Studium interakcí protein-protein  Dvouhybridní systém  Ko-imunoprecipitace  Knihovna „Phage display“  „Pull-down assay“  „Far-western blotting“  Proteinová „microarray“ 64 Interaktom  soubor všech meziproteinových interakcí v dané buňce nebo organismu 65 Interactions between molecules are central to how cells detect and respond to signals and affect: Gene expression (transcription & translation) DNA replication, repair and recombination Signalling And many other processes.... Interactions are (mainly) mediated by many weak chemical bonds (van der Waals forces, hydrogen bonds, hydrophobic interactions) Accumulation of many bonds influences affinity and specificity of interactions  Dvouhybridní systém  Ko-imunoprecipitace  Knihovna „Phage display“  „Pull-down assay“  „Far-western blotting“  Proteinová „microarray“ Metody analýzy proteinových komplexů - Gelová filtrace, ultracentrifugace - TAP-tag (a jiné tagy) purifikace a MS analýza Metody analýzy protein-proteinových interakcí - ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace … - (kvasinkový) dvou-hybridní systém - BiFC, FRET, ko-lokalizace, ko-exprese - Flourescenční anisotropie, SPR, ITC … - ko-krystalizace, cryoEM … - databáze (interactom a komplexy …) - genetické metody (syntetická letalita, suprese) Literatura: Protein-protein interactions, Golemis & Adams, CSHL Press, 2005 doc. J. Paleček: Bi9040 Biologie kvasinek Dr. C. Hofr: Bi7230 Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii OdkomplexůkinterakcímAMK TEST Metody analýzy proteinových komplexů - Gelová filtrace (size exclusion chromatography) Tayloretal,MCB,2008 GF frakce lyzátu lidských buněk – podjednotky SMC5-6 komplexu identifikovány pomocí protilátek - Gelová filtrace (size exclusion chromatography) Metody analýzy proteinových komplexů Metody analýzy proteinových komplexů ultracentrifugace Cukerný/hustotní gradient Je třeba přesně vyvážit! Cukerný/hustotní gradient A. Hrubší pouze rozdělí na kompartmenty/organely (S – soluble, M – membranové frakce … jaderná …) B. Jemný - cukerný gradient Lee et al, Plant Cell Phys, 2004 Metody analýzy proteinových komplexů ultracentrifugace Metody analýzy proteinových komplexů - Gelová filtrace, ultracentrifugace - TAP-tag (jiné tagy a protilátky) purifikace a MS identifikace MS analýza SDS-PAGE nebo roztoku Tandem-affinity purification (vícestupňové – vyšší čistota) 1. calmodulin-binding (CBP) 2. TEV-proteasové místo (tobacco etch virus) 3. Protein A (váže IgG) Tagy (myc, HaloTag …) Zaintegrované v genomu (přirozená hladina proteinu, přirozený výskyt partnerů/komplexu …) Protein CBP A Puig et al, Methods, 2001 Pozor na kontaminace (např. chaperony) SDS-PAGE protilátky Sergeantetal,MCB,2005 Metody analýzy proteinových komplexů - Gelová filtrace, ultracentrifugace - TAP-tag (jiné tagy a protilátky) purifikace a MS analýza Tagy (a protilátky): Myc, FLAG, V5, S-tag, GFP, GST, Streptactin, MBP … Protein Tag - ko-imunoprecipitaci lze využít i pro analýzu proteinproteinových interakcí – uměle vnesené konstrukty (např. transfekce plasmidů do buněk) riziko nepřímých interakcí Y Y Hudsonetal,PLoSOne,2011 Nse4můžebýt součástí různých komplexů Protein A-protilátka Metody analýzy proteinových komplexů Pro stabilní komplexy – nelze použít pro charakterizaci struktury/architektury komplexů a pro analýzu slabých/přechodných interakcí Metody analýzy protein-proteinových interakcí - ko-imunoprecipitace, pull-down, ko-purifikace … - (kvasinkový) dvou-hybridní systém - BiFC, FRET, ko-lokalizace, ko-exprese - Flourescenční anisotropie, SPR, ITC … - ko-krystalizace, cryoEM … - databáze (interactom a komplexy …) - genetické metody (syntetická letalita, suprese) Ko-purifikace Silné interakce/komplexy – proteiny lze ko-exprimovat (může pomoci s jejich rozpustností) a následně ko-purifikovat Totalextract FT Solublefraction 25 35 40 55 70 1. Input 15 10 25 35 40 55 70 15 10 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. FT 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. Elution fractions – 10ml Elution fractions – 1,5ml Nse3 Nse1 Nse4 1. His-tag purification 2. Strep-tag purification Strep Strep 6xHis Nse4Nse3Nse1 Nse4 protein se samostatně exprimuje málo a je nerozpustný Ko-purifikace Silné interakce/komplexy – proteiny lze ko-exprimovat (může pomoci s jejich rozpustností) a následně ko-purifikovat 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 AU 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0% Buffer B 60.00 120.00 Min.Tenth A B C D Rack Pos.: Tube #:2 A 4 6 8 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 1 B 3 5 7 9 11 14 17 20 23 26 29 32 35 38 41 Fractions 15 25 35 40 55 70 input 29A 30A 31A 32A 33A 34A 35A 36A 37A 38A 39A 40A 41A 42A 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B 8B 9B 10B 11B 12B Nse1-3-4 Nse1-3 Nse1 Nse1,-3,-4 Nse1,-3 Nse1 Gelová filtrace Nse3 Nse1 Nse4 Hledání neznámých proteinů asociujících se studovaným proteinem  Ko-imunoprecipitace 76 „Protein tagging“  „tag“ = visačka  „Protein tagging“ znamená označení proteinu připojením zřetelné  značky  obvykle se provádí geneticky – sekvence DNA je opatřena  segmentem kódujícím „tag“  sekvence musí být klonována ve vhodném vektoru a přenesena do  vhodné hostitelské buňky, která bude syntetizovat označený  protein  značku lze využít např. pro účinnou purifikaci proteinu nebo  imunoprecipitační experimenty 77 Ověření interakcí mezi dvěma proteiny 78 Funkci značky mohou mít nejen krátké peptidy i celé proteiny 79 Protein A – afinita k protilátkám Glutathion S transferáza (GST) – afinita k tripeptidu glutathionu Protein vážoucí maltózu (MBP) – afinita k maltóze a polymeru maltózy (amylóze) Green fluorescent protein (GFP) - autofluorescence  „FLAG tag“  Krátký peptid (AspTyrLysAspAspAspAspLys), který  je rozeznáván specifickou protilátkou, která je  komerčně dostupná (Immunex Corp)  Tato protilátka může být imobilizována na koloně  pro chromatografickou purifikaci příslušného  proteinu.  „Strep tag“  Peptid o velikosti 10 aminokyselin, který napodobuje  trojrozměrnou strukturu biotinu  Má afinitu k avidinu nebo streptavidinu TEST Nse4 protein se dobře exprimuje (foto-radioaktivita) PROMEGA – in vitro TNT systém methionin S35 (pouze 2 partneři) Pull-down (ko-imunoprecipitace) Silné interakce oba proteiny v TNT Slabé interakce bait v přebytku (bakt. exprese) a prey v TNT Palecek et al, JBC, 2006 PAGE PAGE => Western (anti-GST) Charakterizace interakcí - domény Sergeant et al, MCB, 2005 Doyle et al, Mol Cell, 2010 Ubírat či přidávat Charakterizace interakcí – peptidové mapování Podobně jako při ELISA jamky jsou potažené streptavidinem peptidy se přes biotin ukotví Lze mapovat epitop pro protilátky (vazbu) Peptidy jsou na N-konci biotinylované Charakterizace interakcí – peptidové mapování Podobně jako při ELISA jamky jsou potažené streptavidinem peptidy se přes biotin ukotví Charakterizace interakcí – peptidové mapování Nse4 peptidy Charakterizace interakcí – „alanin scan“ Zjistili jsme jak interaguje Nse4 s Nse3 na detailní úrovni