČNÍ KŘIVKA - vzorky standardů o známé koncentraci 35 ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE KALIBRAČNÍ KŘIVKA - vzorky standardů o známé koncentraci 40 CT F 1=0,99971 R 2- 199942 Efficiency=1,04 M =-0,309 B=10,590 ,1 To 0 iiri 1tT2 n oň4 10"G Conc ähtration R - korelační koeficient (% dat v souladu se statistickou hypotézou) B - „intercepť, teoretické množství kopií detekovatelné v 1. cyklu M - sklon (směrnice) přímky, zásadní pro výpočet efektivity reakce Optimální parametry: M = -3.332 E = 1 (E = (10"1/M)-1) amplifikace 2 36 KALIBRAČNÍ KŘIVKA - OPTIMALIZACE PCR Kalibrační křivka s parametry blížícími se optimu - optimální podmínky PCR návrh primem teplota nasedání primem m? časy koncentrace primem Ľ y Cli Concentration Reaction efficiency (*) 0,96336 (*= 10A(-1/m) - 1) M -3,41298 B 24,42021 R Value 0,99963 RA2 Value 0,99926 37 ABSOLUTNÍ KVANTIFIKACE • vlastní analýzu je nutno provádět za stejných podmínek jako kalibrační křivku • koncentrace analyzovaných vzorků by měly ležet mezi mezními body kalibrační křivky • efektivita amplifikace standardů a analyzovaných vzorků musí být stejná!!!! 39 RELATIVNÍ KVANTIFIKACE Srovnání množství transkriptu mezi více vzorky relativně k transkripci referenčního genu REFERENČNÍ GEN - konstantní množství ve všech analyzovaných vzorcích amplifikován v separátní reakci nebo současně (multiplex PCR) Bez korekce na efektivitu reakce: R = 2AACt AACt = ACt (vzorek) - ACt (kontrola, kalibrátor) ACt (vzorek) = Ct(analyzovaný gen) - Ct(referenční gen) ACt (kontrola) = Ct(analyzovaný gen) - Ct(referenční gen) Korekce na efektivitu reakce: R = (Egenr?(9en) / (Eref.gen)ACt(^9en) Ct(kontrola) - Ct(vzorek) Ct(kontrola) - Ct(vzorek) 40 MULTIPLEX qPCR (A) VIC yellow (530nm excitation and 555nm emission) 10 15 20 Cycle 25 30 35 40 (C) ___=_-_ 10 20 25 Cycle 30 35 40 Bass et al., Acta Tropica 2008 Cy5 green (470nm excitation and 510 emission) FAM red (625nm excitation and 660 nm emission) 41 cDNA MICROARRAYS Clones in 96-well plates PCR amplification DNA purification RNA #1 RNA #2 I Reverse Transcription Label with Fluor Dyes ' Robotic printing Poly-L-Ly sine coated glass slide UV-crosslink blocking denature Hybridise probe to microarray Dichroic Barrier Photomultiplier tube PMT j- Red channel Barrier filter tureen channel > ! PMT — Pinhole Excitation lasers ■ 1 Laserl -*—I Lasen [ j Objective ^ Red probe Cf) Green probe X-Y stage ODO Et a b d e , o © © o © O " o e o o t K! Q O - « J b O O •v. SF o © c o Q u ■: «& O D O O O