Chromatografie
• cílem je separace sledovaného analytu od dalších látek ve vzorku, tak aby mohl být
následně jednoznačně identifikován a kvantifikován
• široké použití, např. základní výzkum, stanovení léčiv a drog v tělesných tekutinách, atd.
• princip: interakce složek směsi se dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi – pohyblivou
(mobilní fází) a nepohyblivou (stacionární fází)
• vzorek se po nanesení pohybuje společně s mobilní fází a jeho složky v různé míře
interagují s oběma fázemi
• látky, které se stacionární fází interagují silněji, jsou více zadržované (retence) a v koloně
setrvají déle
 retenční čas (doba pro výstup z kolony) je jedním ze sledovaných
 Parametrů
41
Sloupcová chromatografie
Postup:
- směs proteinů v roztoku prochází válcovou kolonou naplněnou
propustnou pevnou matricí ponořenou do rozpouštědla
- kolona se promývá
- různé proteiny mají různou míru afinity k náplni kolony a proto je lze
odděleně sbírat při výtoku z kolony
- podle typu náplně můžeme proteiny dělit např. podle velikosti nebo podle
schopnosti vázat se na určité chemické skupiny náplně
42
Tři druhy sloupcové chromatografie
iontoměničová: podle náboje, vazba mezi proteinem a náplní kolony závisí na
pH a iontové síle roztoku
gelová: podle velikosti proteinů
afinitní: náplň je opatřena molekulami, které specificky interagují s cílovým
proteinem (např. protilátka/antigen, enzym/substrát)
43
44
Chromatografie usnadňuje purifikaci značených proteinů
 „polyhistidinový tag“: aminokyselinový motiv složený z alespoň 6 zbytků histidinu, připojený obvykle na
N- nebo C-konec proteinů
 nukleotidové sekvence kódující His-tag se technikou rekombinantní DNA připojují k sekvenci genu, jehož
produkt má být purifikován
 rekombinantní konstrukt se přenese do E. coli nebo jiného expresního systému
 sklizení a lýze bakteriálních buněk
 nanesení buněčného extraktu na kolony s náplní obsahující dvojmocné ionty niklu nebo kobaltu, které
vážou polyhistidinové značky s vysokou afinitou
 po promytí kolony a eluci lze v jednom kroku purifikovat
 protein a relativně vysoké čistotě
45
Možnosti zapojení histidinové značky
46
Schéma a výsledek purifikačního postupu
47
Metody analýzy proteomu
 určuje úplný profil všech proteinů, které daný organismus
(buňka) vytváří za definovaných podmínek
 na rozdíl od genomu, který se neliší v buňkách téhož
organismu, je proteom (podobně jako transkriptom)
proměnlivý podle vnějších a vnitřních faktorů
48
Hlavní proteomické přístupy
 dvourozměrná elektroforéza
 definování proteinů rozdělených v gelu:
- určení sekvence aminokyselin
- westernový přenos
- štěpení eluovaných proteinů proteolytickým enzymem
a stanovení molekulové hmotnosti vzniklých
peptidů hmotnostní spektrometrií, srovnání
hmotnostních spekter s databázemi
49
Průtoková cytometrie
bioanalytická metoda založená na
interakcích mezi světlem a fluorochromy,
která kombinuje jevy rozptylu a odrazu
světla s detekcí fotonů emitovaných
aktivovaným fluorochromem
50
Průtoková cytometrie
 Hlavní výhoda: Umožňuje studium vlastností individuálních buněk v
buněčné populaci
 Co dokáže?
např.
 zhodnotit míru emitované fluorescence, která koreluje s mírou
přítomnosti sledovaného znaku
 frakcionovat buňky podle určitých vlastností, které korelují s
mírou fluorescence
 rozlišit živé buňky od mrtvých
 vyhodnotit více než 100 buněk za 1 minutu
51
Průtoková cytometrie – aplikace
 míra přítomnosti určitých antigenů (např. sledování diferenciace
buněk)
 míra přítomnosti DNA (např. sledování buněčného cyklu, apoptózy)
 velikost buněk, přítomnost granulí v cytoplazmě (determinace
buněčných typů ve směsích buněk)
 možno využít k frakcionaci buněk dle určitých vlastností (FACS Fluorescence-Activated
Cell Sorter)
52
Průtoková cytometrie
 Princip: Počítačové zpracování míry fluorescence jednotlivých buněk
 Předpoklad: Míra fluorescence odpovídá sledovanému parametru
(antigen, DNA…)
 Pojmy:
„Flow cytometry“ - měření určité vlastnosti buněk v průběhu
jejich toku přístrojem
„Flow sorting“ (Fluorescence-activated cell sorting FACS)
oddělování buněk podle jejich vlastností zjištěných v
průběhu průtokové cytometrie
53
Průtoková cytometrie – principy
 koncentrovaná suspenze buněk je opatřena fluorescenční
značkou specifickou pro cílovou molekulu (pro DNA propidium
jodid, pro protein - fluoreskující protilátka)
 buněčná suspenze je rozdělena na malé kapičky (každá z
nich obsahuje jednu buňku)
 jednotlivé kapičky jsou ozářeny laserovým paprskem –
dojde k ohybu a rozptylu světka a zároveň k excitaci
fluorochromu a emisi fluorescence
 měření míry fluorescence pro každou buňku (určuje míru
přítomnosti cílové molekuly)
 měření míry ohybu a rozptylu světla pro každou buňku
(určuje míru granulace cytoplazmy, velikost a tvar buňky)
 data jsou uložena ve formě datového souboru (lze je
opakovaně analyzovat a kombinovat („gatování) 54
Průtokový cytometr – technické složky
 optický systém: zdroj záření (různé typy laserů, UV lampa)
 systém fluidiky: pro transport analyzovaných částic do měřící komory
 výpočetní systém: analýza a archivace naměřených hodnot
 sortrovací modul (oddělení cílové populace z analyzovaného vzorku na
základě prováděných měření v reálném čase)
55
Průtokový cytometr – optický systém
 excitační optiku tvoří zdroj světla a optické členy, které transportují a
zaostřují paprsek do bodu měření
 obvykle laser, nejčastěji vzduchem chlazený argonový laser, který
vyzařuje světlo o vlnové délce 488 nm (výhoda: umožňuje excitaci
několika důležitých fluorochromů současně)
 může být více laserů, jejichž kombinace umožňuje excitovat více
fluorochromů a tak sledovat více parametrů současně
56
Průtokový cytometr – detekce a zpracování signálu
 současné vyhodnocení interakce záření s fluorescenční značkou
navázanou na protilátku a ohyb, odraz a absorpce světla (tzv.
„light scatter“)
 spojení imunochemického principu s fluorescenčním značením
umožňuje přesně definovat příslušný antigen
 jevy sledované pomocí „light scatter“ závisejí na fyzikálních
parametrech částice (buňky) – velikosti, vnitřní komplexitě a
hustotě obsahu (parametry jádra, membránových organel a
granulí)
 2 typy „light scatter“ – „forward scatter“ (FSC) a „side scatter“
(SSC)
57
„Forward scatter“ a „Side scatter“
 FSC – měření v rovině procházejícího světla, odpovídá
povrchu analyzované částice
 SSC – měření interference světla s hustými strukturami
uvnitř buňky (ohyb a odraz světelného paprsku)
 sloučením hodnot FSC a SCC do histogramu (osa x = FSC, osa
y = SSC) lze získat dvojrozměrné uspořádání analyzovaných
částic dle jejich velikosti a hustoty vnitřního obsahu
58
Frakcionace buněk - FACS
 Princip:
- podle míry fluorescence je každé
kapičce s jednotlivou buňkou
udělen proporcionální elektrický náboj
- kapičky procházejí prostorem mezi
dvěma elektrodami a
dochází k jejich frakcionaci podle
náboje
 Výhoda
- buňky nejsou průtokovou cytometrií
poškozeny - udržují si životaschopnost
- buňky nejsou kontaminovány - lze je
dále kultivovat
59
60
Biomedicínské aplikace průtokové cytometrie
 široké – významné postavení v imunologických a onkologických oborech
(často diagnostický standard)
 nejlepší uplatnění u tekutých tkání (krev, kostní dřeň, mozkomíšní mok,
bronchoalveolární laváž) méně u pevných tkání (lymfatických uzlin, solidních
nádorů)
Hematoonkologie
 imunofenotypizace buněk (kvalitativní a kvantitativní stanovení přítomnosti
specifických buněčných markerů (na povrchu, cytoplazmě i v jádře):
klasifikace onemocnění, odlišení nádorových buněk od zdravých, určení
prognózy, stanovení minimální residuální nemoci, atd.)
Imunologie
 sledování aktivity subpopulací lymfocytů (produkce cytokinů, fagocytóza,
oxidační vzplanutí)
61
Další aplikace průtokové cytometrie
 analýza buněčného cyklu
 vyšetření a sortrování chromozomů
 studium apoptózy (mitochondriální membránové potenciály,
aktivace apoptotických drah, degradace DNA)
 vyšetření viability spermií
 analýze exprese a fosforylace proteinů
62
Využití průtokové cytometrie pro analýzu buněčného cyklu
 Princip:
měření obsahu DNA jednotlivých buněk, který se v průběhu cyklu
periodicky mění
 Postup:
- obarvení DNA fluorescenčním
barvivem - propidium jodidem
- měření míry fluorescence emitované
jednotlivými buňkami
- počítačové zpracování dat a grafické
vyhodnocení
63